Name: in situ monitoring of transiently formed molecular chaperone assemblies in bacteria, yeast, and human cells
Uploaded: 2019-09-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells at JoVE.com

NBN stöds av ett särskilt rekryterings bidrag från Monash University medicinska omvårdnad och hälsovetenskaper med finansiering från delstatsregeringen i Victoria och den australiska regeringen. Vi tackar Bernd Bukau (ZMBH, Heidelberg University, Tyskland) och harm H. Kampinga (Institutionen för biomedicinsk vetenskap av celler & Systems, University of Groningen, Nederländerna) för deras ovärderliga stöd och utbyte av reagenser, Holger Lorenz (ZMBH Imaging Facility, Heidelbergs universitet, Tyskland) för sitt stöd med konfokalmikroskopi och bildbehandling, och Claire Hirst (ARMI, Monash University, Australien) för kritisk läsning av manuskriptet.

1. HeLa cell förberedelse
<ol><li>Förbered följande material: PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM na2HPO4, 1,8 mm KH2Po4), pH 7,4; DMEM, kompletterat med 10% FCS och 1% Pen-STREP; 4% PARAFORMALDEHYD i PBS; 0,5% Triton-X100 i PBS; TBS-T (150 mM NaCl, 20 mM Tris, 0,05% Tween), pH 7,4; 0,0001% steril Poly-L-lysin lösning; 10-Tja diagnostiska diabilder; en fuktig kammare; mjukpapper; och Coplin Slide-färgning burkar. Anmärkning: För att säkerställa op...

