Name: in situ monitoring of transiently formed molecular chaperone assemblies in bacteria, yeast, and human cells
Uploaded: 2019-09-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells at JoVE.com

NBN Victoria Devlet Hükümeti ve Avustralya Hükümeti finansmanı ile Monash Üniversitesi Tıp Hemşireliği ve Sağlık Bilimleri Fakültesi özel bir İşe Hibe tarafından desteklenir. Bernd Bukau (ZMBH, Heidelberg Üniversitesi, Almanya) ve Harm H. Kampinga'ya (Hücre ve Sistemler Biyomedikal Bilimler Bölümü, Groningen Üniversitesi, Hollanda) değerli destekleri ve reaktiflerin paylaşımı için teşekkür ederiz, Holger Lorenz (ZMBH) Görüntüleme Tesisi, Heidelberg Üniversitesi, Almanya) konfokal mikroskopi ve görüntü işleme ile destek için, ve Claire Hirst (ARMI, Monash Üniversitesi, Avustralya) el yazması eleştirel okuma için.

1. Hela Hücre Hazırlama
<ol><li>Aşağıdaki malzemeleri hazırlayın: PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4), pH 7.4; DMEM, %10 FCS ve %1 Pen-Strep ile desteklenmiştir; PBS'de %4 paraformaldehit; PBS'de %0.5 Triton-X100; TBS-T (150 mM NaCl, 20 mM Tris, %0.05 Tween), pH 7.4; %0.0001 steril poli-L-L-Lizin çözeltisi; 10-iyi tanı slaytlar; nemli bir oda; kağıt mendil; ve Coplin slayt boyama kavanozları. NOT: Optimum fiksasyon ver...

