Name: in situ monitoring of transiently formed molecular chaperone assemblies in bacteria, yeast, and human cells
Uploaded: 2019-09-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells at JoVE.com

NBN은 빅토리아 주 정부와 호주 정부의 자금으로 모나시 대학 의학 간호 및 건강 과학 학부의 특별 모집 보조금에 의해 지원됩니다. 우리는 베른트 부카우 (ZMBH, 하이델베르크 대학, 독일) 및 Harm H. Kampinga (세포 및 시스템 학과, 그로닝겐 대학, 네덜란드) 시약의 귀중한 지원과 공유에 감사드립니다, 홀거 로렌츠 (ZMBH) 이미징 시설, 하이델베르크 대학, 독일) 공초점 현미경 및 이미지 처리와 그의 지원에 대한, 클레어 허스트 (ARMI, 모나시 대학, 호주) 원고의 비판적 독서.

1. 헬라 세포 준비
<ol><li>다음 자료를 준비: PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4,1.8 mM KH2PO4),pH 7.4; DMEM, 10% FCS와 1% 펜-스트렙으로 보충; PBS에서 4% 파라포름알데히드; PBS에서 0.5 % 트리톤 - X100; TBS-T (150 mM NaCl, 20 mM 트리스, 0.05% 트웬), pH 7.4; 0.0001 % 멸균 폴리 - L-리신 용액; 10 웰 진단 슬라이드; 습한 챔버; 티슈 페이퍼; 그리고 코플린 슬라이드 염색 항아리. 참고:</s...

