Name: in situ monitoring of transiently formed molecular chaperone assemblies in bacteria, yeast, and human cells
Uploaded: 2019-09-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells at JoVE.com

NBN cuenta con el apoyo de una beca especial de reclutamiento de la Facultad de Enfermería de medicina y ciencias de la salud de la Universidad de Monash con financiación del Gobierno del Estado de Victoria y el Gobierno de Australia. Agradecemos a Bernd Bukau (ZMBH, Universidad de Heidelberg, Alemania) y Harm H. Kampinga (Departamento de Ciencias Biomédicas de Células y Sistemas, Universidad de Groningen, Países Bajos) por su inestimable apoyo y intercambio de reactivos, Holger Lorenz (ZMBH Imaging Facility, Universidad de Heidelberg, Alemania) por su apoyo con la microscopía confocal y el procesamiento de imágenes, y Claire Hirst (ARMI, Universidad de Monash, Australia) para la lectura crítica del manuscrito.

1. Preparación de células HeLa
<ol><li>Preparar los siguientes materiales: PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4), pH 7,4; DMEM, complementado con 10% FCS y 1% Pen-Strep; 4% paraformaldehyde en PBS; 0.5% Tritón-X100 en PBS; TBS-T (150 mM NaCl, Tris de 20 mM, 0,05% Tween), pH 7,4; 0.0001% solución estéril de poli-L-lisina; Diapositivas de diagnóstico de 10 pozos; una cámara húmeda; papel tisú; y tarros de manchas deslizantes de Coplin. ...

