Name: infecting mice with malassezia spp. to study the fungus-host interaction
Uploaded: 2019-11-06T13:00:00
Duration: 6 min 19 s
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这项工作得到了瑞士苏黎世大学的支持。

本议定书所述的所有程序均根据瑞士联邦环境局（www.bafu.admin.ch）关于处理所含系统生物的法令执行。小鼠实验严格按照《瑞士动物保护法》的指导方针进行，并根据瑞士苏黎世州兽医局批准的协议（许可证号168/2018）进行。
1. 在实验室条件下种植马拉塞齐亚
注：除非另有说明，否则在室温（RT，20~25°C）下储存用于该协议的所有试剂和介质，因为较低的温度会抑制真菌生长。
<ol><li>为马拉塞齐亚的生长准备液体改性狄克逊（mDixon）介质。要制备 500 mL 的液体 mDixon 培养基，在 500 mL 蒸馏 H2O （dH2O） 中溶解 18 g 麦芽提取物、10 g 干燥牛胆、5 mL Tween-40、3 g 肽、1 mL 甘油醇和 1 mL 油酸。使用 HCl 和高压灭菌器将介质调整到 pH 6。将介质存储在 RT 上。</li>
	<li>在高压灭菌之前，将 7.5 g 琼脂添加到 500 mL mDixon 介质中，准备 mDixon 琼脂板。使用转向杆和磁性加热板进行高压灭菌后，缓慢冷却 mDixon agar，以避免介质在冷却时部分凝固。</li>
	<li>一旦琼脂冷却到50~60°C，将液体放入层流罩中的培养皿中，在RT处过夜晾干。 注：琼脂板在包装后可在4°C下储存数周，并倒置保存，以避免蒸发。</li>
	<li>根据提供者获得的指示，获得马拉塞齐亚分离和恢复马拉塞齐亚的冻干性储存。</li>
	<li>接种10 mL液体mDixon介质在无菌100 mL Erlenmeyer烧瓶与恢复的马拉塞齐亚悬浮液根据供应商获得的指示。在30°C和180 rpm 的摇动培养箱中孵育培养体。</li>
	<li>定期检查马拉塞齐亚文化的生长情况，检查奶油色和浊度的外观。生长动力学取决于马拉塞齐亚的物种和菌株，当马拉塞齐亚刚从冻干动物中恢复时，可能特别缓慢。（图1A）</li>
	<li>通过在 mDixon 介质中混合 3 个密集生长的马拉塞齐亚培养部分与无菌 99% 甘油的 1 部分，制备甘油库存。将马拉塞齐亚/甘油混合物加入无菌螺帽管，并储存在-80°C。</li>
	<li>对于体外繁殖，板马拉塞齐亚从液体培养在mDixon或从冷冻甘油股票到mDixon琼脂板（从4°C带到RT）使用接种回路。 注意：在使用前将 mDixon 琼脂板从 4°C 转移到 RT，因为冷 mDixon 琼脂会抑制真菌生长。</li>
	<li>在30°C的（非摇动）培养箱中，用马拉塞齐亚倒置孵育琼脂板。定期检查马拉塞齐亚殖民地的生长情况。 注：mDixon琼脂板上的马拉塞齐亚菌落在3-5天内出现，呈奶油色沉闷，光滑，凸高（图1B）。</li>
	<li>在RT的mDixon琼脂板上储存马拉塞齐亚菌落，为期2周。此后，准备一个新的mDixon琼脂板，从冷冻甘油库存中条纹马拉塞齐亚，如1.7所述。</li>
</ol>2. 为实验小鼠马拉塞齐亚感染的接种准备
<ol><li>在无菌的 100 mL Erlenmeyer 烧瓶中接种 10 mL 的液体 mDixon 介质，从 mDixon agar 板中使用 3 - 5 个单独的马拉塞齐亚菌落（参见步骤 1，图 1B）。</li>
	<li>在 30°C 和 180 rpm 下孵育马拉塞齐亚培养基为 + 48 至 96 小时，直到培养体呈奶油色和浑浊（图 1A）。 注：马拉塞齐亚生长所需的时间取决于马拉塞齐亚的物种和菌株以及用于接种的真菌数量。</li>
	<li>将2 mL的马拉塞齐亚培养基转移到无菌的2 mL微离心管中，并在10，000 x g下1分钟进行离心机。
</li>
	<li>丢弃上清液，在1mL的磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）中悬浮，洗净颗粒。在10，000 x g下再次离心1分钟。</li>