<ol>
	<li>Soderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation.">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).</li><li>Weibrecht, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+ligation+assays:+a+recent+addition+to+the+proteomics+toolbox.">Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox.</a> Expert Review of Proteomics. 7 (3), 401-409 (2010).</li><li>Mayer, M. P., Gierasch, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+structural+and+mechanistic+aspects+of+Hsp70+molecular+chaperones.">Recent advances in the structural and mechanistic aspects of Hsp70 molecular chaperones.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (6), 2085-2097 (2019).</li><li>Kampinga, H. H., Craig, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HSP70+chaperone+machinery:+J+proteins+as+drivers+of+functional+specificity.">The HSP70 chaperone machinery: J proteins as drivers of functional specificity.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (8), 579-592 (2010).</li><li>Nillegoda, N. B., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metazoan+Hsp70-based+protein+disaggregases:+emergence+and+mechanisms.">Metazoan Hsp70-based protein disaggregases: emergence and mechanisms.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 2, (2015).</li><li>Bracher, A., Verghese, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nucleotide+exchange+factors+of+Hsp70+molecular+chaperones.">The nucleotide exchange factors of Hsp70 molecular chaperones.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 2, (2015).</li><li>Nillegoda, N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+HSP70+co-chaperone+complex+unlocks+metazoan+protein+disaggregation.">Crucial HSP70 co-chaperone complex unlocks metazoan protein disaggregation.</a> Nature. 524 (7564), 247-251 (2015).</li><li>Nillegoda, N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+an+intricate+J-protein+network+driving+protein+disaggregation+in+eukaryotes.">Evolution of an intricate J-protein network driving protein disaggregation in eukaryotes.</a> Elife. 6, (2017).</li><li>Kirstein, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+properties+of+the+disaggregase+function+of+J-proteins+and+Hsc70+in+Caenorhabditis+elegans+stress+and+aging.">In vivo properties of the disaggregase function of J-proteins and Hsc70 in Caenorhabditis elegans stress and aging.</a> Aging Cell. 16 (6), 1414-1424 (2017).</li><li>Nillegoda, N. B., Wentink, A. S., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Disaggregation+in+multicellular+organisms.">Protein Disaggregation in multicellular organisms.</a> Trends in Biochemical Sciences. 43 (4), 285-300 (2018).</li><li>Chae, C., Sharma, S., Hoskins, J. R., Wickner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CbpA,+a+DnaJ+homolog,+is+a+DnaK+co-chaperone,+and+its+activity+is+modulated+by+CbpM.">CbpA, a DnaJ homolog, is a DnaK co-chaperone, and its activity is modulated by CbpM.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (32), 33147-33153 (2004).</li><li>Kityk, R., Kopp, J., Mayer, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Mechanism+of+J-domain-Triggered+ATP+Hydrolysis+by+Hsp70+Chaperones.">Molecular Mechanism of J-domain-Triggered ATP Hydrolysis by Hsp70 Chaperones.</a> Molecular Cell. 69 (2), 227-237 (2018).</li><li>S&#246;derberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+proteins+and+their+interactions+in+cells+and+tissues+using+the+in+situ+proximity+ligation+assay.">Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay.</a> Methods. 45 (3), 227-232 (2008).</li><li>Benschop, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+consensus+of+core+protein+complex+compositions+for+Saccharomyces+cerevisiae.">A consensus of core protein complex compositions for Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular Cell. 38 (6), 916-928 (2010).</li><li>Jung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+RNA-protein+interactions+in+situ+using+modified-MTRIPs+and+proximity+ligation.">Quantifying RNA-protein interactions in situ using modified-MTRIPs and proximity ligation.</a> Nucleic Acids Research. 41 (1), (2013).</li><li>Mocanu, M. M., V&#225;radi, T., Sz&#246;llosi, J., Nagy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+(FRET)+and+proximity+ligation+assay+(PLA).">Comparative analysis of fluorescence resonance energy transfer (FRET) and proximity ligation assay (PLA).</a> Proteomics. 11 (10), 2063-2070 (2011).</li><li>Sekar, R. B., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+resonance+energy+transfer+(FRET)+microscopy+imaging+of+live+cell+protein+localizations.">Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations.</a> Journal of Cell Biology. 160 (5), 629-633 (2003).</li><li>Deriziotis, P., Graham, S. A., Estruch, S. B., Fisher, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+protein-protein+interactions+in+live+cells+using+bioluminescence+resonance+energy+transfer.">Investigating protein-protein interactions in live cells using bioluminescence resonance energy transfer.</a> Journal of Visualized Experiments. 87, (2014).</li><li>Nagy, P., Sz&#246;llosi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+or+no+proximity:+that+is+the+question+&#8211;+but+the+answer+is+more+complex.">Proximity or no proximity: that is the question &#8211; but the answer is more complex.</a> Cytometry. 75 (10), 813-815 (2009).</li><li>Hoetelmans, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+acetone,+methanol,+or+paraformaldehyde+on+cellular+structure,+visualized+by+reflection+contrast+microscopy+and+transmission+and+scanning+electron+microscopy.">Effects of acetone, methanol, or paraformaldehyde on cellular structure, visualized by reflection contrast microscopy and transmission and scanning electron microscopy.</a> Applied Immunohistochemistry &amp; Molecular Morphology. 9 (4), 346-351 (2001).</li><li>Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunolabeling+artifacts+and+the+need+for+live-cell+imaging.">Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging.</a> Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).</li><li>Stadler, C., Skogs, M., Brismar, H., Uhlen, M., Lundberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+fixation+protocol+for+proteome-wide+immunofluorescence+localization+studies.">A single fixation protocol for proteome-wide immunofluorescence localization studies.</a> Journal of Proteomics. 73 (6), 1067-1078 (2010).</li><li>Goldenthal, K. L., Hedman, K., Chen, J. W., August, J. T., Willingham, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postfixation+detergent+treatment+for+immunofluorescence+suppresses+localization+of+some+integral+membrane+proteins.">Postfixation detergent treatment for immunofluorescence suppresses localization of some integral membrane proteins.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 33 (8), 813-820 (1985).</li><li>Schrader, M., Almeida, M., Grille, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postfixation+detergent+treatment+liberates+the+membrane+modelling+protein+Pex11beta+from+peroxisomal+membranes.">Postfixation detergent treatment liberates the membrane modelling protein Pex11beta from peroxisomal membranes.</a> Histochemistry &amp; Cell Biology. 138 (3), 541-547 (2012).</li><li>Willingham, M. C., Yamada, S. S., Pastan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+antibody+localization+of+alpha2-macroglobulin+in+membrane-limited+vesicles+in+cultured+cells.">Ultrastructural antibody localization of alpha2-macroglobulin in membrane-limited vesicles in cultured cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (9), 4359-4363 (1978).</li><li>Aguilar-Uscanga, B., Francois, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+of+the+yeast+cell+wall+composition+and+structure+in+response+to+growth+conditions+and+mode+of+cultivation.">A study of the yeast cell wall composition and structure in response to growth conditions and mode of cultivation.</a> Letters in Applied Microbiology. 37 (3), 268-274 (2003).</li><li>Romaniuk, J. A., Cegelski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+cell+wall+composition+and+the+influence+of+antibiotics+by+cell-wall+and+whole-cell+NMR.">Bacterial cell wall composition and the influence of antibiotics by cell-wall and whole-cell NMR.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370, 1679 (2015).</li><li>Salazar, O., Asenjo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+lysis+of+microbial+cells.">Enzymatic lysis of microbial cells.</a> Biotechnology Letters. 29 (7), 985-994 (2007).</li><li>Cunningham, A. F., Spreadbury, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterial+stationary+phase+induced+by+low+oxygen+tension:+cell+wall+thickening+and+localization+of+the+16-kilodalton+alpha-crystallin+homolog.">Mycobacterial stationary phase induced by low oxygen tension: cell wall thickening and localization of the 16-kilodalton alpha-crystallin homolog.</a> Journal of Bacteriology. 180 (4), 801-808 (1998).</li><li>Werner-Washburne, M., Braun, E., Johnston, G. C., Singer, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stationary+phase+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Stationary phase in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiological Reviews. 57 (2), 383-401 (1993).</li></ol>