<ol>
	<li>Soderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation.">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).</li><li>Weibrecht, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+ligation+assays:+a+recent+addition+to+the+proteomics+toolbox.">Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox.</a> Expert Review of Proteomics. 7 (3), 401-409 (2010).</li><li>Mayer, M. P., Gierasch, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+structural+and+mechanistic+aspects+of+Hsp70+molecular+chaperones.">Recent advances in the structural and mechanistic aspects of Hsp70 molecular chaperones.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (6), 2085-2097 (2019).</li><li>Kampinga, H. H., Craig, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HSP70+chaperone+machinery:+J+proteins+as+drivers+of+functional+specificity.">The HSP70 chaperone machinery: J proteins as drivers of functional specificity.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (8), 579-592 (2010).</li><li>Nillegoda, N. B., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metazoan+Hsp70-based+protein+disaggregases:+emergence+and+mechanisms.">Metazoan Hsp70-based protein disaggregases: emergence and mechanisms.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 2, (2015).</li><li>Bracher, A., Verghese, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nucleotide+exchange+factors+of+Hsp70+molecular+chaperones.">The nucleotide exchange factors of Hsp70 molecular chaperones.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 2, (2015).</li><li>Nillegoda, N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+HSP70+co-chaperone+complex+unlocks+metazoan+protein+disaggregation.">Crucial HSP70 co-chaperone complex unlocks metazoan protein disaggregation.</a> Nature. 524 (7564), 247-251 (2015).</li><li>Nillegoda, N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+an+intricate+J-protein+network+driving+protein+disaggregation+in+eukaryotes.">Evolution of an intricate J-protein network driving protein disaggregation in eukaryotes.</a> Elife. 6, (2017).</li><li>Kirstein, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+properties+of+the+disaggregase+function+of+J-proteins+and+Hsc70+in+Caenorhabditis+elegans+stress+and+aging.">In vivo properties of the disaggregase function of J-proteins and Hsc70 in Caenorhabditis elegans stress and aging.</a> Aging Cell. 16 (6), 1414-1424 (2017).</li><li>Nillegoda, N. B., Wentink, A. S., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Disaggregation+in+multicellular+organisms.">Protein Disaggregation in multicellular organisms.</a> Trends in Biochemical Sciences. 43 (4), 285-300 (2018).</li><li>Chae, C., Sharma, S., Hoskins, J. R., Wickner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CbpA,+a+DnaJ+homolog,+is+a+DnaK+co-chaperone,+and+its+activity+is+modulated+by+CbpM.">CbpA, a DnaJ homolog, is a DnaK co-chaperone, and its activity is modulated by CbpM.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (32), 33147-33153 (2004).</li><li>Kityk, R., Kopp, J., Mayer, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Mechanism+of+J-domain-Triggered+ATP+Hydrolysis+by+Hsp70+Chaperones.">Molecular Mechanism of J-domain-Triggered ATP Hydrolysis by Hsp70 Chaperones.</a> Molecular Cell. 69 (2), 227-237 (2018).</li><li>S&#246;derberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+proteins+and+their+interactions+in+cells+and+tissues+using+the+in+situ+proximity+ligation+assay.">Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay.</a> Methods. 45 (3), 227-232 (2008).</li><li>Benschop, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+consensus+of+core+protein+complex+compositions+for+Saccharomyces+cerevisiae.">A consensus of core protein complex compositions for Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular Cell. 38 (6), 916-928 (2010).</li><li>Jung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+RNA-protein+interactions+in+situ+using+modified-MTRIPs+and+proximity+ligation.">Quantifying RNA-protein interactions in situ using modified-MTRIPs and proximity ligation.</a> Nucleic Acids Research. 41 (1), (2013).</li><li>Mocanu, M. M., V&#225;radi, T., Sz&#246;llosi, J., Nagy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+(FRET)+and+proximity+ligation+assay+(PLA).">Comparative analysis of fluorescence resonance energy transfer (FRET) and proximity ligation assay (PLA).</a> Proteomics. 11 (10), 2063-2070 (2011).</li><li>Sekar, R. B., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+resonance+energy+transfer+(FRET)+microscopy+imaging+of+live+cell+protein+localizations.">Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations.</a> Journal of Cell Biology. 160 (5), 629-633 (2003).</li><li>Deriziotis, P., Graham, S. A., Estruch, S. B., Fisher, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+protein-protein+interactions+in+live+cells+using+bioluminescence+resonance+energy+transfer.">Investigating protein-protein interactions in live cells using bioluminescence resonance energy transfer.</a> Journal of Visualized Experiments. 87, (2014).</li><li>Nagy, P., Sz&#246;llosi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+or+no+proximity:+that+is+the+question+&#8211;+but+the+answer+is+more+complex.">Proximity or no proximity: that is the question &#8211; but the answer is more complex.</a> Cytometry. 75 (10), 813-815 (2009).</li><li>Hoetelmans, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+acetone,+methanol,+or+paraformaldehyde+on+cellular+structure,+visualized+by+reflection+contrast+microscopy+and+transmission+and+scanning+electron+microscopy.">Effects of acetone, methanol, or paraformaldehyde on cellular structure, visualized by reflection contrast microscopy and transmission and scanning electron microscopy.</a> Applied Immunohistochemistry &amp; Molecular Morphology. 9 (4), 346-351 (2001).</li><li>Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunolabeling+artifacts+and+the+need+for+live-cell+imaging.">Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging.</a> Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).</li><li>Stadler, C., Skogs, M., Brismar, H., Uhlen, M., Lundberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+fixation+protocol+for+proteome-wide+immunofluorescence+localization+studies.">A single fixation protocol for proteome-wide immunofluorescence localization studies.</a> Journal of Proteomics. 73 (6), 1067-1078 (2010).</li><li>Goldenthal, K. L., Hedman, K., Chen, J. W., August, J. T., Willingham, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postfixation+detergent+treatment+for+immunofluorescence+suppresses+localization+of+some+integral+membrane+proteins.">Postfixation detergent treatment for immunofluorescence suppresses localization of some integral membrane proteins.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 33 (8), 813-820 (1985).</li><li>Schrader, M., Almeida, M., Grille, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postfixation+detergent+treatment+liberates+the+membrane+modelling+protein+Pex11beta+from+peroxisomal+membranes.">Postfixation detergent treatment liberates the membrane modelling protein Pex11beta from peroxisomal membranes.</a> Histochemistry &amp; Cell Biology. 138 (3), 541-547 (2012).</li><li>Willingham, M. C., Yamada, S. S., Pastan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+antibody+localization+of+alpha2-macroglobulin+in+membrane-limited+vesicles+in+cultured+cells.">Ultrastructural antibody localization of alpha2-macroglobulin in membrane-limited vesicles in cultured cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (9), 4359-4363 (1978).</li><li>Aguilar-Uscanga, B., Francois, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+of+the+yeast+cell+wall+composition+and+structure+in+response+to+growth+conditions+and+mode+of+cultivation.">A study of the yeast cell wall composition and structure in response to growth conditions and mode of cultivation.</a> Letters in Applied Microbiology. 37 (3), 268-274 (2003).</li><li>Romaniuk, J. A., Cegelski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+cell+wall+composition+and+the+influence+of+antibiotics+by+cell-wall+and+whole-cell+NMR.">Bacterial cell wall composition and the influence of antibiotics by cell-wall and whole-cell NMR.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370, 1679 (2015).</li><li>Salazar, O., Asenjo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+lysis+of+microbial+cells.">Enzymatic lysis of microbial cells.</a> Biotechnology Letters. 29 (7), 985-994 (2007).</li><li>Cunningham, A. F., Spreadbury, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterial+stationary+phase+induced+by+low+oxygen+tension:+cell+wall+thickening+and+localization+of+the+16-kilodalton+alpha-crystallin+homolog.">Mycobacterial stationary phase induced by low oxygen tension: cell wall thickening and localization of the 16-kilodalton alpha-crystallin homolog.</a> Journal of Bacteriology. 180 (4), 801-808 (1998).</li><li>Werner-Washburne, M., Braun, E., Johnston, G. C., Singer, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stationary+phase+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Stationary phase in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiological Reviews. 57 (2), 383-401 (1993).</li></ol>

