Name: in situ monitoring of transiently formed molecular chaperone assemblies in bacteria, yeast, and human cells
Uploaded: 2019-09-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells at JoVE.com

NBN поддерживается специальным грантом на набор персонала из Университета Монаш факультета медицины медсестер и медицинских наук при финансировании со стороны правительства штата Виктория и австралийского правительства. Мы благодарим Бернда Букау (МБХ, Гейдельбергский университет, Германия) и Харм Х. Кампинга (Департамент биомедицинских наук клеток и систем, Университет Гронингена, Нидерланды) за их неоценимую поддержку и обмен реагентами, Хольгер Лоренц (КмБХ) Imaging Facility, Гейдельбергский университет, Германия) за поддержку с конфокальной микроскопии и обработки изображений, и Клэр Херст (ARMI, Университет Монаша, Австралия) для критического чтения рукописи.

1. Подготовка клетки HeLa
<ol><li>Подготовьте следующие материалы: PBS (137 мм NaCl, 2,7 мм KCl, 10 мМ Na2HPO4, 1,8 мм КХ2PO4),рН 7,4; DMEM, дополненный 10% FCS и 1% Pen-Strep; 4% параформальдегида в PBS; 0,5% Тритон-X100 в PBS; TBS-T (150 мМ NaCl, 20 мм Трис, 0.05% Tween), рН 7,4; 0,0001% стерильный поли-l-лизинный раствор; 10-ну хорошо...