<ol>
	<li>Soderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation.">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).</li><li>Weibrecht, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+ligation+assays:+a+recent+addition+to+the+proteomics+toolbox.">Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox.</a> Expert Review of Proteomics. 7 (3), 401-409 (2010).</li><li>Mayer, M. P., Gierasch, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+structural+and+mechanistic+aspects+of+Hsp70+molecular+chaperones.">Recent advances in the structural and mechanistic aspects of Hsp70 molecular chaperones.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (6), 2085-2097 (2019).</li><li>Kampinga, H. H., Craig, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HSP70+chaperone+machinery:+J+proteins+as+drivers+of+functional+specificity.">The HSP70 chaperone machinery: J proteins as drivers of functional specificity.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (8), 579-592 (2010).</li><li>Nillegoda, N. B., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metazoan+Hsp70-based+protein+disaggregases:+emergence+and+mechanisms.">Metazoan Hsp70-based protein disaggregases: emergence and mechanisms.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 2, (2015).</li><li>Bracher, A., Verghese, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nucleotide+exchange+factors+of+Hsp70+molecular+chaperones.">The nucleotide exchange factors of Hsp70 molecular chaperones.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 2, (2015).</li><li>Nillegoda, N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+HSP70+co-chaperone+complex+unlocks+metazoan+protein+disaggregation.">Crucial HSP70 co-chaperone complex unlocks metazoan protein disaggregation.</a> Nature. 524 (7564), 247-251 (2015).</li><li>Nillegoda, N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+an+intricate+J-protein+network+driving+protein+disaggregation+in+eukaryotes.">Evolution of an intricate J-protein network driving protein disaggregation in eukaryotes.</a> Elife. 6, (2017).</li><li>Kirstein, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+properties+of+the+disaggregase+function+of+J-proteins+and+Hsc70+in+Caenorhabditis+elegans+stress+and+aging.">In vivo properties of the disaggregase function of J-proteins and Hsc70 in Caenorhabditis elegans stress and aging.</a> Aging Cell. 16 (6), 1414-1424 (2017).</li><li>Nillegoda, N. B., Wentink, A. S., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Disaggregation+in+multicellular+organisms.">Protein Disaggregation in multicellular organisms.</a> Trends in Biochemical Sciences. 43 (4), 285-300 (2018).</li><li>Chae, C., Sharma, S., Hoskins, J. R., Wickner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CbpA,+a+DnaJ+homolog,+is+a+DnaK+co-chaperone,+and+its+activity+is+modulated+by+CbpM.">CbpA, a DnaJ homolog, is a DnaK co-chaperone, and its activity is modulated by CbpM.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (32), 33147-33153 (2004).</li><li>Kityk, R., Kopp, J., Mayer, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Mechanism+of+J-domain-Triggered+ATP+Hydrolysis+by+Hsp70+Chaperones.">Molecular Mechanism of J-domain-Triggered ATP Hydrolysis by Hsp70 Chaperones.</a> Molecular Cell. 69 (2), 227-237 (2018).</li><li>S&#246;derberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+proteins+and+their+interactions+in+cells+and+tissues+using+the+in+situ+proximity+ligation+assay.">Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay.</a> Methods. 45 (3), 227-232 (2008).</li><li>Benschop, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+consensus+of+core+protein+complex+compositions+for+Saccharomyces+cerevisiae.">A consensus of core protein complex compositions for Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular Cell. 38 (6), 916-928 (2010).</li><li>Jung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+RNA-protein+interactions+in+situ+using+modified-MTRIPs+and+proximity+ligation.">Quantifying RNA-protein interactions in situ using modified-MTRIPs and proximity ligation.</a> Nucleic Acids Research. 41 (1), (2013).</li><li>Mocanu, M. M., V&#225;radi, T., Sz&#246;llosi, J., Nagy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+(FRET)+and+proximity+ligation+assay+(PLA).">Comparative analysis of fluorescence resonance energy transfer (FRET) and proximity ligation assay (PLA).</a> Proteomics. 11 (10), 2063-2070 (2011).</li><li>Sekar, R. B., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+resonance+energy+transfer+(FRET)+microscopy+imaging+of+live+cell+protein+localizations.">Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations.</a> Journal of Cell Biology. 160 (5), 629-633 (2003).</li><li>Deriziotis, P., Graham, S. A., Estruch, S. B., Fisher, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+protein-protein+interactions+in+live+cells+using+bioluminescence+resonance+energy+transfer.">Investigating protein-protein interactions in live cells using bioluminescence resonance energy transfer.</a> Journal of Visualized Experiments. 87, (2014).</li><li>Nagy, P., Sz&#246;llosi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+or+no+proximity:+that+is+the+question+&#8211;+but+the+answer+is+more+complex.">Proximity or no proximity: that is the question &#8211; but the answer is more complex.</a> Cytometry. 75 (10), 813-815 (2009).</li><li>Hoetelmans, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+acetone,+methanol,+or+paraformaldehyde+on+cellular+structure,+visualized+by+reflection+contrast+microscopy+and+transmission+and+scanning+electron+microscopy.">Effects of acetone, methanol, or paraformaldehyde on cellular structure, visualized by reflection contrast microscopy and transmission and scanning electron microscopy.</a> Applied Immunohistochemistry &amp; Molecular Morphology. 9 (4), 346-351 (2001).</li><li>Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunolabeling+artifacts+and+the+need+for+live-cell+imaging.">Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging.</a> Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).</li><li>Stadler, C., Skogs, M., Brismar, H., Uhlen, M., Lundberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+fixation+protocol+for+proteome-wide+immunofluorescence+localization+studies.">A single fixation protocol for proteome-wide immunofluorescence localization studies.</a> Journal of Proteomics. 73 (6), 1067-1078 (2010).</li><li>Goldenthal, K. L., Hedman, K., Chen, J. W., August, J. T., Willingham, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postfixation+detergent+treatment+for+immunofluorescence+suppresses+localization+of+some+integral+membrane+proteins.">Postfixation detergent treatment for immunofluorescence suppresses localization of some integral membrane proteins.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 33 (8), 813-820 (1985).</li><li>Schrader, M., Almeida, M., Grille, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postfixation+detergent+treatment+liberates+the+membrane+modelling+protein+Pex11beta+from+peroxisomal+membranes.">Postfixation detergent treatment liberates the membrane modelling protein Pex11beta from peroxisomal membranes.</a> Histochemistry &amp; Cell Biology. 138 (3), 541-547 (2012).</li><li>Willingham, M. C., Yamada, S. S., Pastan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+antibody+localization+of+alpha2-macroglobulin+in+membrane-limited+vesicles+in+cultured+cells.">Ultrastructural antibody localization of alpha2-macroglobulin in membrane-limited vesicles in cultured cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (9), 4359-4363 (1978).</li><li>Aguilar-Uscanga, B., Francois, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+of+the+yeast+cell+wall+composition+and+structure+in+response+to+growth+conditions+and+mode+of+cultivation.">A study of the yeast cell wall composition and structure in response to growth conditions and mode of cultivation.</a> Letters in Applied Microbiology. 37 (3), 268-274 (2003).</li><li>Romaniuk, J. A., Cegelski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+cell+wall+composition+and+the+influence+of+antibiotics+by+cell-wall+and+whole-cell+NMR.">Bacterial cell wall composition and the influence of antibiotics by cell-wall and whole-cell NMR.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370, 1679 (2015).</li><li>Salazar, O., Asenjo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+lysis+of+microbial+cells.">Enzymatic lysis of microbial cells.</a> Biotechnology Letters. 29 (7), 985-994 (2007).</li><li>Cunningham, A. F., Spreadbury, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterial+stationary+phase+induced+by+low+oxygen+tension:+cell+wall+thickening+and+localization+of+the+16-kilodalton+alpha-crystallin+homolog.">Mycobacterial stationary phase induced by low oxygen tension: cell wall thickening and localization of the 16-kilodalton alpha-crystallin homolog.</a> Journal of Bacteriology. 180 (4), 801-808 (1998).</li><li>Werner-Washburne, M., Braun, E., Johnston, G. C., Singer, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stationary+phase+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Stationary phase in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiological Reviews. 57 (2), 383-401 (1993).</li></ol>