Ko-immünoprepitasyon ve ko-lokalizasyon aparatlarına dayalı yaklaşımlar, protein birliğini karakterize etmek için uzun süreli yöntemler olarak kullanılmıştır. Geçici olarak oluşturulmuş özel şaperon komplekslerinin saptanması bu tür geleneksel yöntemlerle büyük bir sorundur ve sonuç olarak, önceki bulgular büyük ölçüde nitel yorumlamalarla sınırlıdır. Hücre lisis tabanlı koimmünopremteknikleri genellikle protein-protein etkileşimlerini stabilize etmek için çapraz bağlantı gerekti...

Hücresel etkileşimleri tam olarak anlamamız nedeniyle büyük miktarda genomik bilgi yorumlanabilir. Yaygın olarak kullanılmasına rağmen, kimyasal çapraz bağlantı ve protein ko-lokalizasyonu olmayan protein ko-immünopresidipitasyonu gibi geleneksel protein-protein etkileşim isaptama metodolojileri bir dizi dezavantaj teşkil eder. Bazı ana dezavantajları etkileşimleri kötü nicelleştirme ve olmayan yerli bağlayıcı olayların potansiyel giriş içerir. Buna karşılık, gelişmekte olan yakınlık tabanlı teknikler hücrelerde protein etkileşimleri yakalamak için bir alternatif ve güçlü bir yaklaşım sağlar. Yakınlık ligasyon test (PLA)1, şimdi özel bir kit olarak kullanılabilir, özellikle etkileşimalt birimlerinin yakınlığına dayalı protein kompleksleri hedef antikorlar kullanır.
PLA, hedeflenen protein kompleksinin yüzeyinde küçük DNA etiketleri (PLA probları) bulunan primer ve sekonder antikorlardan oluşan bir iskele nin oluşumu ile başlatılır (Şekil1, adım 1-3). Daha sonra, DNA etiketlerinin yakınlığı ile belirlenen dairesel bir DNA molekülü konektör oligonükleotidlerle melezleme yoluyla oluşturulur (Şekil1, adım 4). Dairesel DNA'nın oluşumu bir DNA ligasyon adımı ile tamamlanır. DNA'nın yeni oluşan dairesel parçası sonraki haddeleme daire amplifikasyon için bir şablon olarak hizmet vermektedir (RCA)tabanlı polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) konjuge oligonükleotid etiketleri biri tarafından astarlanmış. Bu, antikor iskelesi aracılığıyla protein kompleksine bağlı tek iplikli konkatemerik bir DNA molekülü oluşturur (Şekil1, adım 6). Concatemeric DNA molekülü, yükseltilmiş DNA'ya dağılmış birden fazla benzersiz diziyle melezleşen floresan etiketli oligonükleotidler kullanılarak görselleştirilmiştir (Şekil1, adım 7)2. Floresan nokta (Şekil1, adım 7) olarak görünen üretilen PLA sinyali, hedeflenen protein kompleksinin hücredeki konumuna karşılık gelir. Sonuç olarak, titretisi protein komplekslerini yüksek mekansal doğrulukla tespit edebilir. Teknik sadece protein etkileşimleri yakalama ile sınırlı değildir, ama aynı zamanda yüksek duyarlılık1,2ile proteinler üzerinde tek moleküller veya protein değişiklikleri tespit etmek için kullanılabilir .
Hsp70, bir dizi temizlik ve stresle ilişkili fonksiyonlara katılarak hücresel protein homeostazını korumak için temelde çok yönlü bir şaperon sistemi oluşturur. Hsp70 şaperon sisteminin temizlik faaliyetleri arasında de novo protein katlama, hücre zarları arasında protein translokasyonu, protein komplekslerinin biraraya toplanması ve disassemblyasyonu, protein aktivitesinin düzenlenmesi ve farklı protein katlamalarının bağlanması/ kalite kontrol makineleri3. Aynı şaperon sistemi aynı zamanda yanlış katlanmış/açılmamış proteinleri yeniden katar, protein agregasyonunu önler, protein ayrıştırmasını teşvik eder ve hücresel proteazlarla işbirliği ederek hücresel onarımı kolaylaştırmak için ölümcül olarak yanlış katlanmış/hasarlı proteinleri bozar. proteotoksik gerilmeler4,5. Bu işlevsel çeşitliliği elde etmek için, Hsp70 şaperon JDP ailesinin eş-şaperonları ve substrat bağlama veserbest3 Hsp70's ATP bağımlı allosteric kontrolü ince ayar nükleotid değişim faktörleri (NEFs) ortaklık dayanır 6 . Ayrıca, JDP eş-şaperonlar bu çok yönlü şaperon sistemi için substrat seçiminde hayati bir rol oynamaktadır. Bu ailenin üyeleri prototip JDP, E. coli DnaJ kendi yapısal homoloji dayalı üç sınıf (A, B ve C) ayrılır. A sınıfı JDO'lar, Hsp70 ile etkileşime giren Bir N-terminal J-etki alanı, glisin-fenilalanin açısından zengin bir bölge, Çinko parmak benzeri bir bölge (ZFLR) ve iki β-varil etki alanından oluşan bir substrat bağlama bölgesi ve bir C-terminal dimerizasyon etki alanı içerir. N-terminal J-etki alanı ve glisin-fenilalanin açısından zengin bir bölgeye sahip, ancak ZFLR'den yoksun JD'ler B sınıfına girerler. Genel olarak, bu iki sınıfın üyeleri refakat işlevlerinde yer almaktadır. Sadece J-etki alanı4paylaşmak JDPs içeren catchall sınıf C, altında düşen Üyeler, olmayan refakatsiz işlevleri çeşitli gerçekleştirmek için Hsp70s işe. JDP'lerin Hsp70 sisteminin değiştirilebilir substrat tanıma "adaptörleri" olarak önemli rolü, evrim sırasında aile üyelerinin genişlemesi ile yansıtılır. Örneğin, insanlar üzerinde 42 farklı JDP üyeleri4. Bu JDP'ler monomer, homodimer ve/veya homo/hetero oligomer4,5olarak işlev görür. Son zamanlarda, A sınıfı (örneğin, H. sapiens DNAJA2; S. cerevisiae Ydj1) ve B sınıfı (örneğin, H. sapiens DNAJB1; S. cerevisiae Sis1) ökaryotik JDPs in vitro agregaların verimli tanınmasını teşvik bildirilmiştir7,8. Bu karma sınıf JDP kompleksleri muhtemelen Hsp70 oluşumunu kolaylaştırmak için toplanan proteinlerin yüzeyinde biraraya- ve Hsp70 + Hsp100 tabanlı protein disaggregases7,8,9, 10. Ökaryotik hücrelerde geçici olarak oluşturulmuş bu karma sınıf JDP komplekslerinin varlığını destekleyen kritik kanıtlar PLA8ile sağlanmıştır.
PLA giderek metazoa protein etkileşimlerini değerlendirmek için istihdam edilmektedir, öncelikle memeli hücrelerinde. Burada, tomurcuklanan maya S. cerevisiae ve bakteri E. coli gibi ökaryotik ve prokaryotik tek hücreli organizmalarda geçici olarak oluşan şaperon komplekslerini izlemek için bu tekniğin başarılı bir şekilde genişlemesini rapor ediyoruz. Daha da önemlisi, bu genişleme pla'nın insan ve hayvan hücrelerini enfekte eden mikropların saptanması nda ve analizinde potansiyel kullanımını vurgulamaktadır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>37% Formaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>103999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-DNAJA2 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab157216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-DNAJB1 Antibody</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ADI-SPA-450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-DnaK antibody</td>
			<td>In house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mCherry antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab125096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Sis1 Antibody</td>
			<td>Cosmo Bio Corp</td>
			<td>COP-080051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Ydj1 antibody</td>
			<td>StressMarq Biosciences</td>
			<td>&#160;SMC-150,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-YFP antibody</td>
			<td>In house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin slide-staining jar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diagnostic slides</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>1216530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink In Situ Detection Reagents Orange</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink In Situ Mounting Medium + DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink In Situ Wash Buffers, Fluorescence</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>62971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P47-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorbitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>25300096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymolase 100T / / Lyticase</td>
			<td>United States Biological</td>
			<td>Z1004</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ monitoring of transiently formed molecular chaperone assemblies in bacteria, yeast, and human cells