<ol>
	<li>Soderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation.">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).</li><li>Weibrecht, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+ligation+assays:+a+recent+addition+to+the+proteomics+toolbox.">Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox.</a> Expert Review of Proteomics. 7 (3), 401-409 (2010).</li><li>Mayer, M. P., Gierasch, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+structural+and+mechanistic+aspects+of+Hsp70+molecular+chaperones.">Recent advances in the structural and mechanistic aspects of Hsp70 molecular chaperones.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (6), 2085-2097 (2019).</li><li>Kampinga, H. H., Craig, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HSP70+chaperone+machinery:+J+proteins+as+drivers+of+functional+specificity.">The HSP70 chaperone machinery: J proteins as drivers of functional specificity.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (8), 579-592 (2010).</li><li>Nillegoda, N. B., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metazoan+Hsp70-based+protein+disaggregases:+emergence+and+mechanisms.">Metazoan Hsp70-based protein disaggregases: emergence and mechanisms.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 2, (2015).</li><li>Bracher, A., Verghese, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nucleotide+exchange+factors+of+Hsp70+molecular+chaperones.">The nucleotide exchange factors of Hsp70 molecular chaperones.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 2, (2015).</li><li>Nillegoda, N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+HSP70+co-chaperone+complex+unlocks+metazoan+protein+disaggregation.">Crucial HSP70 co-chaperone complex unlocks metazoan protein disaggregation.</a> Nature. 524 (7564), 247-251 (2015).</li><li>Nillegoda, N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+an+intricate+J-protein+network+driving+protein+disaggregation+in+eukaryotes.">Evolution of an intricate J-protein network driving protein disaggregation in eukaryotes.</a> Elife. 6, (2017).</li><li>Kirstein, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+properties+of+the+disaggregase+function+of+J-proteins+and+Hsc70+in+Caenorhabditis+elegans+stress+and+aging.">In vivo properties of the disaggregase function of J-proteins and Hsc70 in Caenorhabditis elegans stress and aging.</a> Aging Cell. 16 (6), 1414-1424 (2017).</li><li>Nillegoda, N. B., Wentink, A. S., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Disaggregation+in+multicellular+organisms.">Protein Disaggregation in multicellular organisms.</a> Trends in Biochemical Sciences. 43 (4), 285-300 (2018).</li><li>Chae, C., Sharma, S., Hoskins, J. R., Wickner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CbpA,+a+DnaJ+homolog,+is+a+DnaK+co-chaperone,+and+its+activity+is+modulated+by+CbpM.">CbpA, a DnaJ homolog, is a DnaK co-chaperone, and its activity is modulated by CbpM.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (32), 33147-33153 (2004).</li><li>Kityk, R., Kopp, J., Mayer, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Mechanism+of+J-domain-Triggered+ATP+Hydrolysis+by+Hsp70+Chaperones.">Molecular Mechanism of J-domain-Triggered ATP Hydrolysis by Hsp70 Chaperones.</a> Molecular Cell. 69 (2), 227-237 (2018).</li><li>S&#246;derberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+proteins+and+their+interactions+in+cells+and+tissues+using+the+in+situ+proximity+ligation+assay.">Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay.</a> Methods. 45 (3), 227-232 (2008).</li><li>Benschop, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+consensus+of+core+protein+complex+compositions+for+Saccharomyces+cerevisiae.">A consensus of core protein complex compositions for Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular Cell. 38 (6), 916-928 (2010).</li><li>Jung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+RNA-protein+interactions+in+situ+using+modified-MTRIPs+and+proximity+ligation.">Quantifying RNA-protein interactions in situ using modified-MTRIPs and proximity ligation.</a> Nucleic Acids Research. 41 (1), (2013).</li><li>Mocanu, M. M., V&#225;radi, T., Sz&#246;llosi, J., Nagy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+(FRET)+and+proximity+ligation+assay+(PLA).">Comparative analysis of fluorescence resonance energy transfer (FRET) and proximity ligation assay (PLA).</a> Proteomics. 11 (10), 2063-2070 (2011).</li><li>Sekar, R. B., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+resonance+energy+transfer+(FRET)+microscopy+imaging+of+live+cell+protein+localizations.">Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations.</a> Journal of Cell Biology. 160 (5), 629-633 (2003).</li><li>Deriziotis, P., Graham, S. A., Estruch, S. B., Fisher, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+protein-protein+interactions+in+live+cells+using+bioluminescence+resonance+energy+transfer.">Investigating protein-protein interactions in live cells using bioluminescence resonance energy transfer.</a> Journal of Visualized Experiments. 87, (2014).</li><li>Nagy, P., Sz&#246;llosi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+or+no+proximity:+that+is+the+question+&#8211;+but+the+answer+is+more+complex.">Proximity or no proximity: that is the question &#8211; but the answer is more complex.</a> Cytometry. 75 (10), 813-815 (2009).</li><li>Hoetelmans, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+acetone,+methanol,+or+paraformaldehyde+on+cellular+structure,+visualized+by+reflection+contrast+microscopy+and+transmission+and+scanning+electron+microscopy.">Effects of acetone, methanol, or paraformaldehyde on cellular structure, visualized by reflection contrast microscopy and transmission and scanning electron microscopy.</a> Applied Immunohistochemistry &amp; Molecular Morphology. 9 (4), 346-351 (2001).</li><li>Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunolabeling+artifacts+and+the+need+for+live-cell+imaging.">Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging.</a> Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).</li><li>Stadler, C., Skogs, M., Brismar, H., Uhlen, M., Lundberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+fixation+protocol+for+proteome-wide+immunofluorescence+localization+studies.">A single fixation protocol for proteome-wide immunofluorescence localization studies.</a> Journal of Proteomics. 73 (6), 1067-1078 (2010).</li><li>Goldenthal, K. L., Hedman, K., Chen, J. W., August, J. T., Willingham, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postfixation+detergent+treatment+for+immunofluorescence+suppresses+localization+of+some+integral+membrane+proteins.">Postfixation detergent treatment for immunofluorescence suppresses localization of some integral membrane proteins.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 33 (8), 813-820 (1985).</li><li>Schrader, M., Almeida, M., Grille, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postfixation+detergent+treatment+liberates+the+membrane+modelling+protein+Pex11beta+from+peroxisomal+membranes.">Postfixation detergent treatment liberates the membrane modelling protein Pex11beta from peroxisomal membranes.</a> Histochemistry &amp; Cell Biology. 138 (3), 541-547 (2012).</li><li>Willingham, M. C., Yamada, S. S., Pastan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+antibody+localization+of+alpha2-macroglobulin+in+membrane-limited+vesicles+in+cultured+cells.">Ultrastructural antibody localization of alpha2-macroglobulin in membrane-limited vesicles in cultured cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (9), 4359-4363 (1978).</li><li>Aguilar-Uscanga, B., Francois, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+of+the+yeast+cell+wall+composition+and+structure+in+response+to+growth+conditions+and+mode+of+cultivation.">A study of the yeast cell wall composition and structure in response to growth conditions and mode of cultivation.</a> Letters in Applied Microbiology. 37 (3), 268-274 (2003).</li><li>Romaniuk, J. A., Cegelski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+cell+wall+composition+and+the+influence+of+antibiotics+by+cell-wall+and+whole-cell+NMR.">Bacterial cell wall composition and the influence of antibiotics by cell-wall and whole-cell NMR.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370, 1679 (2015).</li><li>Salazar, O., Asenjo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+lysis+of+microbial+cells.">Enzymatic lysis of microbial cells.</a> Biotechnology Letters. 29 (7), 985-994 (2007).</li><li>Cunningham, A. F., Spreadbury, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterial+stationary+phase+induced+by+low+oxygen+tension:+cell+wall+thickening+and+localization+of+the+16-kilodalton+alpha-crystallin+homolog.">Mycobacterial stationary phase induced by low oxygen tension: cell wall thickening and localization of the 16-kilodalton alpha-crystallin homolog.</a> Journal of Bacteriology. 180 (4), 801-808 (1998).</li><li>Werner-Washburne, M., Braun, E., Johnston, G. C., Singer, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stationary+phase+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Stationary phase in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiological Reviews. 57 (2), 383-401 (1993).</li></ol>