<ol>
	<li>Soderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation.">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).</li><li>Weibrecht, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+ligation+assays:+a+recent+addition+to+the+proteomics+toolbox.">Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox.</a> Expert Review of Proteomics. 7 (3), 401-409 (2010).</li><li>Mayer, M. P., Gierasch, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+structural+and+mechanistic+aspects+of+Hsp70+molecular+chaperones.">Recent advances in the structural and mechanistic aspects of Hsp70 molecular chaperones.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (6), 2085-2097 (2019).</li><li>Kampinga, H. H., Craig, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HSP70+chaperone+machinery:+J+proteins+as+drivers+of+functional+specificity.">The HSP70 chaperone machinery: J proteins as drivers of functional specificity.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (8), 579-592 (2010).</li><li>Nillegoda, N. B., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metazoan+Hsp70-based+protein+disaggregases:+emergence+and+mechanisms.">Metazoan Hsp70-based protein disaggregases: emergence and mechanisms.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 2, (2015).</li><li>Bracher, A., Verghese, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nucleotide+exchange+factors+of+Hsp70+molecular+chaperones.">The nucleotide exchange factors of Hsp70 molecular chaperones.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 2, (2015).</li><li>Nillegoda, N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+HSP70+co-chaperone+complex+unlocks+metazoan+protein+disaggregation.">Crucial HSP70 co-chaperone complex unlocks metazoan protein disaggregation.</a> Nature. 524 (7564), 247-251 (2015).</li><li>Nillegoda, N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+an+intricate+J-protein+network+driving+protein+disaggregation+in+eukaryotes.">Evolution of an intricate J-protein network driving protein disaggregation in eukaryotes.</a> Elife. 6, (2017).</li><li>Kirstein, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+properties+of+the+disaggregase+function+of+J-proteins+and+Hsc70+in+Caenorhabditis+elegans+stress+and+aging.">In vivo properties of the disaggregase function of J-proteins and Hsc70 in Caenorhabditis elegans stress and aging.</a> Aging Cell. 16 (6), 1414-1424 (2017).</li><li>Nillegoda, N. B., Wentink, A. S., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Disaggregation+in+multicellular+organisms.">Protein Disaggregation in multicellular organisms.</a> Trends in Biochemical Sciences. 43 (4), 285-300 (2018).</li><li>Chae, C., Sharma, S., Hoskins, J. R., Wickner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CbpA,+a+DnaJ+homolog,+is+a+DnaK+co-chaperone,+and+its+activity+is+modulated+by+CbpM.">CbpA, a DnaJ homolog, is a DnaK co-chaperone, and its activity is modulated by CbpM.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (32), 33147-33153 (2004).</li><li>Kityk, R., Kopp, J., Mayer, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Mechanism+of+J-domain-Triggered+ATP+Hydrolysis+by+Hsp70+Chaperones.">Molecular Mechanism of J-domain-Triggered ATP Hydrolysis by Hsp70 Chaperones.</a> Molecular Cell. 69 (2), 227-237 (2018).</li><li>S&#246;derberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+proteins+and+their+interactions+in+cells+and+tissues+using+the+in+situ+proximity+ligation+assay.">Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay.</a> Methods. 45 (3), 227-232 (2008).</li><li>Benschop, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+consensus+of+core+protein+complex+compositions+for+Saccharomyces+cerevisiae.">A consensus of core protein complex compositions for Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular Cell. 38 (6), 916-928 (2010).</li><li>Jung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+RNA-protein+interactions+in+situ+using+modified-MTRIPs+and+proximity+ligation.">Quantifying RNA-protein interactions in situ using modified-MTRIPs and proximity ligation.</a> Nucleic Acids Research. 41 (1), (2013).</li><li>Mocanu, M. M., V&#225;radi, T., Sz&#246;llosi, J., Nagy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+(FRET)+and+proximity+ligation+assay+(PLA).">Comparative analysis of fluorescence resonance energy transfer (FRET) and proximity ligation assay (PLA).</a> Proteomics. 11 (10), 2063-2070 (2011).</li><li>Sekar, R. B., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+resonance+energy+transfer+(FRET)+microscopy+imaging+of+live+cell+protein+localizations.">Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations.</a> Journal of Cell Biology. 160 (5), 629-633 (2003).</li><li>Deriziotis, P., Graham, S. A., Estruch, S. B., Fisher, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+protein-protein+interactions+in+live+cells+using+bioluminescence+resonance+energy+transfer.">Investigating protein-protein interactions in live cells using bioluminescence resonance energy transfer.</a> Journal of Visualized Experiments. 87, (2014).</li><li>Nagy, P., Sz&#246;llosi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+or+no+proximity:+that+is+the+question+&#8211;+but+the+answer+is+more+complex.">Proximity or no proximity: that is the question &#8211; but the answer is more complex.</a> Cytometry. 75 (10), 813-815 (2009).</li><li>Hoetelmans, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+acetone,+methanol,+or+paraformaldehyde+on+cellular+structure,+visualized+by+reflection+contrast+microscopy+and+transmission+and+scanning+electron+microscopy.">Effects of acetone, methanol, or paraformaldehyde on cellular structure, visualized by reflection contrast microscopy and transmission and scanning electron microscopy.</a> Applied Immunohistochemistry &amp; Molecular Morphology. 9 (4), 346-351 (2001).</li><li>Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunolabeling+artifacts+and+the+need+for+live-cell+imaging.">Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging.</a> Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).</li><li>Stadler, C., Skogs, M., Brismar, H., Uhlen, M., Lundberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+fixation+protocol+for+proteome-wide+immunofluorescence+localization+studies.">A single fixation protocol for proteome-wide immunofluorescence localization studies.</a> Journal of Proteomics. 73 (6), 1067-1078 (2010).</li><li>Goldenthal, K. L., Hedman, K., Chen, J. W., August, J. T., Willingham, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postfixation+detergent+treatment+for+immunofluorescence+suppresses+localization+of+some+integral+membrane+proteins.">Postfixation detergent treatment for immunofluorescence suppresses localization of some integral membrane proteins.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 33 (8), 813-820 (1985).</li><li>Schrader, M., Almeida, M., Grille, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postfixation+detergent+treatment+liberates+the+membrane+modelling+protein+Pex11beta+from+peroxisomal+membranes.">Postfixation detergent treatment liberates the membrane modelling protein Pex11beta from peroxisomal membranes.</a> Histochemistry &amp; Cell Biology. 138 (3), 541-547 (2012).</li><li>Willingham, M. C., Yamada, S. S., Pastan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+antibody+localization+of+alpha2-macroglobulin+in+membrane-limited+vesicles+in+cultured+cells.">Ultrastructural antibody localization of alpha2-macroglobulin in membrane-limited vesicles in cultured cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (9), 4359-4363 (1978).</li><li>Aguilar-Uscanga, B., Francois, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+of+the+yeast+cell+wall+composition+and+structure+in+response+to+growth+conditions+and+mode+of+cultivation.">A study of the yeast cell wall composition and structure in response to growth conditions and mode of cultivation.</a> Letters in Applied Microbiology. 37 (3), 268-274 (2003).</li><li>Romaniuk, J. A., Cegelski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+cell+wall+composition+and+the+influence+of+antibiotics+by+cell-wall+and+whole-cell+NMR.">Bacterial cell wall composition and the influence of antibiotics by cell-wall and whole-cell NMR.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370, 1679 (2015).</li><li>Salazar, O., Asenjo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+lysis+of+microbial+cells.">Enzymatic lysis of microbial cells.</a> Biotechnology Letters. 29 (7), 985-994 (2007).</li><li>Cunningham, A. F., Spreadbury, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterial+stationary+phase+induced+by+low+oxygen+tension:+cell+wall+thickening+and+localization+of+the+16-kilodalton+alpha-crystallin+homolog.">Mycobacterial stationary phase induced by low oxygen tension: cell wall thickening and localization of the 16-kilodalton alpha-crystallin homolog.</a> Journal of Bacteriology. 180 (4), 801-808 (1998).</li><li>Werner-Washburne, M., Braun, E., Johnston, G. C., Singer, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stationary+phase+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Stationary phase in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiological Reviews. 57 (2), 383-401 (1993).</li></ol>