J-etki proteinleri (JDP' ler) ökaryotik hücrelerdeki en büyük ve en çeşitli eş-şaperon ailesini oluşturur. Son bulgular, JDP ailesinin belirli üyelerinin ökaryotlarda 70 kDa ısı şok proteini (Hsp70) şaperon bazlı protein disaggregazları için substrat seçiminde ince ayar yapmak için geçici heterokompleksler oluşturabileceğini göstermektedir. JDP kompleksleri akut/kronik strese bağlı toplu proteinleri hedef alır ve muhtemelen protein agregalarının yüzeyine birden fazla Hsp70'i işe alarak disagregaların biraraya getirilmesine yardımcı olur. Bu fiziksel olarak etkileşen JDP'ler tarafından oluşturulan protein kalite kontrol (PQC) ağının kapsamı in vivo olarak büyük ölçüde tanımlanmamış tır. Burada, ökaryotik hücrelerin farklı hücresel bölmelerinde bu geçici olarak oluşturulmuş şaperon komplekslerini sağlam bir şekilde yakalayabilen yakınlık ligasyon analizi (PLA) adlı yerinde protein etkileşimi testinde mikroskopi tabanlı bir tanım atıyoruz. Çalışmalarımız pla istihdamını insan hücrelerinden mayaya(Saccharomyces cerevisiae)ve bakterilere(Escherichia coli)genişletir ve böylece her ikisinde de geçici olarak oluşan protein derlemelerinin dinamiklerini izlemek için önemli bir araç oluşturur. prokaryotik ve ökaryotik hücreler.