	<li>洗涤后，通过强力移液将颗粒悬浮在1 mL的PBS中，并使用光谱仪测量溶液在600nm（ODA600）处的光密度。用 PBS 稀释马拉塞齐亚悬浮液 20 × 50 x 进行 OD 测量，以确保读数介于 0.1 和 1 之间。 注：马拉塞齐亚3天培养的密度一般在15至30 ODA600之间，取决于马拉塞齐亚的物种和菌株以及用于培养菌接种的酵母细胞的数量（步骤2.1）。马拉塞齐亚倾向于形成骨料，因此，大力移液是必要的，以确保悬浮液的同质性。</li>
	<li>在 PBS 中，将相当于 4 ODA600的密度的Malassezia悬浮液的体积与无菌 2 mL 管中一量相一致。准备每只动物1管被感染。</li>
	<li>在10，000 x g下将含有马拉塞齐亚的管子离心1分钟。</li>
	<li>丢弃上清液，将马拉塞齐亚颗粒悬浮在200 μL的原生橄榄油中（对应于2个ODA600酵母细胞/100μl橄榄油）。 注：橄榄油被发现是表皮感染马拉塞齐亚的好工具，因为马拉塞齐亚是一种亲脂和脂质依赖酵母。橄榄油比PBS更能被皮肤吸收。但是，请注意，在橄榄油中暂停马拉塞齐亚并非易事。通过涡旋改善马拉塞齐亚/橄榄油悬浮液。将悬浮液保持在RT处，直到用于感染。</li>
	<li>单独用橄榄油准备管子，用于对照动物的模拟感染。</li>
</ol>3. 用马拉塞齐亚感染小鼠
<ol><li>在6-8周的年龄订购雌性C57BL/6小鼠，并允许它们在实验动物设施中适应至少一周。计算每组3 - 5个小鼠，包括未感染的对照组。</li>
	<li>在PBS中制备含有1.3毫克/mL西拉辛和6.5毫克/mL氯胺酮的无菌麻醉鸡尾酒。5 mL的麻醉鸡尾酒足以麻醉20只动物。根据要麻醉的动物数量调整鸡尾酒的体积。<ol>
<li>通过注射10μL/g麻醉动物的麻醉鸡尾酒内渗透（对应于65毫克氯胺酮和13毫克西拉辛每公斤体重），并将麻醉动物放在加热垫上，在37°C。 注：在指示剂量下，动物通常保持麻醉30 - 60分钟。</li>
	</ol>
</li>
	<li>检查反射，用钳子捏后脚，以确保动物完全麻醉。</li>
	<li>在眼睛上涂上眼霜，防止麻醉过程中脱水。</li>
	<li>或者，使用卡钳（0 - 5 mm 范围）测量两只耳朵的耳朵厚度。测量每个耳朵的两个不同区域，并计算每只耳朵的平均耳朵厚度。 注：测量耳朵厚度是可选的，取决于研究问题。但是，如果耳朵厚度用作皮肤炎症的读出，则有必要在感染前测量基线耳部厚度。（请参阅步骤 4）。</li>
	<li>或者，通过温和的胶带剥离来破坏背耳皮肤的表皮屏障：手动将一小块胶带涂在皮肤上，然后再次将其去除。在每轮使用一块新鲜的胶带连续重复5次。 注：与未受干扰的皮肤相比，马拉塞齐亚在屏障破坏的皮肤中诱发更明显的皮肤炎症（图2A）7。</li>
	<li>使用无菌移液器将马拉塞齐亚/橄榄油悬浮液的 100 μL （2 ODA600）局部涂抹到每个耳朵的背侧。包括仅使用橄榄油处理的动物对照组（车辆处理对照组）。 注：涡旋马拉塞齐亚/橄榄油悬浮液，以确保在应用前立即进行同质的马拉塞齐亚悬浮液。</li>
	<li>将麻醉动物留在加热垫上，以避免体温过低，直到它们出现恢复迹象（胡须运动、呼吸速率增加等）。</li>
	<li>将200 μL的无菌和预加热的2%葡萄糖溶液分皮注射到鼻泡中，以支持其新陈代谢和补液。 注：要制备无菌的2%葡萄糖溶液，在50 mL PBS中溶解1mg葡萄糖，并使用0.2 μm过滤器过滤。溶液可储存在4°C。</li>
	<li>把动物送回笼子里</li>
</ol>4.马拉塞齐亚引起的皮肤炎症分析
注：此程序描述了感染期间马拉塞齐亚引起的耳肿胀的分析，作为皮肤炎症的参数。分析真菌引起的耳肿胀的先决条件是在剥带和/或感染之前测量基线耳部厚度（步骤 3.5）。
<ol><li>准备异曲兰室，用于马拉塞齐亚感染和控制动物的短期麻醉。</li>
	<li>一次将一只动物转移到房间，等待动物被完全麻醉。 注：正确麻醉的迹象包括完全的身体放松以及缓慢和沉重的（侧）呼吸。仔细观察麻醉，因为长时间暴露在电胶中可能是致命的。</li>
	<li>将动物从室内取出，并将其放在纸巾上。</li>
	<li>使用卡钳（范围 0 - 5 mm）测量耳朵的厚度。测量每个耳朵的两个不同区域，并计算每只耳朵的平均厚度（参见步骤 3.5）。</li>
	<li>把动物送回笼子。 注：异脱麻醉寿命很短，动物从异苯二代室取出后30秒内恢复。</li>
	<li>计算耳朵厚度的增加，从感染后每个时间点测量的平均耳厚中减去在剥离胶带和/或感染之前测量的平均基线耳厚。</li>
	<li>将计算值绘制为耳厚增加，或者绘制为每个动物或动物组随时间而增加的总耳厚（图 2B）。</li>
</ol>5. 受感染皮肤真菌负担分析