Los enfoques basados en la co-inmunoprecipitación y la colocalización se han utilizado como métodos de larga data para caracterizar los ensambladores de proteínas. La detección de complejos de chaperona específicos formados transitoriamente es un desafío importante con estos métodos convencionales, y como resultado, los hallazgos anteriores se limitan en gran medida a interpretaciones cualitativas. Las técnicas de coinmunoprecipitación basadas en lisis celular a menudo requieren reticulación para estabilizar l...

Una gran cantidad de información genómica sigue siendo ininterpretable debido a nuestra comprensión incompleta de los interactomes celulares. Las metodologías convencionales de detección de interacciones proteína-proteína, como la coinmunoprecipitación proteína con/sin reticulación química y la colocalización proteica, aunque ampliamente utilizadas, plantean una serie de desventajas. Algunas de las principales desventajas incluyen la cuantificación deficiente de las interacciones y la posible introducción de eventos de enlace no nativos. En comparación, las técnicas emergentes basadas en proximidad proporcionan una alternativa y un enfoque potente para capturar interacciones proteicas en las células. El ensayo de ligadura de proximidad (PLA)1, ahora disponible como un kit patentado, emplea anticuerpos para apuntar específicamente a los complejos proteicos en función de la proximidad de las subunidades que interactúan.
El PLA se inicia mediante la formación de un andamio que consiste en anticuerpos primarios y secundarios conpequeñas etiquetas de ADN (sondas PLA) en la superficie del complejo proteico objetivo (Figura 1, pasos 1-3). A continuación, determinada por la proximidad de las etiquetas de ADN, se genera una moléculade ADN circular a través de la hibridación con oligonucleótidos conectores (Figura 1, paso 4). La formación del ADN circular se completa con un paso de ligadura de ADN. La pieza circular de ADN (PCR) recién formada sirve como plantilla para la posterior reacción en cadena de la polimerasa (PCR) basada en amplificación de círculo rodante (RCA) cebada por una de las etiquetas de oligonucleótidos conjugadas. Esto genera una molécula de ADN concatemérica de una sola cadena unidaal complejo proteico a través del andamio de anticuerpos (Figura 1, paso 6). La molécula de ADN concatemérico se visualiza utilizando oligonucleótidos etiquetados fluorescentemente que hibridan en múltiples secuencias únicas dispersas a través del ADN amplificado (Figura1,paso 7)2. La señal PLA generada, que aparececomo un punto fluorescente (Figura 1, paso 7), corresponde a la ubicación del complejo proteico objetivo en la célula. Como resultado, el ensayo podría detectar complejos proteicos con alta precisión espacial. La técnica no se limita a simplemente capturar interacciones proteicas, sino que también podría utilizarse para detectar moléculas individuales o modificaciones de proteínas en proteínas con alta sensibilidad1,2.
Hsp70 forma un sistema de chaperona altamente versátil fundamentalmente importante para mantener la homeostasis de proteínas celulares participando en una serie de funciones domésticas y asociadas al estrés. Las actividades de limpieza del sistema de chaperone Hsp70 incluyen plegado de proteína sin novo, translocación de proteínas a través de membranas celulares, montaje y desmontaje de complejos proteicos, regulación de la actividad proteica y vinculación de diferentes plegados proteicos/ máquinas de control de calidad3. El mismo sistema de chaperone también vuelve a doblar las proteínas mal dobladas/desplegadas, previene la agregación de proteínas, promueve la desagregación de proteínas y coopera con las proteasas celulares para degradar las proteínas terminales mal dobladas/dañadas para facilitar la reparación celular después de estrés proteotóxico4,5. Para lograr esta diversidad funcional, el acompañante Hsp70 se basa en cochaperones asociados de la familia JDP y factores de intercambio de nucleótidos (NEF) que ajustan el control alostérico dependiente del ATP del Hsp70 de la unión y liberacióndesustratos3, 6. Además, los cochaperones JDP desempeñan un papel vital en la selección de sustratos para este versátil sistema de chaperón. Los miembros de esta familia se subdividen en tres clases (A, B y C) basadas en su homología estructural al prototipo JDP, el E. coli DnaJ. Los JDP de clase A contienen un dominio J de N-terminal, que interactúa con Hsp70, una región rica en glicina-fenilalanina, una región de unión de sustrato que consta de una región similar a un dedo de zinc (ZFLR) y dos dominios de barril, y un dominio de dimerización de terminal C. Los JDP con un dominio J n-terminal y una región rica en glicina-fenilalanina, pero que carecen de ZFLR, entran en la clase B. En general, los miembros de estas dos clases están involucrados en funciones de chaperoning. Los miembros comprendidos en la clase catchall C, que contiene JDP que solo comparten el dominio J4, reclutan Hsp70s para realizar una variedad de funciones no acompañantes. El importante papel de los JDP como "adaptadores" intercambiables de reconocimiento de sustratos del sistema Hsp70 se refleja en una expansión de los miembros de la familia durante la evolución. Por ejemplo, los seres humanos tienen más de 42 miembros distintos de JDP4. Estos JDP funcionan como monómeros, homodímeros y/o homo/hetero oligomeros4,5. Recientemente, una cooperación funcional a través de la formación compleja transitoria entre la clase A (por ejemplo, H. sapiens DNAJA2; S. cerevisiae Ydj1) y clase B (por ejemplo, H. sapiens DNAJB1; S. cerevisiae Sis1) JDPs eucariotas se informó para promover el reconocimiento eficiente de los agregados de proteína amorfo in vitro7,8. Estos complejos JDP de clase mixta se ensamblan presumiblemente en la superficie de las proteínas agregadas para facilitar la formación de desgas de proteínas a base de Hsp70- y Hsp70+Hsp1007,8,9, 10. La evidencia crítica para apoyar la existencia de estos complejos JDP de clasemixta formados transitoriamente en células eucariotas fue proporcionada con PLA 8.
PLA se emplea cada vez más para evaluar las interacciones proteicas en metazoa, principalmente en células de mamíferos. Aquí, informamos de la expansión exitosa de esta técnica para monitorear complejos de chaperone formados transitoriamente en organismos unicelulares eucariotas y procariotas como la levadura en ciernes S. cerevisiae y la bacteria E. coli. Es importante destacar que esta expansión pone de relieve el uso potencial del PLA en la detección y análisis de microbios que infectan células humanas y animales.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>37% Formaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>103999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-DNAJA2 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab157216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-DNAJB1 Antibody</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ADI-SPA-450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-DnaK antibody</td>
			<td>In house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mCherry antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab125096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Sis1 Antibody</td>
			<td>Cosmo Bio Corp</td>
			<td>COP-080051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Ydj1 antibody</td>
			<td>StressMarq Biosciences</td>
			<td>&#160;SMC-150,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-YFP antibody</td>
			<td>In house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin slide-staining jar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diagnostic slides</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>1216530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink In Situ Detection Reagents Orange</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink In Situ Mounting Medium + DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink In Situ Wash Buffers, Fluorescence</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>62971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P47-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorbitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>25300096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymolase 100T / / Lyticase</td>
			<td>United States Biological</td>
			<td>Z1004</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ monitoring of transiently formed molecular chaperone assemblies in bacteria, yeast, and human cells