Saflaştırılmış proteinler iã§in daha Ã¶nceki in vitro Ã§alÄ±Å malarÄ±mÄ±z, insan sÄ±nÄ±fÄ± A ve B sÄ±nÄ±f JDP' lerinin bir alt kümesinin, agregaedilen proteinlerin geniÅ bir seÃ§eneÄ ini verimli bir Å efi hedeflemek ve muhtemelen Hsp70 bazlÄ± birleÅ tirmeyi kolaylaÅ tÄ±rmak iÃ§in geçici karma sÄ±nÄ±f JDP kompleksleri oluşturduÄ protein disaggregases7. Karışık sınıf (A+B) JDP komplekslerinin insan servikal kanser hücrelerinde (HeLa) oluşup olu...

Watch this Scientific Journal Video about In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells at JoVE.com

In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells

Cognate J-etki proteinleri hsp70 şaperon ile protein katlama bozulması arasında değişen biyolojik süreçler sayısız yardımcı olmak için işbirliği. Burada, bakteriyel, maya ve insan hücrelerinde geçici olarak oluşan bu şaperon makinelerinin izlenmesine olanak sağlayan bir in situ yakınlık ligasyon tetkikini tanımlıyoruz.

Bakteri, Maya ve İnsan Hücrelerinde Geçici Olarak Oluşan Moleküler Şaperon Meclislerinin Yerinde İzlenmesinde

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the ...