<ol><li>为每个耳朵制备无菌 2 mL 微离心管，在 dH2O 中含有 0.5 mL 的无菌 0.05% NP40 和一个灭菌钢球（直径 5 mm）。</li>
	<li>使用精密平衡称量管，并记下精确重量。</li>
	<li>通过CO2窒息使小鼠安乐死。</li>
	<li>如步骤 5.1 - 5.2 所述，取下底座上的耳，并转移到含有 0.5 mL 无菌0.05% NP40 的管中。</li>
	<li>称量包含耳组织的管子，并通过从管与器官的重量中减去没有器官的管的重量来计算每个样本的实际重量。</li>
	<li>使用组织均质器在 25 Hz 下使耳组织均匀化 6 分钟。确保组织良好均质化。</li>
	<li>将每个样品的100 μL板（对应每个均质的1/5，稀释系数= 5）放在mDixon琼脂板上，在30°C培养箱中倒置孵育板。 注：应根据预期的真菌负荷调整同质化量。确保板充分均质，以获得至少10和不超过250个菌落每板，以便轻松枚举。可选择，每个样品的板板具有不同的均匀性稀释。</li>
	<li>定期检查马拉塞齐亚殖民地的生长情况。 注：菌落通常在2-3天后变得可见。马拉塞齐亚殖民地生长的时间取决于马拉塞齐亚的物种和菌株。</li>
	<li>计算每盘的菌落。</li>
	<li>使用以下公式计算 CFU/g 组织的数量： CFU/g 组织 = （菌落/板数） x （稀释因子） / （皮肤样本重量（g）。 注： 可以使用以下公式评估近似最小检测限值：最小检测限值 = （1 孔/板） x （稀释因子） / （所有皮肤样本的平均重量（以 g 表示）。</li>
	<li>真菌载荷通常绘制在对数尺度上（图2C）。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Iliev, I. D., Leonardi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+dysbiosis:+immunity+and+interactions+at+mucosal+barriers.">Fungal dysbiosis: immunity and interactions at mucosal barriers.</a> Nature Reviews Immunology. 17 (10), 635-646 (2017).</li><li>Findley, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographic+diversity+of+fungal+and+bacterial+communities+in+human+skin.">Topographic diversity of fungal and bacterial communities in human skin.</a> Nature. 498 (7454), 367-370 (2013).</li><li>Gemmer, C. M., DeAngelis, Y. M., Theelen, B., Boekhout, T., Dawson, T. 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作者没有什么可透露的。

该协议描述了马拉塞齐亚spp对常用的近亲小鼠菌株C57BL/6的皮肤的感染。菌株可能需要调整感染剂量、分析的时间点等。为了确保可重复性，小鼠组应始终具有相同的年龄和性别。小鼠的来源应保持稳定，因为即使基因背景的微小变化和微生物群的差异，这些差异存在于供应商之间，甚至可能存在于单个育种设施的不同单位之间，因此，对感染过程。在建立本议定书中描述的马拉塞齐亚感染模型时，建议进行试点研究，以仔细监测感染过程，包括殖民化程度、真菌清除动力学和可能诱发的炎症和病理（例如，如果耳皮在感染前受到屏障干扰），以确定最佳测定条件。
为了确保可重复性并可靠地检测实验组之间的差异，必须根据统计分析计算每组使用的动物数量。样本大小是根据影响大小、误差率和功率计算的，其中考虑生物和实验变化（例如，由于免疫系统的变化）。出于道德原因，避免使用不必要的大量动物。关于马拉塞齐亚皮肤感染，不建议用真菌治疗一只耳朵，并在同一只小鼠内使用另一只耳朵作为对照，因为小鼠在梳理时可能会将真菌传播到两只耳朵。然而，使用1/2耳为不同的方法读出，如确定真菌负担，免疫细胞的分离或组织学分析往往足够，并导致显著减少用于实验的动物数量。