В качестве давних методов для характеристики белковых сборок использовались подходы, основанные на социопротеии и локализации. Обнаружение переходно сформированных конкретных комплексов сопровождающего является серьезной проблемой при таких традиционных методах, и в результате пр...

Огромное количество геномной информации остается неистолималомируемым из-за нашего неполного понимания клеточных interactomes. Обычные методики обнаружения взаимодействия белка и белка, такие как белок, совместно ездовые с/без химического перекрестного соединения и колокализации белка, хотя и широко используется, представляют собой ряд недостатков. Некоторые из основных недостатков включают плохую количественную оценку взаимодействий и потенциальное введение неместных обязательных событий. Для сравнения, новые методы, основанные на близости, обеспечивают альтернативу и мощный подход к захвату белковых взаимодействий в клетках. Анализ перевязки близости (PLA)1, теперь доступен как собственный комплект, использует антитела специально целевых белковых комплексов, основанных на близости взаимодействующих подразделений.
НОАК инициируется формированием эшафота, состоящего из первичных и вторичных антител с небольшими днк-тегами (зондами НОАК) на поверхности целевого белкового комплекса(рисунок1, шаги 1-3). Далее, определяется близость днк-меток, круговая молекула ДНК генерируется путем гибридизации с разъемом олигонуклеотидов(Рисунок 1, шаг 4). Формирование круговой ДНК завершается шагом перевязки ДНК. Вновь сформированный круговой кусок ДНК служит шаблоном для последующего усиления подвижного круга (RCA) на основе полимеразы цепной реакции (ПЦР) загрунтовать одним из конъюгированных олигонуклеотидов метки. Это генерирует одноцепочечную конкатемерную ДНК-молекулу, прикрепленную к белковому комплексу через эшафот антител(рисунок1, шаг 6). Конкатемерная молекула ДНК визуализирована с помощью флуоресцентно помеченных олигонуклеотидов, которые гибридизируются с несколькими уникальными последовательностями, разбросанными по усиленной ДНК(Рисунок1, шаг 7)2. Сгенерированный сигнал PLA, который выглядит как флуоресцентная точка(рисунок1, шаг 7), соответствует расположению целевого белкового комплекса в клетке. В результате анализ мог обнаружить белковые комплексы с высокой пространственной точностью. Техника не ограничивается просто захвата белковых взаимодействий, но также может быть использован для обнаружения отдельных молекул или белков изменения на белки с высокой чувствительностью1,2.
Hsp70 образует весьма универсальную систему сопровождающего фундаментально важно для поддержания клеточного белка гомеостаза, участвуя в массиве домашнего хозяйства и связанных со стрессом функций. Деятельность по ведению домашнего хозяйства системы Hsp70 включает складывание белка de novo, перенос белка через клеточные мембраны, сборку и разборку белковых комплексов, регуляцию белковой активности и увязку различных сворачиваний белков/ машины контроля качества3. Та же система сопровождающего также сбрасывает неправильно сложенные/развернутые белки, предотвращает агрегацию белка, способствует дезагрегированию белка и сотрудничает с клеточными протеазами, чтобы деградировать неизлечимо неправильно сложенные/поврежденные белки для облегчения клеточного ремонта после протеотоксические напряжения4,5. Для достижения этого функционального разнообразия, Hsp70 сопровождающий опирается на партнерские со-chaperones семьи JDP и нуклеотидных обменных факторов (NEFs), которые тонкой настройки Hsp70 в ATP-зависимый аллостерный контроль субстрата связывания и релиз3, 6. Кроме того, со-сопровождающие JDP играют жизненно важную роль в выборе субстратов для этой универсальной системы сопровождающего. Члены этой семьи подразделяются на три класса (A, B и C) на основе их структурной гомологии к прототипу JDP, E. coli DnaJ. JDPs класса A содержит N-терминальный J-домен, который взаимодействует с Hsp70, богатым глицином-фенилаланином, областью связывания субстрата, состоящей из цинкового пальца, похожего на область (ЗФЛР) и двух доменов с стволом, а также с доменом димеризации C-терминала. JDPs с N-терминал J-домен и глицин-фенилаланин богатый регион, но не хватает ЗФЛР, попадают в класс B. В целом, члены этих двух классов участвуют в сопровождающих функций. Члены, подпадающие под catchall класса C, который содержит JDPs, которые разделяют только J-домен4, набирать Hsp70s для выполнения различных функций, не связанных с сопровождающим. Важная роль JDPs как взаимозаменяемого распознавания субстрата "адапторы" системы Hsp70 находит свое отражение в расширении членов семьи в процессе эволюции. Например, люди имеют более 42 различных членов JDP4. Эти JDPs функции мономеров, гомодимеры и / или гомо / гетеро олигомеров4,5. В последнее время функциональное сотрудничество через переходное комплексное образование между классом А (например, H. sapiens DNAJA2; S. cerevisiae Ydj1) и класс B (например, H. sapiens DNAJB1; S. cerevisiae Sis1) eukaryotic JDPs, как сообщается, способствует эффективному распознаванию аморфных белковых агрегатов in vitro7,8. Эти комплексы смешанного класса JDP предположительно собираются на поверхности агрегированных белков для облегчения образования Hsp70- и Hsp70-Hsp100-протеиновых дезагрегаз7,8,9, 10. Критические доказательства в поддержку существования этих переходно сформированных смешанных комплексов JDP в эукариотических клетках были предоставлены PLA8.
НОАК все чаще используется для оценки белковых взаимодействий в метазоах, в первую очередь в клетках млекопитающих. Здесь мы сообщаем об успешном расширении этой техники для мониторинга переходно сформированных комплексов сопровождающего в эукариотических и прокариотических одноклеточных организмах, таких как подающий надежды дрожжи S. cerevisiae и бактерия E. coli. Важно отметить, что это расширение подчеркивает потенциальное использование НОАК в обнаружении и анализе микробов, которые инфицируют клетки человека и животных.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>37% Formaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>103999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-DNAJA2 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab157216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-DNAJB1 Antibody</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ADI-SPA-450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-DnaK antibody</td>
			<td>In house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mCherry antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab125096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Sis1 Antibody</td>
			<td>Cosmo Bio Corp</td>
			<td>COP-080051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Ydj1 antibody</td>
			<td>StressMarq Biosciences</td>
			<td>&#160;SMC-150,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-YFP antibody</td>
			<td>In house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin slide-staining jar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diagnostic slides</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>1216530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink In Situ Detection Reagents Orange</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink In Situ Mounting Medium + DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink In Situ Wash Buffers, Fluorescence</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>62971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P47-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorbitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>25300096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymolase 100T / / Lyticase</td>
			<td>United States Biological</td>
			<td>Z1004</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ monitoring of transiently formed molecular chaperone assemblies in bacteria, yeast, and human cells