Bu yöntem bakteri ve maya gibi organizmalarda ve farklı hücre tiplerinde geçici protein etkileşimlerini yakalar. Burada hücresel proteostazda yer alan geçici olarak oluşturulmuş özel şaperon komplekslerini izliyoruz. Bu tekniğin en büyük avantajı prokaryotik ve ökaryotik hücrelerde protein derlemelerinin dinamiği ve hücre altı lokalizasyonu hakkında bilgi üretebilme yeteneğidir.Bakteri ve maya gibi tek hücreli organizmalarda bu tekniğin adaptasyonları, araştırmacılar mikrobiyal enfeksiyonlar ile ilgili hastalıkları araştırmak için güçlü bir araç olarak kullanmak için izin verir. Bu teknik, protokolün numune hazırlama aşamasındaki koşulları değiştirerek hemen hemen tüm organizmalardaki protein etkileşimlerini analiz etmek için potansiyel olarak kullanılabilir. İmmünhistokimya, immünfloresans, ELISA veya immünoprediyağışlarda spesifik ve test edilmiş kaliteli antikorların seçilmesi önemlidir.Poli-L-Lizin ile 10 kuyulu tanısal slaytları önceden tedavi ederek başlayın. Her kuyuya 100 mikrolitre steril ve filtrelenmiş %0.0001 poli-L-L-L-Lizin ekleyin ve slaytları steril laminar akış kaputunda 30 dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra, fazla poli-L-L-Lizin kaldırmak için steril su 50 mikrolitre ile her iyi yıkayın.Hücre tipine bağlı olarak her kuyu başına yaklaşık 15.000 hücre ekleyin ve %5 karbondioksit le 37 santigrat derecede steril nemli bir kuluçka makinesindeki hücreleri %60-80'lik bir kesişme ile büyütün. 24 saat sonra, her kuyunun kenarına bir mendil kağıt yerleştirerek büyüme ortamını çıkarın ve hücreleri 50 mikrolitre PBS ile üç kez yıkayın. Daha sonra her kuyuya PBS'de 50 mikrolitre taze hazırlanmış %4 paraformaldehit ekleyerek ve 10 dakika oda sıcaklığında kaydırağı kuluçkaya yatırarak hücreleri düzeltin.Fiksasyondan sonra, slaytı PBS ile bir slayt boyama kavanozuna batırarak slaytı üç kez yıkayın. Bağlı hücrelerin zarlarını permeabilize etmek için, pbs%0.5 Triton-X100 100 mililitre slayt batırın ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca hücreleri kuluçkaya yat. Daha sonra tbs-t slaytlar üç kez yıkayın.Son yıkamadan sonra, bir kağıt mendil ile fazla tampon kaldırın. S.cerevisiae hücrelerini el yazması talimatlara göre büyütüp seyreltin, daha sonra 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne ve pelete santrifüj ile 665 kez g'de üç dakika süreyle aktarın. Supernatant çıkarın ve taze orta beş mililitre hücreleri yeniden askıya.Daha sonra%4'lük son konsantrasyon için %37 formaldehit 550 mikrolitre ekleyin ve hücreleri düzeltmek için 15 dakika oda sıcaklığında kültürü kuluçkaya yatırın. Kuluçka sonra, hücreleri pelet, supernatant kaldırmak ve yıkama tampon taze hazırlanmış bir mililitre içinde pelet resuspend 4%paraformaldehit. Hücreleri 45 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın.Bu arada, her kuyuya %0,0001 poli-L-L-L-Lizin çözeltisi 100 mikrolitre ekleyerek ve slaytları oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırarak tanı slaytlarını hazırlayın. Daha sonra aşırı poli-L-L-Lizin'i ultra saf suyla yıkayın ve kaydırakların kurumasını bekleyin. Kuluçka adımından sonra, santrifüj ile bir mililitre yıkama tamponu ile hücreleri iki kez yıkayın.Supernatant çıkarın ve yıkama tampon hücreleri resuspend. Son yıkamadan sonra hücreleri pelet, ve supernatant kaldırmak ve yıkama tampon bir mililitre hücreleri yeniden askıya 1.2 molar sorbitol içeren. Hücre duvarını sindirmek için, hücreleri tekrar pelet ve taze hazırlanmış Lyticase çözeltisi 250 mikrolitre hücreleri yeniden askıya.Hücreleri 30 derecede 