Co-immunoprecipitation och co-lokalisering baserade metoder har använts som långvariga metoder för att karakterisera protein assembler. Upptäckten av transitivt bildade specifika förkläde komplex är en stor utmaning med sådana konventionella metoder, och som ett resultat, tidigare fynd är till stor del begränsad till kvalitativa tolkningar. Den cell lysis-baserade Co-immunoprecipitation tekniker kräver ofta cross-linking att stabilisera protein-protein interaktioner. Cell Lys ökar risken för att störa tran...

En stor mängd genomisk information förblir oöversättliga på grund av vår ofullständiga förståelse av cellulära interactomes. Konventionella protein-protein interaktion detektionsmetoder såsom protein Co-immunoprecipitation med/utan kemisk tvärbindning och protein Co-lokalisering, men ofta används, utgör en rad nackdelar. Några av de största nackdelarna är dålig kvantifiering av interaktioner och potentiella införandet av icke-Native bindande händelser. I jämförelse, framväxande närhets-baserade tekniker ger ett alternativ och en kraftfull metod för att fånga proteininteraktioner i celler. Proximity ligering assay (PLA)1, som nu finns som ett egenutvecklat kit, använder antikroppar för att specifikt rikta proteinkomplex baserat på närheten av de samverkande subenheterna.
PLA initieras av bildandet av en byggnadsställning bestående av primära och sekundära antikroppar med små DNA-Taggar (PLA sonder) på ytan av det riktade protein komplexet (figur 1, steg 1-3). Nästa, bestäms av närheten av DNA-taggar, en cirkulär DNA-molekyl genereras via hybridisering med kontakt oligonukleotides (figur 1, steg 4). Bildandet av cirkulär DNA kompletteras av ett DNA ligeringsteg. Den nybildade cirkulära bit av DNA fungerar som en mall för den efterföljande rullande cirkel amplifiering (RCA)-baserade polymeras kedjereaktion (PCR) Primas av en av de konjugerade oligonukleotide taggar. Detta genererar en enkelsträngad concatemeric DNA-molekyl fäst vid protein komplexet via antikropps ställningen (figur 1, steg 6). Den concatemeric DNA-molekylen visualiseras med hjälp av fluorescerande märkta oligonukleotides som hybridiserar till flera unika sekvenser spridda över det förstärkta DNA (figur 1, steg 7)2. Den genererade PLA-signalen, som visas som en fluorescerande punkt (figur 1, steg 7), motsvarar placeringen av det riktade protein komplexet i cellen. Som ett resultat, analysen kunde upptäcka proteinkomplex med hög spatial noggrannhet. Tekniken är inte begränsad till att helt enkelt fånga proteininteraktioner, men kan också utnyttjas för att upptäcka enstaka molekyler eller proteinmodifieringar på proteiner med hög känslighet1,2.
Hsp70 bildar en mycket mångsidig förkläde system fundamentalt viktigt för att upprätthålla cellulära protein homeostas genom att delta i en rad hushållning och stressrelaterade funktioner. Housekeeping aktiviteter av Hsp70 förkläde systemet inkluderar de Novo proteinvikning, protein flyttning över cellulära membran, montering och demontering av proteinkomplex, reglering av protein aktivitet och länka olika protein Folding/ kvalitetskontroll maskiner3. Samma förkläde systemet refolds också felvikt/vecklade proteiner, förhindrar protein aggregation, främjar protein uppdelning och samarbetar med cellulära proteaser för att försämra oboskt missvecklade/skadade proteiner för att underlätta cellulära reparation efter proteotoxiska spänningar4,5. För att uppnå denna funktionella mångfald, den Hsp70 förkläde förlitar sig på samarbetar Co-Chaperones av JDP familjen och nukleotid utbyta faktorer (Nefs) att finjustera Hsp70's ATP-beroende Alloster kontroll av substrat bindning och release3, 6. Vidare, JDP Co-Chaperones spela en viktig roll i valet av substrat för denna mångsidiga förkläde systemet. Medlemmarna i denna familj är indelade i tre klasser (A, B och C) baserat på deras strukturella homologi till prototypen JDP, E. coli dnaj. Klass A JDPs innehåller en N-Terminal J-domän, som samverkar med Hsp70, en glycin-fenylalanin rik region, ett substrat bindande region bestående av en zink finger-liknande region (ZFLR) och två β-Barrel domäner, och en C-Terminal Dimerization domän. JDPs med en N-Terminal J-domän och en glycin-fenylalanin rik region, men saknar ZFLR, falla i klass B. I allmänhet är medlemmar i dessa två klasser inblandade i chaperoning funktioner. Medlemmar som omfattas av catchall klass C, som innehåller JDPs att endast dela J-domän4, rekrytera Hsp70s att utföra en mängd icke-chaperoning funktioner. Den viktiga roll JDPs som utbytbara substrat erkännande "adaptrar" av Hsp70 systemet återspeglas av en utvidgning av familjemedlemmar under evolutionen. Till exempel har människor över 42 distinkta JDP medlemmar4. Dessa jdps fungerar som monomerer, homodimers och/eller homo/hetero oligomerer4,5. Nyligen, ett funktionellt samarbete via övergående komplex formation mellan klass A (t. ex., H. sapiens DNAJA2; S. cerevisiae Ydj1) och klass B (t. ex., H. sapiens DNAJB1; S. cerevisiae Sis1) eukaryotisk jdps rapporterades att främja ett effektivt erkännande av amorfa protein aggregat in vitro-7,8. Dessa blandade klass JDP komplex förmodligen samlas på ytan av aggregerade proteiner för att underlätta bildandet av Hsp70-och Hsp70 + Hsp100-baserade protein disaggregas7,8,9, 10. den kritiska bevisningen för att stödja förekomsten av dessa transitivt bildade blandad klass JDP-komplex i eukaryota celler TILLHANDAHÖLLS med PLA8.
PLA är alltmer anställd för att bedöma proteininteraktioner i Metazoa, främst i däggdjursceller. Här rapporterar vi en lyckad expansion av denna teknik för att övervaka transitivt bildade förkläde komplex i eukaryota och prokaryota encelliga organismer som spirande jäst S. cerevisiae och bakterien E. coli. Viktigt, denna expansion belyser den potentiella användningen av PLA att upptäcka och analysera mikrober som infekterar mänskliga och animaliska celler.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>37% Formaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>103999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-DNAJA2 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab157216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-DNAJB1 Antibody</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ADI-SPA-450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-DnaK antibody</td>
			<td>In house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mCherry antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab125096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Sis1 Antibody</td>
			<td>Cosmo Bio Corp</td>
			<td>COP-080051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Ydj1 antibody</td>
			<td>StressMarq Biosciences</td>
			<td>&#160;SMC-150,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-YFP antibody</td>
			<td>In house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin slide-staining jar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diagnostic slides</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>1216530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink In Situ Detection Reagents Orange</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink In Situ Mounting Medium + DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink In Situ Wash Buffers, Fluorescence</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>62971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P47-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorbitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>25300096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymolase 100T / / Lyticase</td>
			<td>United States Biological</td>
			<td>Z1004</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ monitoring of transiently formed molecular chaperone assemblies in bacteria, yeast, and human cells