18种不同的马拉塞齐亚物种已被描述最新。马拉塞齐亚属内的物种间和物种内变异会影响与宿主的相互作用，正如我们从对其他人类致病真菌13的研究中学到的。不同的马拉塞齐亚物种和菌株的起源不同（例如，M. pachydermatis是从动物中分离到的最常见物种，而M.限制、M. globosa和M. 符号是最常见的物种真菌皮肤微生物群在人类与这些物种的不同皮肤区域之间的可变分布的突出成员）。有些物种与共种有关，而另一些物种被认为更致病，尽管详细证据仍然相对薄弱。重要的是，一些物种和菌株本质上比其他物种和菌株更难生长。因此，决定用于感染的物种/菌株必须基于研究问题。
鼠皮与一些微生物（如金黄色葡萄球菌或金黄色葡萄球菌）的实验感染要求在感染前破坏表皮屏障，例如，用沙纸14 15，16.相比之下，这里描述的马拉塞齐亚感染模型同样有效，有和没有屏障破坏7。如果皮肤在感染7之前被剥去胶带，真菌引起的炎症程度会大大增强。因此，在应用马拉塞齐亚之前，皮肤是否应该纵取决于研究问题。各种型号的慢性和急性皮肤炎症（例如，延迟型超敏反应（DTH）和接触超敏反应（CHS）模型）和屏障缺乏模型存在，这些模型可能有兴趣研究共性酵母的作用皮肤病。
在特定的无病原体（SPF）条件下维持的近亲小鼠（据我们所知）不是自然与马拉塞齐亚殖民。因此，马拉塞齐亚在小鼠耳皮上的实验性应用代表了对真菌的主要暴露，在宿主中引起急性反应，进而导致真菌在1-2周内清除7。因此，本议定书中描述的模型仅部分反映了免疫能力人类或其他宿主生物体内永久殖民与马拉塞齐亚的情况，但实验感染允许有足够的窗口研究抗真菌免疫的机会，以及这种反应的基础细胞和分子机制。它还允许在不同的实验条件下（例如，有和没有屏障破坏皮肤）调查不同马拉塞齐亚物种和菌株的反应变化。
过去，对马拉塞齐亚- 宿主相互作用的研究仅限于在培养物中分离细胞类型（例如角蛋白细胞系、PBMC）进行体外实验。虽然这些研究揭示了形成马拉塞齐亚和宿主17之间相互作用的真菌和宿主决定因素，但它们不允许全面了解真菌-宿主在复合体中的相互作用皮肤的环境，它涉及多种细胞类型，在不断通信，如角质细胞，成纤维细胞和组织驻留免疫细胞，但也白细胞种群，渗透组织只有在微生物遇到皮肤。这种多细胞网络不能完全在体外模型中复制，即使使用最先进的有机体系统也是如此。因此，小鼠的实验感染仍然是免疫学和传染病研究的黄金标准，这里描述的模型的可用性代表了马拉塞齐亚研究领域的突破。重要的是，该模型依赖于Malassezia在未受干扰的小鼠耳皮肤上的表皮应用，并且不会通过注射到组织中（例如，皮下或腹内）来影响真菌的接种，此前的研究报告有18项，两者都较远于自然殖民宿主的状况。
将本协议中描述的马拉塞齐亚感染模型与其他可用的小鼠模型相结合的可能性大大增加了应用的范围和灵活性。后者包括各种特定皮肤疾病的模型，例如模仿特应性皮炎重要特征的屏障缺乏模型，这种病在人类和狗身上都与马拉塞齐亚有关。此外，皮肤皮下感染马拉塞齐亚很容易适用于有遗传缺陷的小鼠的宿主基因感兴趣的，或小鼠的细胞类型感兴趣的基因删除或药理枯竭（例如，通过手段白喉毒素给给白喉毒素给给小鼠的白喉毒素给给。这些模型是解剖宿主对共生微生物（包括马拉塞齐亚）反应的必然工具，并评估这些基因和细胞类型在真菌-宿主相互作用中的作用。对马拉塞齐亚-宿主皮肤相互作用的分析可以远远超出本协议所述的范围。其中包括组织学分析（例如，确定皮肤病理学或真菌引起的表皮增厚程度），免疫组织化学或使用针对细胞类型的抗体对组织部分进行免疫荧光染色特定标记或其他感兴趣的分子。它还可能涉及从受感染的皮肤组织分离细胞（例如组织驻留或组织渗透白细胞子集），以深入研究对马拉塞齐亚的免疫反应的极化、调节和动力学。

皮肤由许多不同的微生物填充。皮肤不断接触微生物群有助于塑造和教育宿主的免疫系统。真菌日益被公认为微生物群的重要组成部分，它们对宿主的生理和免疫力起着重要作用，类似于细菌和病毒1。马拉塞齐亚属的物种是迄今为止最丰富的真菌殖民皮肤的温血脊椎动物，他们占人类皮肤霉菌群的90%以上，2，3。到目前为止，从人类和动物皮肤中已经发现了18种不同的马拉塞齐亚。
皮肤的各种病理被认为是由于不平衡的微生物群成分，至少部分地出现。不良生物病可能导致具有致病潜力的物种过度生长，导致机会性感染和疾病5。一直，有越来越多的证据表明，马拉塞齐亚，除了其共性的生活方式，有助于发展各种皮肤病，从头皮屑和皮条病到更严重的炎症性疾病，如作为脂溢性皮炎和特应性皮炎4，6。虽然马拉塞齐亚和皮洛里斯的病带之间已经建立了因果关系，但真菌在更严重皮肤病变中的病理生理学作用在很大程度上仍不得而知。