Белки J-домена (JDP) образуют самую большую и разнообразную семейство со-чаперонов в эукариотических клетках. Недавние результаты показывают, что конкретные члены семьи JDP могут образовывать переходные гетерокомплексы в эукариотах для тонкой настройки подложки для 70 kDa теплового шока белка (Hsp70) на основе сопровождающих протеинов дезагрегазы. Комплексы JDP нацелены на острый/хронический стресс, индуцированный агрегированными белками, и, предположительно, помогают собрать дезагрегазы, набирая несколько Hsp70 на поверхность белковых агрегатов. Степень сети контроля качества белка ( P'C), образованная этими физически взаимодействующими JDPs, остается в значительной степени нехарактерной in vivo. Здесь мы описываем на основе микроскопии на основе на месте белка взаимодействия анализ называется близость перевязки анализ (PLA), который способен надежно захватить эти преходяще ежило сформированных комплексов сопровождающего в различных клеточных отсеков эукариотических клеток. Наша работа расширяет занятость НОАК от человеческих клеток до дрожжей(Saccharomyces cerevisiae) и бактерий (Escherichia coli), таким образом, что делает важным инструментом для мониторинга динамики переходно сформированных белковых сборок в обоих прокариотических и эукариотических клеток.

Наши предыдущие исследования in vitro с использованием очищенных белков показали, что подмножество человеческого класса А и класса B JDPs образуют переходные комплексы смешанного класса JDP для эффективного таргетирования широкого спектра агрегированных белков и, возможно, облегчает сборк?...

Watch this Scientific Journal Video about In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells at JoVE.com

In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells

Cognate J-домен белки сотрудничать с Hsp70 сопровождающего, чтобы помочь в множество биологических процессов, начиная от белка складывания к деградации. Здесь мы описываем на месте перевязки перевязки, которая позволяет мониторинг этих преходящее сяоченное машиностроения в бактериальных, дрожжей и человеческих клеток.

В Ситу Мониторинг переходно сформированных молекулярных сборок чаперона в бактериях, дрожжах и клетках человека

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the ...