공동 면역 침전 및 공동 국소화 기반 접근법은 단백질 조립을 특성화하는 오랜 방법으로 사용되어 왔다. 과도하게 형성된 특정 샤페론 복합체의 검출은 이러한 전통적인 방법의 주요 과제이며, 그 결과, 이전의 발견은 주로 질적 해석으로 제한된다. 세포 용해 기지를 둔 공동 면역 침전 기술은 수시로 단백질 단백질 상호 작용을 안정시키기 위하여 가교를 요구합니다. 세포 용해는 일시적으로 형?...

세포 상호 작용에 대한 우리의 불완전한 이해로 인해 광대한 양의 유전체 정보는 해석할 수 없습니다. 화학적 가교 및 단백질 공동 국소화가 없는 단백질 공동 면역 침전과 같은 기존의 단백질-단백질 상호 작용 검출 방법론은 널리 사용되지만 다양한 단점을 제기합니다. 주요 단점 중 일부는 상호 작용의 가난한 정량화 및 비 네이티브 바인딩 이벤트의 잠재적인 도입을 포함 합니다. 비교에서, 새로운 근접 기반 기술은 세포에서 단백질 상호 작용을 포착하기위한 대안과 강력한 접근 방식을 제공합니다. 근접 결찰 분석(PLA)1은 현재 독점 키트로 사용할 수 있으며, 상호 작용하는 하위 단위의 근접에 기초하여 단백질 복합체를 구체적으로 표적화하는 항체를 사용합니다.
PLA는 표적 단백질 복합체의 표면에 작은 DNA 태그(PLA 프로브)를 가진 1차 및 이차 항체로 구성된스캐폴드의 형성에 의해 개시된다(도 1, 단계 1-3). 다음으로, DNA 태그의 근접에 의해 결정되며, 원형 DNA 분자는 커넥터 올리고뉴클레오티드를 가진 혼성화를 통해 생성된다(도1,단계 4). 원형 DNA의 형성은 DNA 결찰 단계에 의해 완료된다. DNA의 새로 형성된 원형 조각은 공액된 올리고뉴클레오티드 태그 중 하나에 의해 프라이밍된 후속 압연 원형 증폭(RCA) 기반 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 위한 템플릿역할을 한다. 이는 항체 스캐폴드를 통해 단백질 복합체에 부착된 단일 가선 형DNA 분자를 생성한다(도 1, 단계 6). 결합성 DNA 분자는 증폭된 DNA에 걸쳐 흩어져 있는 다중 고유 서열로 혼성화하는 형광표지된올리고뉴클레오티드를 사용하여 가시화된다(도 1, 단계 7)2. 생성된 PLA 신호는 형광점(도 1,단계 7)으로 나타나며, 세포 내의 표적 단백질 복합체의 위치에 대응한다. 그 결과, 분석은 높은 공간 정확도로 단백질 복합체를 검출할 수 있었습니다. 이 기술은 단순히 단백질 상호 작용을 포착하는 것뿐만 아니라 고감도1,2를가진 단백질에 대한 단일 분자 또는 단백질 변형을 검출하는 데에도 사용될 수 있다.
Hsp70은 다양한 하우스키핑 및 스트레스 관련 기능에 참여하여 세포 단백질 항상성을 유지하는 데 근본적으로 중요한 매우 다재다능한 샤페론 시스템을 형성합니다. Hsp70 샤페론 시스템의 하우스키핑 활동은 드 노보 단백질 폴딩, 세포막에 걸친 단백질 전좌, 단백질 복합체의 조립 및 분해, 단백질 활성 조절 및 다양한 단백질 폴딩 연결/ 품질 관리 기계3. 동일한 샤페론 시스템은 또한 잘못 접히고/ 전개된 단백질을 다시 접고, 단백질 응집을 방지하고, 단백질 분해를 촉진하고, 세포 단백질을 분해하여 말기 잘못 접히지/손상된 단백질을 분해하여 세포 복구를 용이하게 합니다. proteotoxic 스트레스4,5. 이러한 기능적 다양성을 달성하기 위해 Hsp70 샤페론은 JDP 제품군과 뉴클레오티드 교환 인자(NEF)의 공동 샤페론과 협력하여 Hsp70의 ATP 의존적 알로스테릭 제어를 미세 조정하여 기질 결합 및 방출3, 6. 또한 JDP 코샤페론은 이 다재다능한 샤페론 시스템을 위한 기판을 선택하는 데 중요한 역할을 합니다. 이 가족의 구성원은 프로토 타입 JDP, 대장균 DnaJ에 자신의 구조적 상동성에 따라 세 가지 클래스 (A, B 및 C)로 세분화된다. 클래스 A JDPs는 Hsp70, 글리신 페닐알라닌 리치 영역, 아연 핑거상 영역(ZFLR) 및 2개의 β 배럴 도메인으로 구성된 기질 결합 영역및 C-말단 이화 도메인과 상호 작용하는 N-말단 J 도메인을 포함합니다. N 말단 J 도메인과 글리신 페닐알라닌 부유 한 영역을 가진 JDP, 하지만 ZFLR 부족, 클래스 B에 빠진다. 일반적으로 이 두 클래스의 구성원은 보호 기능에 관여합니다. J-도메인 4만 공유하는 JDP가 포함된 캐치올 클래스C에 속하는 회원은 Hsp70s를 모집하여 다양한 비보호자 기능을 수행합니다. Hsp70 시스템의 교환 가능한 기판 인식 "어댑터"로서 JDP의 중요한 역할은 진화 하는 동안 가족 구성원의 확장에 의해 반영 됩니다. 예를 들어, 인간은 42 개이상의 별개의 JDP 회원 4. 이러한 JDP는 단량체, 호모 및 / 또는 호모/ 헤테로 올리고머로 기능 4,5. 최근, 클래스 A 사이의 일시적인 복합형성을 통한 기능적 협력(예를 들어, H. Sapiens DNAJA2; S. 세레비시아Ydj1) 및 B급(예를 들어, 에이치사피엔스 DNAJB1; S. 세레비시아Sis1) 진핵 JDPs는 시험관 내 무정형 단백질 응집체의 효율적인인식을 촉진시키는 것으로 보고되었다 7,8. 이러한 혼합 클래스 JDP 복합체는 아마도 Hsp70- 및 Hsp70+Hsp100 기반 단백질 분해제 7,8,9의 형성을 용이하게 하기 위해 응집된 단백질의 표면에 조립됩니다. 10.진핵 세포에서 이러한 과도적으로 형성된 혼합형 JDP 복합체의 존재를 뒷받침하는중요한 증거는 PLA 8을 구비하였다.
PLA는 주로 포유류 세포에서 메타조아에서 단백질 상호 작용을 평가하기 위해 점점 더 많이 사용됩니다. 여기에서, 우리는 신진 효모 S. cerevisiae 및 박테리아 대장균과 같은 진핵과 원핵 세포 단세포 유기체에 있는 일시적으로 형성된 chaperone 복합체를 감시하기 위하여 이 기술의 성공적인 확장을 보고합니다. 중요한 것은, 이 확장은 인간과 동물 세포를 감염시키는 미생물을 검출하고 분석하기 위한 PLA의 잠재적인 사용을 강조합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>37% Formaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>103999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-DNAJA2 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab157216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-DNAJB1 Antibody</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ADI-SPA-450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-DnaK antibody</td>
			<td>In house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mCherry antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab125096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Sis1 Antibody</td>
			<td>Cosmo Bio Corp</td>
			<td>COP-080051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Ydj1 antibody</td>
			<td>StressMarq Biosciences</td>
			<td>&#160;SMC-150,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-YFP antibody</td>
			<td>In house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin slide-staining jar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diagnostic slides</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>1216530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink In Situ Detection Reagents Orange</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink In Situ Mounting Medium + DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink In Situ Wash Buffers, Fluorescence</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>62971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P47-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorbitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>25300096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymolase 100T / / Lyticase</td>
			<td>United States Biological</td>
			<td>Z1004</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ monitoring of transiently formed molecular chaperone assemblies in bacteria, yeast, and human cells