J-Domain proteiner (JDPs) utgör den största och mest varierande Co-Chaperone familjen i eukaryotiska celler. De senaste rönen visar att specifika medlemmar av JDP-familjen kan bilda transienta heterokomplex hos Eukaryoter för att finjustera substrat valet för 70 kDa-värmechockprotein (HSP70) chaperonbaserat protein disaggregas. Den JDP komplex mål akut/kronisk stress inducerade aggregerade proteiner och förmodligen hjälpa till att montera disaggregas genom att rekrytera flera Hsp70s till ytan av protein aggregat. Omfattningen av den protein Quality Control (PQC) nätverk som bildas av dessa fysiskt samverkande JDPs fortfarande i stort sett okarakteriserad in vivo. Här beskriver vi en mikroskopi-baserad in situ protein interaktionsanalys som heter Proximity ligering assay (PLA), som kan kraftfullt fånga dessa transitivt bildade förkläde komplex i olika cellulära avdelningar av eukaryota celler. Vårt arbete utökar sysselsättningen av PLA från mänskliga celler till jäst (Saccharomyces cerevisiae) och bakterier (Escherichia coli), vilket gör ett viktigt verktyg för att övervaka dynamiken i transitivt bildade protein sammansättningar i både prokaryotika och eukaryotiska celler.

Våra tidigare in vitro-studier med renade proteiner visade att en delmängd av Human klass A och klass B JDPs bildar övergående blandade klass JDP-komplex för att effektivt kunna rikta ett brett spektrum av aggregerade proteiner och möjligen underlätta monteringen av Hsp70-baserade protein disaggregas7. Vi använde PLA för att avgöra om blandad klass (A + B) JDP komplex förekommer i mänskliga livmoderhalscancer celler (HeLa). Human JDPs DNAJA2 (klass A) och DNAJB1 (klass B) riktades mot ...

Watch this Scientific Journal Video about In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells at JoVE.com

In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells

Cognate J-Domain proteiner samarbetar med Hsp70 förkläde för att hjälpa till i en myriad av biologiska processer som sträcker sig från proteinvikning till nedbrytning. Här beskriver vi en in situ närhet ligering assay, som gör det möjligt att övervaka dessa transitivt bildade förkläde maskiner i bakteriell, jäst och mänskliga celler.

In situ övervakning av transitivt bildade molekylär Chaperone församlingar i bakterier, jäst, och mänskliga celler

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the ...