Этот метод фиксирует переходные белковые взаимодействия в организмах, таких как бактерии и дрожжи, а также в различных типах клеток. Здесь мы отслеживаем временно сформированные специфические комплексы сопровождающего, которые участвуют в клеточном протеостазе. Основным преимуществом этого метода является способность генерировать информацию о динамике и субклеточной локализации белковых сборок в прокариотических и эукариотических клетках.Адаптация этого метода в одноклеточных организмах, таких как бактерии и дрожжи, позволяет исследователям использовать его в качестве мощного инструмента для исследования заболеваний, связанных с микробными инфекциями. Этот метод потенциально может быть использован для анализа белковых взаимодействий почти во всех организмах путем простого изменения условий на этапе подготовки образца протокола. Важно выбрать антитела хорошего качества, которые являются специфическими и протестированы либо в иммуногистохимии, иммунофлуоресценции, ELISA, или иммунопреципиетации.Начните с предварительного лечения 10-хорошо диагностических слайдов с поли-L-лизин. Добавьте 100 микролитров стерильных и отфильтрованных 0.0001%поли-L-лизина к каждой хорошо, и инкубировать слайды в течение 30 минут в стерильной ламинарной капюшон потока. Затем промойте каждый колодец 50 микролитров стерильной воды, чтобы удалить избыток поли-L-лизина.Добавьте приблизительно 15 000 клеток на колодец в зависимости от типа клетки и выращивайте клетки в стерильном влажном инкубаторе при 37 градусах Цельсия с 5%углекислым газом до 60-80% стечения. Через 24 часа, удалить рост среды, поставив бумагу на краю каждой хорошо, и мыть клетки три раза с 50 микролитров PBS. Затем исправить клетки, добавив 50 микролитров свежеприготовленных 4%paraformaldehyde в PBS к каждому хорошо и инкубации слайд при комнатной температуре в течение 10 минут.После фиксации, мыть слайд три раза, погружая слайд в слайд-окрашивание банку с PBS. Чтобы пронизать мембраны прикрепленных клеток, погрузите слайд в 100 миллилитров 0,5%Triton-X100 в PBS, и инкубировать клетки в течение 10 минут при комнатной температуре. Затем мыть горки три раза в TBS-T.После последней стирки удалите лишний буфер салфеткой. Выращивайте и разбавляйте клетки S.cerevisiae в соответствии с рукописными указаниями, затем перенесите их в 50-миллилитровую центрифугу и гранулы центрифугированием при 665 раз г в течение трех минут. Удалите супернатант и повторно наполнить клетки в пять миллилитров свежей среды.Затем добавьте 550 микролитров 37%формальдегида для окончательной концентрации 4% и инкубировать культуру при комнатной температуре в течение 15 минут, чтобы исправить клетки. После инкубации, гранулы клетки, удалить супернатант, и повторно гранулы в один миллилитр свежеприготовленных 4%paraformaldehyde в буфер для мытья. Инкубировать клетки при комнатной температуре в течение 45 минут.Между тем, подготовить диагностические слайды, добавив 100 микролитров 0,0001%поли-L-лизин решение для каждой хорошо и инкубации слайдов в течение 30 минут при комнатной температуре. Затем смойте излишки поли-L-лизина ультрачистой водой и дайте слайдам высохнуть. После инкубации шаг, мыть клетки в два раза с одним миллилитр мыть буфер центрифугации.Удалите супернатант и повторно посовелите клетки в буфер для мытья. Пеллет клетки после последнего мытья, и удалить супернатант и повторного незаменимия клеток в один миллилитр мыть буфера, содержащего 1,2 молярного сорбитола. Чтобы переварить клеточной стенки, гранулы клетки снова и повторного незаменимых клеток в 250 микролитров свежеприготовленного раствора Lyticase.Инкубировать клетки при 30 градусах по Цельсию в течение 15 минут с нежной тряской. После шага пищеварения, мыть клетки три раза в буфер мытья и повторного перерасхода клеток в 250 микролитров мыть буфера, содержащего 1,2 молярного сорбитола. Добавьте 20 микролитров повторно подвешенных клеток к каждому хорошо покрытому поли-L-лизином, и позвольте фиксированным и проницаемым клеткам прикрепиться в течение 30 минут.Вымойте скважины три раза с 50 микролитров буфера мытья, чтобы удалить неприемляемые клетки, и приступить к анализу перевязки близости. Инициировать анализ перевязки близости, или протокол НОАК, добавив каплю блокирующего буфера к каждой колодец и инкубировать слайд во влажной камере в течение 30 минут при 37 градусах по Цельсию. Удалите блокирующий буфер, поместив бумагу на краю каждой хорошо, и мыть клетки дважды в 100 миллилитров мыть буфера A.Next, добавить 40 микролитров первичного раствора антител к каждой хорошо, и инкубировать слайд в течение 60 минут при 37 градусов по Цельсию во влажной камере.Удалить первичный раствор антитела и мыть слайды дважды в буфер мыть A.After мытья, добавить 40 микролитров вторичного раствора антитела к каждой хорошо и инкубировать слайд в течение 60 минут при 37 градусов по Цельсию во влажной камере. Затем удалите раствор и мыть слайды дважды в буфер мыть A.Then добавить 40 микролитров смеси перевязки ДНК, которая содержит разъем олигонуклеотидов и ДНК лигазы, к каждому хорошо, и инкубировать слайд во влажной камере при 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут. После инкубации, удалить смесь перевязки и мыть слайды дважды с мытья буфера A.Add 40 микролитров смеси усиления ДНК, которая содержит полимеразы ДНК и флуоресцентно помечены олигонуклеотидов к каждой хорошо, и инкубировать в течение 100 минут во влажной камере при 37 градусов по Цельсию.Удалить смесь усиления и мыть горки в 100 миллилитров мыть буфера B в течение 10 минут за стирку. Затем промыть горки в 100 миллилитров мыть буфера B разбавленной от одного до 100 в ультрапурной воде. Добавьте 20 микролитров DAPI-содержащей монтажной среды на колодец.Обложка скважин слайда с крышкой скольжения и уплотнения с лаком для ногтей. Этот протокол был успешно использован для мониторинга переходных сборок сопровождающего, образованных между различными белками J-домена и белками Hsp70 и J-домена в клетках HeLa, S.cerevisiae и E.coli. Белки класса А и класса B J-домен были нацелены на высокоспецифические первичные антитела.Каждый из красных флуоресцентных панкти представляет собой белковый комплекс, образованный между двумя различными белками J-домена в клетках HeLa. Аналогичные белковые комплексы смешанного класса J-domain также наблюдаются в одноклеточном эукариоте S.cerevisiae, или хлебопекарных дрожжах. Некоторые из флуоресцентных puncti порожденных от НОАК было труднее решить, как отдельные очаги, из-за небольшого размера клеток.Комплексное образование белков класса А и В J-домен не наблюдалось в клетках E.coli, что согласуется с биохимическими исследованиями, проведенными с очищенными белками. Но другие сборки сопровождающего с участием J-доменных белков и сопровождающего Hsp70 были захвачены с помощью протокола НОАК. Технический контроль, не хватает первичного антитела против одного из взаимодействующих J-домен белков или chaperones в противном случае полные реакции НОАК показали мало или в отсутствие образования флуоресценции puncti в клетках, что свидетельствует об отсутствии ложноположительного усиления сигнала.Чтобы получить достоверные результаты с помощью анализа перевязки близости, заранее убедитесь, что используемые антитела достаточного качества. Кроме того, принять меры предосторожности, чтобы избежать чрезмерного переваривания клеток, содержащих клеточной стенки.