J 도메인 단백질 (JDPs)은 진핵 세포에서 가장 크고 가장 다양한 코 샤페론 패밀리를 형성합니다. 최근 연구 결과에 따르면 JDP 패밀리의 특정 구성원은 진핵생물에서 일시적인 이종 복합체를 형성하여 70kDa 열 충격 단백질(Hsp70) 샤페론 계 단백질 다이그레그가스에 대한 기질 선택을 미세 조정할 수 있음을 보여줍니다. JDP 복합체는 급성/만성 스트레스 유발 응집 단백질을 표적으로 하고 아마도 단백질 응집체의 표면에 다중 Hsp70s를 모집하여 분리증을 조립하는 것을 돕습니다. 이러한 물리적으로 상호 작용하는 JDP에 의해 형성된 단백질 품질 관리(PQC) 네트워크의 범위는 생체 내에서 크게 특성화되지 않은 채로 남아 있다. 여기서, 우리는 진핵 세포의 뚜렷한 세포 구획에서 이러한 과도하게 형성된 샤페론 복합체를 강력하게 포획할 수 있는 근접 결찰 분석법(PLA)이라는 이름의 현장 단백질 상호작용 분석법에 근거한 현미경 검사법을 기술한다. 우리의 일은 인간 세포에서 효모(Saccharomyces cerevisiae)와박테리아(대장균)로PLA의 고용을 확장하여 일시적으로 형성 된 단백질 어셈블리의 역학을 모니터링하는 중요한 도구가되었습니다. 시핵 세포와 진핵 세포.