Las proteínas de dominio J (JD) forman la familia de co-chaperona más grande y diversa en las células eucariotas. Los hallazgos recientes muestran que miembros específicos de la familia JDP podrían formar heterocomplejos transitorios en eucariotas para ajustar la selección de sustratos para los disaggregases de proteína a base de chaperone de 70 kDa (Hsp70). Los complejos JDP apuntan a proteínas agregadas inducidas por estrés agudo/crónico y presumiblemente ayudan a ensamblar los desaggregases mediante la contratación de múltiples Hsp70 a la superficie de los agregados proteicos. El alcance de la red de control de calidad de proteínas (PQC) formada por estos JDP que interactúan físicamente sigue sin caracterizarse in vivo. Aquí, describimos un ensayo de interacción de proteína in situ basado en microscopía denominado ensayo de ligadura de proximidad (PLA), que es capaz de capturar de forma robusta estos complejos de chaperona formados transitoriamente en distintos compartimentos celulares de células eucariotas. Nuestro trabajo amplía el empleo de PLA de células humanas a levaduras (Saccharomyces cerevisiae) y bacterias (Escherichiacoli), lo que convierte en una herramienta importante para monitorear la dinámica de los conjuntos de proteínas formadas transitoriamente en ambos células procariotas y eucariotas.

Nuestros estudios in vitro anteriores con proteínas purificadas revelaron que un subconjunto de JDP de clase A y Clase B forman complejos JDP de clase mixta transitoria para apuntar eficientemente a una amplia gama de proteínas agregadas y posiblemente facilitar el montaje de Hsp70-basado en desgastegas proteicas7. Empleamos PLA para determinar si los complejos JDP de clase mixta (A+B) ocurren en células de cáncer de cuello uterino humano (HeLa). Los JDP humanos DNAJA2 (clase A) y DNAJB1 (clas...

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In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells

Las proteínas de dominio J de Cognate cooperan con el acompañante Hsp70 para ayudar en una miríada de procesos biológicos que van desde el plegado de proteínas hasta la degradación. Aquí, describimos un ensayo de ligadura de proximidad in situ, que permite el seguimiento de estas máquinas de chaperone formadas transitoriamente en células bacterianas, levaduras y humanas.

Monitoreo in situ de conjuntos de chaperona molecular formadas transitoriamente en bacterias, levaduras y células humanas

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the ...