Research

JoVE Journal

Biology

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Флуоресценция Пробирной микроскопии для мониторинга Mitophagy в Дрожжи Saccharomyces CEREVISIAE

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Долгосрочные Смертельное испытания токсичности с ракообразных Артемия franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

Перепрограммирование соматических клеток человека в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (иПСК) Использование ретровирусных вектор с GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Визуализации и анализа молекул мРНК с помощью флуоресцентной<em&gt; В Ситу</em&gt; Гибридизация в<em&gt; Saccharomyces CEREVISIAE</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Эффективная генерация человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток из человеческих соматических клеток с Сендай-вируса

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Профилирования Индивидуальный человеческих эмбриональных стволовых клеток путем количественного RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Высокое разрешение Покадровый изображений и автоматизированный анализ динамики микротрубочек в живых человеческих эндотелиальных клеток пупочной вены

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

Пространственно-временная Анализ Cytokinetic События в делящихся дрожжей

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Графический пользовательский интерфейс для отслеживания концентрации белка в программном сопровождении в динамических клеточных выпячиваниях

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

A Simple Fluorescence-based Reporter Assay to Identify Cellular Components Required for Ricin Toxin A Chain (RTA) Trafficking in Yeast

A Simple Fluorescence-based Reporter Assay to Identify Cellular Components Required for Ricin Toxin A Chain RTA Trafficking in Yeast

Простой на основе флуоресценции репортер проба для выявления клеточных компонентов необходимых для рицин токсинному цепь (RTA) оборота дрожжей

Bacterial and plant A/B toxins exploit the natural trafficking pathways in eukaryotic cells to reach their intracellular target(s) in the cytosol and to ...