정제된 단백질을 이용한 당사의 이전 시험관 내 연구는 인간 클래스 A 및 클래스 B JDP의 하위 집합이 광범위한 응집된 단백질을 효율적으로 표적으로 하고 Hsp70 기반의 조립을 용이하게 하기 위해 일시적인 혼합 클래스 JDP 복합체를 형성한다는 것을 밝혀냈습니다. 단백질분리7. 우리는 혼성 클래스 (A +B) JDP 복합체가 인간 자궁 경부암 세포 (HeLa)에서 발생하는지 여부를 결정하기 ?...

Watch this Scientific Journal Video about In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells at JoVE.com

In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells

Cognate J-도메인 단백질은 Hsp70 샤페론과 협력하여 단백질 폴딩에서 분해에 이르는 수많은 생물학적 과정을 지원합니다. 여기서, 우리는 세균, 효모 및 인간 세포에서 이러한 과도하게 형성된 샤페론 기계의 모니터링을 허용하는 내부 근접 결찰 분석에 대해 설명합니다.

박테리아, 효모 및 인간 세포에서 일시적으로 형성된 분자 샤페론 어셈블리의 시투 모니터링

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the ...

이 방법은 박테리아와 효모 와 같은 유기체및 다른 세포 모형에서 일시적인 단백질 상호 작용을 포착합니다. 여기서 우리는 세포 프로테오스타시스에 관여하는 과도하게 형성된 특정 샤페론 복합체를 모니터링합니다. 이 기술의 주요 장점은 대핵 세포및 진핵 세포에서 단백질 어셈블리의 역학 및 세포 소세포 지역화에 대한 정보를 생성하는 능력입니다.박테리아와 효모 같이 단세포 유기체에 있는 이 기술의 적응은, 연구원이 미생물 감염과 관련있는 질병을 조사하기 위하여 강력한 공구로 그것을 이용하는 것을 허용합니다. 이 기술은 프로토콜의 샘플 준비 단계에서 조건을 단순히 변경하여 거의 모든 유기체에서 단백질 상호 작용을 분석하기 위하여 잠재적으로 이용될 수 있었습니다. 면역히스토화학, 면역형광, ELISA 또는 면역성수량중 하나에서 특이적이고 시험된 양질의 항체를 선택하는 것이 중요합니다.폴리 L-Lysine와 함께 10웰 진단 슬라이드를 사전 치료하는 것으로 시작합니다. 멸균 및 필터링 된 0.0001 % 폴리 L-Lysine의 100 마이크로 리터를 각 우물에 추가하고 멸균 라미나르 플로우 후드에서 30 분 동안 슬라이드를 배양합니다. 그런 다음, 여분의 폴리 L-리신을 제거하기 위해 멸균 물 50 마이크로 리터로 각각 잘 씻으시다.세포 유형에 따라 약 15, 000 세포를 잘 추가하고, 멸균 습한 인큐베이터에서 세포를 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소로 60~80%의 수렴성으로 성장시다. 24시간 후, 각 웰의 가장자리에 티슈 페이퍼를 배치하여 성장 배지를 제거하고, PBS의 50 마이크로리터로 세포를 세 번 세척한다. 그런 다음 PBS에 새로 준비된 4%파라포름알데히드50마이크로리터를 각 우물에 추가하고 실온에서 10분 동안 슬라이드를 배양하여 세포를 수정합니다.고정 후 PBS로 슬라이드 염색 항아리에 슬라이드를 잠급하여 슬라이드를 세 번 씻으십시오. 부착된 세포의 막을 투과화하기 위해 PBS에서 0.5%트리톤-X100의 100밀리리터에 슬라이드를 잠수하고 실온에서 10분 동안 세포를 배양합니다. 그런 다음 TBS-T에서 슬라이드를 세 번 씻습니다.마지막 세척 후 티슈 페이퍼로 과도한 버퍼를 제거합니다. S.cerevisiae 세포를 원고 의 방향에 따라 재배하고 희석한 다음 50 밀리리터 원심분리기 튜브와 펠릿을 3분 동안 665배 g에서 원심분리로 옮긴다. 상체를 제거하고 신선한 배지의 다섯 밀리리터에서 세포를 다시 중단합니다.그런 다음 최종 농도4%를 위해 37%의 포름알데히드의 550 마이크로리터를 추가하고 세포를 고치기 위해 실온에서 배양을 15분 동안 배양합니다. 인큐베이션 후, 셀펠릿, 상류제를 제거하고, 세척 버퍼로 새로 준비된 4%파라포름알데히드의 1밀리리터로 펠릿을 재보펜한다. 45 분 동안 실온에서 세포를 배양.