确定马拉塞齐亚在皮肤平衡和疾病中的作用需要更深入的了解真菌与皮肤和皮肤免疫系统的相互作用。值得注意的是，与其他人类真菌病原体（如念珠菌或阿斯珀吉鲁斯熏蒸）相比，对马拉塞齐亚的研究还处于起步阶段。这可以归因于在实验室条件下种植马拉塞齐亚的困难，以及缺乏适当的实验模型来研究真菌与宿主在体内接触。先前对培养中分离细胞的实验表明，马拉塞齐亚与各种免疫和非免疫细胞7之间有着广泛的直接和间接相互作用。然而，这些体外实验只是部分地概括了体内复杂的皮肤环境的情况，在真菌和各种细胞类型之间同时发生大量的细胞和分子事件。
在这里，我们概述了我们最近建立的小鼠马拉塞齐亚皮肤感染实验模型的协议，以研究体内真菌-宿主相互作用。这包括 （1） 在体外成功培养马拉塞齐亚的程序，（2）马拉塞齐亚在鼠耳皮肤上的表皮应用，以及 （3） 如何分析马拉塞齐亚诱导皮肤的技术细节炎症和受感染皮肤的真菌负担。重要的是，这种模式不依赖于免疫抑制（例如，通过皮质类固醇）或抗生素治疗小鼠感染前，因为它是实践在其他小鼠模型真菌感染8，9。反过来，它允许研究在正常皮肤中对马拉塞齐亚的先天和适应性免疫反应的全谱。值得注意的是，在特定的无病原体（SPF）条件下饲养的近亲野生型小鼠不会自然与马拉塞齐亚殖民，因此，它们接触真菌不会导致持续殖民化，而是从宿主体内清除大约1.5周。然而，该模型允许研究抗真菌宿主反应启动和调节的机制，而后者又成为免疫记忆生成的基础。该模型用途广泛，它可以很容易地应用于各种转基因小鼠菌株，并可以与其他现有的皮肤病模型，如屏障缺乏模型相结合，研究马拉塞齐亚的影响下病理和炎症皮肤状况7。因此，所述小鼠实验马拉塞齐亚皮肤感染模型为研究真菌在平衡和疾病背景下与皮肤免疫系统的相互作用提供了高度的灵活性。
该协议描述了小鼠使用马拉塞齐亚氏菌的实验皮肤感染。由于其致病潜力，马拉塞齐亚spp.在一些国家，包括瑞士被归类为BSL2病原体。请查看当地准则，并遵守地方当局的规定。BSL2 分类生物体应由经过培训的人员在 BSL2 认证的生物安全柜 （BSC） 下处理。受BSL2分类生物污染的生物废物，以及受感染这种生物的小鼠的尸体，在处置前应进行灭菌。对于小鼠的实验，应竭尽全力，尽量减少痛苦，并确保根据3R原则（替换，完善，减少）10的最高道德和人道标准。该协议中描述的实验是使用M.pachydermatis（ATCC 14522）、M.furfur（ATCC 14521）和M.sympodialis（ATCC 42132）7进行的。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1296-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attane Isoflurane</td>
			<td>Piramal Healthcare</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosaftey cabinet (BSC) Faster Ultra Safe</td>
			<td>DASIT GROUP</td>
			<td>TEC 5594</td>
			<td>BSL2 certified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415D</td>
			<td>compatible with 2ml Eppendorf tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dessicated Ox-bile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>70168-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tubes (2 ml)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 120.094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49159-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gylcerol (99 %)</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>10314830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Eickenmeyer</td>