Este método captura interacciones proteicas transitorias en organismos como bacterias y levaduras y en diferentes tipos celulares. Aquí monitoreamos complejos de chaperona específicos formados transitoriamente que están involucrados en la proteostasis celular. La principal ventaja de esta técnica es la capacidad de generar información sobre la dinámica y localización subcelular de conjuntos procariotas y eucariotas.Adaptaciones de esta técnica en organismos unicelulares como bacterias y levaduras, permite a los investigadores utilizarla como una poderosa herramienta para investigar enfermedades relacionadas con infecciones microbianas. Esta técnica podría emplearse potencialmente para analizar las interacciones proteicas en casi todos los organismos simplemente cambiando las condiciones en la fase de preparación de la muestra del protocolo. Es importante seleccionar anticuerpos de buena calidad que sean específicos y probados en inmunohistoquímica, inmunofluorescencia, ELISA o inmunoprecipitaciones.Comience por pretratar diapositivas de diagnóstico de 10 pocóditos con poli-L-lisina. Añadir 100 microlitros de estéril y filtrado 0.0001%poli-L-lisina a cada pocóptero, e incubar los portaobjetos durante 30 minutos en una campana de flujo laminar estéril. A continuación, lavar cada pozo con 50 microlitros de agua estéril para eliminar el exceso de poli-L-lisina.Agregue aproximadamente 15.000 células por pozo dependiendo del tipo de célula, y haga crecer las células en una incubadora húmeda estéril a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono a una confluencia de 60 a 80%. Después de 24 horas, retire el medio de crecimiento colocando un papel tisú en el borde de cada pozo, y lave las células tres veces con 50 microlitros de PBS. Luego fije las células agregando 50 microlitros de 4%paraformaldehído recién preparado en PBS a cada pozo e incubando el portaobjetos a temperatura ambiente durante 10 minutos.Después de la fijación, lave la diapositiva tres veces sumergiendo la diapositiva en un frasco de manchas deslizantes con PBS. Para permeabilizar las membranas de las células adheridas, sumerja el portaobjetos en 100 mililitros de 0.5%Triton-X100 en PBS, e incubar las células durante 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, lave las diapositivas tres veces en TBS-T.Después del último lavado, retire el exceso de tampón con un papel tisú. Cultivar y diluir las células de S.cerevisiae de acuerdo con las instrucciones del manuscrito, luego transferirlas a un tubo centrífuga de 50 mililitros y pellets por centrifugación a 665 veces g durante tres minutos. Retire el sobrenadante y resusppend las células en cinco mililitros de medio fresco.Luego agregue 550 microlitros de 37%formaldehído para una concentración final del 4% e incubar el cultivo a temperatura ambiente durante 15 minutos para fijar las células. Después de la incubación, pele el suelo de las células, retire el sobrenadante y resuspendir el pellet en un mililitro de 4%paraformaldehído recién preparado en tampón de lavado. Incubar las células a temperatura ambiente durante 45 minutos.Mientras tanto, preparar los portaobjetos de diagnóstico mediante la adición de 100 microlitros de 0.0001%solución de poli-L-lisina a cada pocóteo e incubar los portaobjetos durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, lavar el exceso de poli-L-lisina con agua ultrapura y dejar que los toboganes se sequen al aire. Después del paso de incubación, lave las células dos veces con un mililitro de tampón de lavado por centrifugación.Retire el sobrenadante y resusppend las células en el tampón de lavado. Pele el pasador de las células después del último lavado, y retire el sobrenadante y resusppend las células en un mililitro de tampón de lavado que contiene 1.2 molar sorbitol. Para digerir la pared celular, pele las células de nuevo y resuspendir las células en 250 microlitros de solución de liceas recién preparada.Incubar las células a 30 grados centígrados durante 15 minutos con un suave temblor. Después del paso de digestión, lave las células tres veces en el tampón de lavado y resusppend las células