15 dakika boyunca hafifçe sallayarak kuluçkaya yatırın. Sindirim adımından sonra, yıkama tampon hücreleri üç kez yıkayın ve 1.2 molar sorbitol içeren yıkama tampon 250 mikrolitre hücreleri yeniden askıya. Her poli-L-L-Lizin kaplı iyi yeniden askıya hücreleri 20 mikrolitre ekleyin ve sabit ve permeabilized hücrelerin 30 dakika eklemek için izin.Yapışık olmayan hücreleri çıkarmak için kuyuları 50 mikrolitre yıkama tamponuyla üç kez yıkayın ve yakınlık ligasyon teşbitine devam edin. Her kuyuya blokaj tamponunun bir damlasını ekleyerek yakınlık ligasyon testini veya PLA protokolünü başlatın ve kaydırağı 37 santigrat derecede 30 dakika nemli bir odada kuluçkaya yatırın. Her kuyunun kenarına bir mendil kağıdı yerleştirerek engelleme tamponu çıkarın ve yıkama tampon A.Next 100 mililitre hücreleri iki kez yıkayın, her bir kuyuiçin birincil antikor çözeltisi 40 mikrolitre ekleyin ve nemli bir odada 37 derece santigrat slayt 60 dakika boyunca slayt kuluçka.Birincil antikor çözeltisini çıkarın ve kaydırakları yıkama tamponu A.After yıkamadan sonra, her kuyuya 40 mikrolitre ikincil antikor çözeltisi ekleyin ve kaydırağı nemli bir odada 37 derecede 60 dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra çözeltiyi çıkarın ve slaytları iki kez yıkama tamponu A.Then konektör oligonükleotid ve DNA ligaz içeren DNA ligasyon karışımının 40 mikrolitre ekleyin, her bir kuyuya, ve 30 dakika boyunca 37 santigrat derece nemli odasında slayt kuluçka. Kuluçka dan sonra, ligasyon karışımı kaldırmak ve iki kez yıkama tampon A.Add 40 dna amplifikasyon karışımı dna polimeraz ve floresan etiketli oligonükleotidler her bir kuyuya içeren mikrolitre ekleyin ve 37 santigrat derece nemli odasında 100 dakika kuluçka.Amplifikasyon karışımını çıkarın ve slaytları 100 mililitre yıkama tamponu B'de yıkama başına 10 dakika yıkayın. Daha sonra 100 mililitre yıkama tamponu B ultrasaf suda 1 ila 100 seyreltilmiş slaytlar yıkayın. Kuyu başına 20 mikrolitre DAPI içeren montaj ortamı ekleyin.Bir kapak kayma ve oje ile mühür ile slayt kuyuları kapağı. Bu protokol, HeLa, S.cerevisiae ve E.coli hücrelerinde farklı J-etki alanı proteinleri ile Hsp70 şaperon ve J-etki alanı proteinleri arasında oluşan geçici şaperon montajlarını izlemek için başarıyla kullanılmıştır. İnsan sınıfı A ve B sınıfı J-etki alanı proteinleri son derece spesifik primer antikorlarla hedeflendi.Kırmızı floresan puncti'nin her biri HeLa hücrelerinde iki farklı J-etki alanı proteini arasında oluşan bir protein kompleksini temsil eder. Benzer karışık sınıf J-etki alanı protein kompleksleri de tek hücreli ökaryot S.cerevisiae, ya da fırıncı maya gözlenir. PLA'dan üretilen floresan penktinbazıları küçük hücre büyüklüğü nedeniyle bireysel fokolarak çözülmesi daha zordu.E.coli hücrelerinde A ve B-etki alanı proteinleri arasındaki karmaşık oluşum, saflaştırılmış proteinlerle yapılan biyokimyasal çalışmalarla tutarlı olarak gözlenmemiştir. Ancak J-etki alanı proteinleri ve Hsp70 refakatçisi içeren diğer şaperon montajları PLA protokolü kullanılarak yakalandı. Aksi takdirde komple PLA reaksiyonlarında etkileşimeden J-etki alanı proteinlerinden birine karşı birincil antikor eksikliği olan teknik kontroller, hücrelerde çok az floresan puncti oluşumu nu gösterdi, yanlış pozitif sinyal amplifikasyonu eksikliğini gösteriyor.Yakınlık ligasyon testini kullanarak güvenilir sonuçlar elde etmek için, kullanılan antikorların yeterli kalitede olduğunu önceden doğrulayın. Ayrıca, bir hücre duvarı içeren hücrelerin aşırı sindirim kaçınarak önlem alın.