			<td>648048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator Hereaus B20</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>412047753</td>
			<td>BSL2 certified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketasol (100 mg)</td>
			<td>Graeub AG</td>
			<td>6680416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magentic heating plate MR Hei-Standard</td>
			<td>Heidolph Instruments</td>
			<td>442-1355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malassezia spp.</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>14522, 14521, 42132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malt extract</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>70167-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiply Biosphere Tubes (200 &#181;l)</td>
			<td>Sarstedt AG</td>
			<td>7084211</td>
			<td>Safelock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Native olive oil</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>commerc. available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P40</td>
			<td>Axon Lab</td>
			<td>A1694,0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oditest measurment devise</td>
			<td>Kroeplin</td>
			<td>S0247</td>
			<td>range 0-5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75090-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Sarstedt AG</td>
			<td>82.1473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphat buffered salt solution (PBS, 1x)</td>
			<td>Amimed/Bioconcept</td>
			<td>3-05F39</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rompun (2 %)</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>KP0BFHR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator Infors Minitron</td>
			<td>Infors</td>
			<td>-</td>
			<td>BSL2 certified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrometer</td>
			<td>Jenway</td>
			<td>20308</td>
			<td>optical density measurement at 600nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrometer Cuvettes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>613101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel balls (5mm)</td>
			<td>ABF</td>
			<td>KU.5G80 1.3541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes 1 ml Sub-Q</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>305501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Lyzer II</td>
			<td>Quiagen</td>
			<td>85300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transpore Hypoallergic Tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>1527-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 40</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1504-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin A Retinoli Palmitas Eye Cream</td>
			<td>BAUSCH &#38; LOMB</td>
			<td></td>
			<td>commerc. available</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

infecting mice with malassezia spp. to study the fungus-host interaction

动物模型对传染病研究至关重要。它们为分析微生物与其宿主在体内以组织特定方式发生的各种相互作用提供了重要依据。致病真菌日益被公认为对人类的严重威胁，利用这种感染模式大大提高了我们对真菌致病性的认识。马拉塞齐亚属的物种是人类皮肤微生物群中最丰富的真菌，它们也与严重炎症性皮肤疾病（如脂溢性皮炎和特应性皮炎）的发展有关。然而，马拉塞齐亚与疾病发病机制之间的因果关系仍然未知，这一事实可归因于对马拉塞齐亚与皮肤免疫系统的复杂串扰知之甚少。该协议描述了一个实验小鼠模型的建立，该模型允许研究马拉塞齐亚与体内哺乳动物皮肤的相互作用。它概述了在实验室条件下培养马拉塞齐亚皮肤的方法，如何用马拉塞齐亚氏菌感染鼠皮，以及如何通过皮肤炎症和真菌负担分析来评估感染结果。此处描述的模型适用于完全免疫能力的动物，不依赖于免疫抑制或抗生素对动物的预处理。此外，它还能适应几乎所有转基因小鼠菌株，并可与其他皮肤病模型结合使用。这些功能使这个感染模型成为一个非常强大的工具，用于详细研究宿主在体内皮肤中对马拉塞齐亚的先天和适应性免疫反应。

马拉塞齐亚的体外栽培 与其他更常用的真菌模型病原体，如C.白化病或A.熏蒸菌相比，马拉塞齐亚在体外培养更加困难。这可以归因于一个事实，即马拉塞齐亚依靠外源脂源来满足其营养需求，因为它无法合成脂肪酸11。mDixon介质适用于培养几种马拉塞齐亚物种，包括M.帕奇马季马季斯、毛皮、M.sympodialis、M.slooffiae、M.globosa和M.Yamatoensis体外7 ， 12.图 1显示了在液体 mDixon 介质和 mDixon agar 中M. sympodialis在步骤 1 和步骤 2 中描述的 M. 符号增长的代表性图像。