한편, 각 웰에 0.0001%의 폴리-L-Lysine 용액의 100마이크로리터를 추가하고 실온에서 30분 동안 슬라이드를 배양하여 진단 슬라이드를 준비합니다. 그런 다음 여분의 폴리 L-리신을 초순수물로 씻어내고 슬라이드를 공기 건조하게 합니다. 인큐베이션 단계 후, 원심 분리에 의해 세척 버퍼 의 1 밀리리터로 세포를 두 번 세척.상체를 제거하고 세척 버퍼에서 셀을 다시 중단합니다. 마지막 세척 후 세포를 펠렛, 상체를 제거하고 1.2 어어 소르비톨을 포함하는 세척 버퍼의 1 밀리리터에서 세포를 다시 중단. 세포 벽을 소화하기 위해 세포를 다시 펠릿하고 갓 준비 된 Lyticase 용액의 250 마이크로 리터에서 세포를 다시 중단하십시오.부드러운 흔들림으로 15 분 동안 섭씨 30도에서 세포를 배양하십시오. 소화 단계 후, 세척 버퍼에서 세포를 세 번 세척하고 1.2 어어 소르비톨을 포함하는 세척 버퍼의 250 마이크로 리터에서 세포를 다시 중단합니다. 각 폴리 L-Lysine 코팅웰에 다시 중단된 세포의 20 마이크로리터를 추가하고 고정 및 투과 된 세포가 30 분 동안 부착할 수 있도록 합니다.50 마이크로리터의 세척 버퍼로 우물을 세 번 세척하여 비 부착 세포를 제거하고 근접 결찰 분석으로 진행합니다. 근접 계각 분석, 또는 PLA 프로토콜을 시작하여 각 우물에 블로킹 버퍼를 첨가하고 섭씨 37도에서 30분 동안 습한 챔버에서 슬라이드를 배양한다. 각 우물의 가장자리에 티슈 페이퍼를 배치하여 차단 버퍼를 제거하고, 세척 버퍼 A.Next의 100 밀리리터에 세포를 두 번 세척하고, 각 우물에 1 차 항체 용액의 40 마이크로리터를 추가하고 습한 챔버에서 섭씨 37도에서 60 분 동안 슬라이드를 배양합니다.1차 항체 용액을 제거하고 세척 버퍼 A.에서 슬라이드를 두 번 세척한 후, 각 웰에 이차 항체 용액의 40 마이크로리터를 추가하고 습한 챔버에서 섭씨 37도에서 60분 동안 슬라이드를 배양한다. 그런 다음 용액을 제거하고 세척 버퍼 A.Then에서 슬라이드를 두 번 세척하십시오.다음 커넥터 올리고뉴클레오티드와 DNA 리그가 들어있는 DNA 결찰 혼합물의 40 마이크로리터를 각각 양호한 챔버에 넣고 30분 동안 습한 챔버에서 슬라이드를 배양한다. 인큐베이션 후, 리설주 혼합물을 제거하고 세척 버퍼 A.40 마이크로리터를 DNA 폴리머라제와 형광폴리티드를 각각 양호에 첨가하고, 습한 챔버에서 100분 동안 배양한다.증폭 혼합물을 제거하고 세척당 10 분 동안 세척 버퍼 B의 100 밀리리터로 슬라이드를 세척합니다. 그런 다음 슬라이드를 세척 버퍼 B의 100 밀리리터로 세척하여 초순수 수에서 1~100을 희석시 세척합니다. 잘 당 DAPI 함유 마운팅 매체20 마이크로리터를 추가합니다.슬라이드의 우물을 커버 슬립으로 덮고 매니큐어로 밀봉하십시오. 이 프로토콜은 HeLa, S.cerevisiae 및 E.coli 세포에서 구별되는 J 도메인 단백질과 Hsp70 샤페론 및 J 도메인 단백질 사이에 형성된 일시적인 샤페론 어셈블리를 성공적으로 모니터링하는 데 사용되었습니다. 인간 클래스 A 및 클래스 B J-도메인 단백질은 매우 구체적인 1 차적인 항체로 표적으로 했다.각각의 적색 형광 펑크는 HeLa 세포에 있는 2개의 명백한 J 도메인 단백질 사이에서 형성된 단백질 복합체를 나타냅니다. 유사한 혼합급 J-도메인 단백질 복합체는 단세포 진핵생물 S.cerevisiae, 또는 제빵사의 효모에서 관찰됩니다. PLA에서 생성된 형광 펑크 중 일부는 작은 세포 크기로 인해 개별 적인 초점으로 해결하기가 더 어려웠습니다.클래스 A와 B J 도메인 단백질 사이의 복잡한 형성은 정제 된 단백질과 수행 생화학 연구와 일치하는 E.coli 세포에서 관찰되지 않았다. 그러나 J-도메인 단백질과 Hsp70 샤페론을 포함하는 다른 샤페론 어셈블리는 PLA 프로토콜을 사용하여 포착되었다. 그렇지 않으면 완전한 PLA 반응에서 상호 작용하는 J-도메인 단백질 또는 샤페론 중 하나에 대한 1 차항체가 부족한 기술적 제어는 세포에서 형광 천티 형성을 거의 또는 전혀 나타내지 않았으며, 이는 거짓 양성 신호 증폭의 부족을 나타낸다.근접 결찰 분석기를 사용하여 신뢰할 수 있는 결과를 얻으려면 사용되는 항체가 충분한 품질인지 미리 확인하십시오. 또한 세포벽을 함유한 세포의 과다 소화를 피하는 예방 조치를 취하십시오.