Research

JoVE Journal

Biology

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Maya İzleme Mitophagy Floresan Mikroskopi Testi Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Kabuklu uzun vadeli Lethal Toksisite Testi Artemia Franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

GFP Retroviral Vector kullanarak İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin (iPSCs) içine İnsan somatik hücreleri yeniden programlama

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Floresan kullanarak mRNA Moleküllerin Görselleştirme ve Analiz<em&gt; Yerinde</emIn&gt; Hibridizasyon<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Sendai-virüs ile İnsan Somatik Verimli Üretimi İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Kantitatif RT-PCR ile Bireysel İnsan Embriyonik Kök Hücreleri profilleme

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Yüksek çözünürlüklü Time-lapse Görüntüleme ve Yaşayan İnsan Umbilikal Ven Endotelyal Hücrelerinde Mikrotubul Dinamiği Otomatik Analizi

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

Fisyon Maya Cytokinetic Olayların zamanmekansal Analizi

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Dinamik Hücresel Protrüzyonlarda Protein Konsantrasyonunun Yazılım Destekli Takibi için Grafiksel Bir Kullanıcı Arayüzü

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

A Simple Fluorescence-based Reporter Assay to Identify Cellular Components Required for Ricin Toxin A Chain (RTA) Trafficking in Yeast

A Simple Fluorescence-based Reporter Assay to Identify Cellular Components Required for Ricin Toxin A Chain RTA Trafficking in Yeast

Hücresel bileşenleri tanımlamak için basit Floresans tabanlı muhabir tahlil Risin toksin için Maya ticareti bir zincir (RTA) gerekli.

Bacterial and plant A/B toxins exploit the natural trafficking pathways in eukaryotic cells to reach their intracellular target(s) in the cytosol and to ...