en 250 microlitros de tampón de lavado que contiene 1.2 sorbitol molar. Agregue 20 microlitros de células re-suspendidas a cada pozo recubierto de poli-L-lisina, y permita que las células fijas y permeabilizadas se adhieran durante 30 minutos.Lave los pozos tres veces con 50 microlitros de tampón de lavado para eliminar las células no adherentes, y proceda con el ensayo de ligadura de proximidad. Inicie el ensayo de ligadura de proximidad, o protocolo PLA, añadiendo una gota del tampón de bloqueo a cada pozo e incubar el portaobjetos en una cámara húmeda durante 30 minutos a 37 grados centígrados. Retire el tampón de bloqueo colocando un papel tisú en el borde de cada pozo, y lave las células dos veces en 100 mililitros de tampón de lavado A.Next, agregue 40 microlitros de la solución de anticuerpos primarios a cada pozo e incubar el portaobjetos durante 60 minutos a 37 grados Celsius en una cámara húmeda.Retire la solución de anticuerpos primarios y lave los portaobjetos dos veces en el tampón de lavado A.Después del lavado, agregue 40 microlitros de la solución de anticuerpos secundarios a cada pozo e incubar el portaobjetos durante 60 minutos a 37 grados centígrados en una cámara húmeda. A continuación, retire la solución y lave las diapositivas dos veces en el tampón de lavado A.A continuación, agregue 40 microlitros de la mezcla de ligadura de ADN que contiene el conector oligonucleótidos y ligasas de ADN, a cada pocús, e incubar el portaobjetos en la cámara húmeda a 37 grados Celsius durante 30 minutos. Después de la incubación, retire la mezcla de ligadura y lave los portaobjetos dos veces con el tampón de lavado A.Añadir 40 microlitros de mezcla de amplificación de ADN que contiene la polimerasa de ADN y los oligonucleótidos con etiqueta fluorescente a cada pozo, e incubar durante 100 minutos en la cámara húmeda a 37 grados centígrados.Retire la mezcla de amplificación y lave los portaobjetos en 100 mililitros de tampón de lavado B durante 10 minutos por lavado. A continuación, lave los portaobjetos en 100 mililitros de tampón de lavado B diluido de uno a 100 en agua ultrapura. Agregue 20 microlitros de medio de montaje que contenga DAPI por pozo.Cubra los pozos de la diapositiva con un resbalón de cubierta y cierre con esmalte de uñas. Este protocolo se utilizó con éxito para supervisar los conjuntos de chaperones transitorios formados entre proteínas distintas del dominio J y las proteínas de capó Hsp70 y J-dominio en células de HeLa, S.cerevisiae y E.coli. Las proteínas de dominio J de clase A y clase B fueron objeto de anticuerpos primarios muy específicos.Cada uno de los signos fluorescentes rojos representa un complejo proteico formado entre dos proteínas distintas del dominio J en las células de HeLa. También se observan complejos similares de proteínas de dominio J de clase mixta en el eucariota unicelular S.cerevisiae, o levadura de panadero. Algunos de los puncti fluorescentes generados a partir del PLA eran más difíciles de resolver como focos individuales, debido al pequeño tamaño de la célula.No se observó una formación compleja entre proteínas de dominio J de clase A y B en células de E.coli, lo que es consistente con estudios bioquímicos realizados con proteínas purificadas. Pero otros conjuntos de chaperona que involucran proteínas del dominio J y el acompañante Hsp70 fueron capturados usando el protocolo PLA. Los controles técnicos que carecieron de un anticuerpo primario contra una de las proteínas o chaperones del dominio J que interactúan en las reacciones PLA completas mostraron poca o ninguna formación de fluorescencia puncti en las células, lo que indica una falta de falsa amplificación positiva de la señal.Para obtener resultados fiables utilizando el ensayo de ligadura de proximidad, verifique de antemano que los anticuerpos utilizados son de calidad suficiente. Además, tome precauciones para evitar la digestión excesiva de las células que contienen una pared celular.

Research

JoVE Journal

Biology

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Investigación

Biología

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