Research

JoVE Journal

Biology

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

효모에서 모니터링 Mitophagy을위한 형광 현미경 분석 Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

연구

생물학

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

갑각류와 장기 치명적인 독성 시험 Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

GFP와 Retroviral 벡터를 사용하여 유도 Pluripotent 줄기 세포 (iPSCs)로 인간 체세포를 프로그래밍

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

형광을 사용하여 mRNA의 분자의 시각화 및 분석<em&gt; 제자리에서</em에서&gt; 하이브리드<em&gt; 사카 cerevisiae의</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

센다이 바이러스와 인간의 체세포의 효율적인 생성 인간 유도 만능 줄기 세포

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

정량적 RT-PCR에 의해 개별 인간 배아 줄기 세포를 프로파일 링

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

고해상도 시간 경과 이미징 및 생활 인간 제대 정맥 내피 세포의 미세 소관 역학의 자동 분석

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

분열 효모의 Cytokinetic 이벤트의 시공간 분석

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

동적 세포 돌출부에서 소프트웨어를 이용한 단백질 농도 추적을위한 그래픽 사용자 인터페이스

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

A Simple Fluorescence-based Reporter Assay to Identify Cellular Components Required for Ricin Toxin A Chain (RTA) Trafficking in Yeast

A Simple Fluorescence-based Reporter Assay to Identify Cellular Components Required for Ricin Toxin A Chain RTA Trafficking in Yeast

세포질 구성 요소를 식별 하는 간단한 형광 기반 기자 분석 결과 리 독 소에 필요한 체인 (RTA) 효 모에 인신 매매

Bacterial and plant A/B toxins exploit the natural trafficking pathways in eukaryotic cells to reach their intracellular target(s) in the cytosol and to ...