Denna metod fångar övergående protein interaktioner i organismer som bakterier och jäst och i olika celltyper. Här övervakar vi transiently bildade specifika förkläde komplex som är involverade i cellulära proteostas. Den största fördelen med denna teknik är förmågan att generera information om dynamik och sub-cellulära lokalisering av protein församlingar i prokaryota och eukaryota celler.Anpassningar av denna teknik i encelliga organismer som bakterier och jäst, tillåter forskare att använda det som ett kraftfullt verktyg för att undersöka sjukdomar relaterade till mikrobiella infektioner. Denna teknik skulle kunna användas för att analysera protein interaktioner i nästan alla organismer genom att helt enkelt ändra villkoren vid provet förberedelse fasen av protokollet. Det är viktigt att välja ut antikroppar av god kvalitet som är specifika och testade i antingen immunohistokemi, immunofluorescens, ELISA eller immunoprecipitations.Börja med att förbehandlar 10-väl diagnostiska diabilder med poly-L-Lysin. Tillsätt 100 mikroliter av sterila och filtrerade 0,0001%poly-L-Lysine till varje brunn, och inkubera objektglasen i 30 minuter i en steril laminär flödeshuva. Sedan, tvätta varje brunn med 50 mikroliter sterilt vatten för att avlägsna överskott poly-L-Lysin.Tillsätt ungefär 15, 000 celler per brunn beroende på celltyp, och odla cellerna i en steril fuktig inkubator vid 37 grader Celsius med 5%koldioxid till en 60 till 80%konfluency. Efter 24 timmar, ta bort tillväxtmediet genom att placera ett mjukpapper vid kanten av varje brunn, och tvätta cellerna tre gånger med 50 mikroliter PBS. Sedan fixa cellerna genom att lägga till 50 mikroliter av nyberedda 4%paraformaldehyd i PBS till varje brunn och inkubera bilden vid rumstemperatur i 10 minuter.Efter fixering tvättar du bilden tre gånger genom att dränka ned objektglaset i en glidfärgningsburk med PBS. För att permeabilisera membranen i de bifogade cellerna, submerge bilden i 100 milliliter av 0,5%Triton-X100 i PBS, och inkubera cellerna i 10 minuter vid rumstemperatur. Tvätta sedan diabilderna tre gånger i TBS-T.Efter den sista tvätten, ta bort överskott buffert med ett silkespapper. Odla och späd S.cerevisiae celler enligt manuskript riktningar, sedan överföra dem till en 50-milliliter centrifugrör och pellet genom centrifugering på 665 gånger g i tre minuter. Ta bort supernatanten och resuspend cellerna i fem milliliter färskt medium.Tillsätt sedan 550 mikroliter av 37%formaldehyd för en slutlig koncentration på 4%och inkubera kulturen vid rumstemperatur i 15 minuter för att fixa cellerna. Efter inkubationen, pellet cellerna, ta bort supernatanten, och resuspend pelleten i en milliliter av nyberedd 4%paraformaldehyd i tvättbuffert. Inkubera cellerna i rumstemperatur i 45 minuter.Under tiden, förbereda diagnostiska diabilder genom att lägga till 100 mikroliter av 0,0001%poly-L-Lysinlösning till varje brunn och inkubera bilderna i 30 minuter vid rumstemperatur. Tvätta sedan bort överskottet poly-L-Lysin med ultrarent vatten och låt rutschkanorna lufttorka. Efter inkubationssteget tvättar du cellerna två gånger med en milliliter tvättbuffert genom centrifuger.Ta bort supernatanten och resuspend cellerna i tvättbuffert. Pellet cellerna efter den sista tvätten, och ta bort supernatanten och resuspend cellerna i en milliliter tvättbuffert som innehåller 1,2 molar sorbitol. För att smälta cellväggen, pellet cellerna igen och återanvända cellerna i 250 mikroliter av nyberedda Lyticase lösning.Inkubera cellerna i 30 grader Celsius i 15 minuter med försiktig skakning. Efter matsmältningen steg, tvätta cellerna tre gånger i tvätt buffert och resuspend cellerna i 250 mikroliter av tvätt buffert som innehåller 1,2 molar sorbitol. Tillsätt 20 mikroliter av åter upphängda celler till varje poly-L-Lysinbelagd brunn, och låt de fasta och permeabiliserade cellerna att fästa i 30 minuter.Tvätta brunnarna tre gånger med 50 mikroliter av tvättbuffert för att avlägsna icke-vidhäftande celler, och fortsätt med närhetsaligeringsanalysen. Initiera närhetsligeringsanalysen, eller PLA-protokollet, genom att lägga till en droppe av blockeringsbufferten till varje brunn och inkubera bilden i en fuktig kammare i 30 minuter vid 37 grader Celsius. Ta bort blockeringsbufferten genom att placera ett mjukpapper vid kanten av varje brunn, och tvätta cellerna två gånger i 100 milliliter tvättbuffert A.Next, tillsätt 40 mikroliter av den primära antikroppslösningen till varje brunn och inkubera glidglaset i 60 minuter vid 37 grader Celsius i en fuktig kammare.Ta bort den primära antikroppslösningen och tvätta objektglasen två gånger i tvättbuffert A.Efter tvätten, tillsätt 40 mikroliter av den sekundära antikroppslösningen till varje brunn och inkubera objektglaset i 60 minuter vid 37 grader Celsius i en fuktig kammare. Ta sedan bort lösningen och tvätta objektglasen två gånger i tvättbuffert A.Tillsätt sedan 40 mikroliter av DNA-ligeringsblandningen som innehåller kontakten oligonukleotider och DNA-ligase, till varje brunn, och inkubera glidbanan i den fuktiga kammaren i 37 grader Celsius i 30 minuter. Efter inkubationen, ta bort ligering blandningen och tvätta objektglasen två gånger med tvätt buffert A.Lägg 40 mikroliter av DNA-amplifiering blandning som innehåller DNA-polymeras och fluorescently märkta oligonukleotider till varje brunn, och inkubera i 100 minuter i den fuktiga kammaren vid 37 grader Celsius.Ta bort förstärkningsblandningen och tvätta objektglasen i 100 milliliter tvättbuffert B i 10 minuter per tvätt. Tvätta sedan rutschkanorna i 100 milliliter tvättbuffert B utspädd en till 100 i ultrarent vatten. Tillsätt 20 mikroliter av DAPI-innehållande monteringsmedium per brunn.Täck brunnarna i bilden med en täcksli och tätning med nagellack. Detta protokoll användes framgångsrikt för att övervaka transienta förkläde församlingar bildas mellan distinkta J-domän proteiner och Hsp70 förkläde och J-domän proteiner i HeLa, S.cerevisiae och E.coli celler. Human klass A och klass B J-domän proteiner var riktade med mycket specifika primära antikroppar.Var och en av de röda fluorescerande puncti representerar ett protein komplex bildas mellan två distinkta J-domän proteiner i HeLa celler. Liknande blandklass J-domän proteinkomplex observeras också i den encelliga eukaryot S.cerevisiae, eller bagarjäst. Några av de fluorescerande puncti genereras från PLA var svårare att lösa som enskilda högborgar, på grund av den lilla cellen storlek.Komplex bildning mellan proteinerna klass A och B J- domän observerades inte i E.coli-celler, vilket är förenligt med biokemiska studier som utförts med renade proteiner. Men andra förkläde församlingar med J-domän proteiner och Hsp70 förkläde fångades med hjälp av PLA protokollet. Tekniska kontroller saknas en primär antikropp mot en av de interagerande J-domän proteiner eller förkläde i den annars fullständiga PLA reaktioner visade liten eller ingen fluorescens puncti formation i cellerna, vilket tyder på en brist på falsk positiv signal förstärkning.För att få tillförlitliga resultat med hjälp av närhets ligatur analysen, kontrollera i förväg att de antikroppar som används är av tillräcklig kvalitet. Vidare, vidta försiktighetsåtgärder för att undvika över-matsmältning av celler som innehåller en cellvägg.

Research

JoVE Journal

Biology

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

En fluorescensmikroskopi-analys för övervakning Mitophagy i jästen Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Långsiktig Dödligt toxicitetstest med Crustacean Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

Omprogrammering Mänskliga somatiska celler in i inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) Använda retroviral vektor med GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualisering och analys av mRNA-molekyler användning av fluorescens<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Effektiv Generation Human inducerade pluripotenta stamceller från mänskliga somatiska celler med Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Profilering individuella mänskliga embryonala stamceller genom kvantitativ RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Högupplöst time-lapse avbildning och automatiserad analys av mikrotubuli Dynamics i Living Human navelsträngsvenendotelceller

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

Spatiotemporal Analys av Cytokinetic händelser i fissionsjäst

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

En grafisk användargränssnitt för programvaruassisterad spårning av proteinkoncentration i dynamiska cellulära protrusioner

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

A Simple Fluorescence-based Reporter Assay to Identify Cellular Components Required for Ricin Toxin A Chain (RTA) Trafficking in Yeast

A Simple Fluorescence-based Reporter Assay to Identify Cellular Components Required for Ricin Toxin A Chain RTA Trafficking in Yeast

En enkel fluorescens-baserade Reporter analysen identifiera cellulära komponenter krävs för Ricin Toxin en kedja (RTA) handel med jäst

Bacterial and plant A/B toxins exploit the natural trafficking pathways in eukaryotic cells to reach their intracellular target(s) in the cytosol and to ...