马拉塞齐亚皮肤炎症皮肤炎症及真菌负担分析 在感染前，马拉塞齐亚接触小鼠耳皮肤，其屏障被胶带剥离破坏，导致皮肤炎症加剧，其特征是表皮和皮肤增生以及水肿7的发育。步骤 4 和 5 概述了分析马拉塞齐亚引起的耳肿胀和皮肤真菌负担的方法。这两个参数都表示用于监视感染过程的关键读出。图 2A显示了与 WT C57BL/6 小鼠未受干扰的皮肤相比，M. 毛皮接触皮肤后观察到的耳朵厚度增加。图 2B显示了耳朵厚度随时间增加的代表性汇总图。图2C显示感染M.pachydermatis后第2天耳皮肤的真菌负担。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60175/60175fig01.jpg"> 图1：马莱西亚体外栽培。 （A） M. 符号菌株 ATCC 42132 在 30°C 和 180 rpm 下在液体 mDixon 介质（左）下生长 3 天，旁边是含有 mDixon 介质且未接种的 mDixon 介质（右）。（B） M. 符号菌株ATCC 42132 在 mDixon agar 上经过 5 天的孵育，在 30°C 下。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60175/60175fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60175/60175fig02.jpg"> 图2：根据耳厚和真菌负担分析马拉塞齐亚皮肤感染。 （A） 从使用橄榄油（车辆，左侧）或感染M.毛皮菌株JPLK235天（中和右）的C57BL/6小鼠耳部组织学。在右侧，耳皮在感染前被剥去胶带。部分被血氧林和欧辛（H&E）染色。（B） 显示暴露于马拉塞齐亚或未受感染的 C57BL/6 小鼠的耳朵厚度随时间而增加的摘要图。每个时间点显示M. pachydermatis菌株 ATCC 14522 暴露或车辆处理耳皮的绝对厚度显示在左侧;右侧显示指示时间点相对于第 0 天基线的耳厚增加。（C）感染M.pachydeatis菌株ATCC 14522或以橄榄油作为对照（车辆）治疗的C57BL/6小鼠皮肤的真菌负担。在这两种情况下，皮肤都是带条的。摘要图B和C中的每个符号表示一个动物。使用单向方差分析 （B） 或学生 t-test （C） 计算组间差异的统计显著性。p <0.001， \p <0.0001， D.L.： 检测限制<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60175/60175fig02large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本。</a>

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Infecting Mice with Malassezia spp. to Study the Fungus-Host Interaction

该协议概述了用于研究皮肤中马拉塞齐亚宿主相互作用的小鼠模型。它描述了马拉塞齐亚在体外培养，鼠皮感染马拉塞齐亚，以及随后分析皮肤组织中的炎症和真菌负担。

感染小鼠与马拉塞齐亚spp.研究真菌-主机相互作用

Animal models are crucial for infectious disease research. They provide an important basis for analyzing the full spectrum of interactions that occur ...

该协议描述了建立一个新的小鼠模型，以研究皮肤真菌，马拉塞齐亚，及其与哺乳动物皮肤在体内的相互作用。与体外方法相比，这种感染模型允许在完全复杂和组织特定的方式研究对马拉塞齐亚的先天和适应性免疫机制。马拉塞齐亚与各种皮肤疾病有关，如特应性皮炎。了解真菌的免疫反应可能提供新的策略，以治疗这种频繁和慢性炎症性皮肤疾病。实验室皮肤感染马拉塞齐亚提供了一个期待已久的模型，研究皮肤共性真菌如何调节免疫系统，从而影响各种皮肤疾病的过程和严重程度。准备马拉塞齐亚注射10毫升的液体mDixon介质和三到五个单独的马拉塞齐亚菌落从MDixon阿加板到无菌的100毫升埃伦迈尔烧瓶。然后将烧瓶在 30 摄氏度下放置，每分钟旋转 180 次，48 到 96 小时。当培养物是奶油色和浊性时，将培养物的两毫升转移到无菌的两毫升微离心管中，通过离心沉淀酵母。将颗粒重新在一毫升PBS中进行第二次离心，然后用有力的移液将一毫升新鲜PBS重新增充。使用 PBS 稀释 Malassezia 悬浮液 20 至 50 次，以确保读数介于 0.1 和 1 之间，并在光谱仪上测量 OD 600。在PBS中，与四个OD 600的一卷等量，相当于每只动物被感染的两毫升无菌管，通过离心沉淀酵母。然后重新在200微升原生橄榄油中重新供应颗粒。要引发 Malassezia 感染，请确认麻醉的 6 至 8 周大雌性 C57 Black6 小鼠对踏板反射缺乏反应，并给动物的眼睛涂抹软膏。使用卡钳测量两只耳朵两个不同区域的厚度，以便计算每只耳朵的平均厚度。然后将一小块胶带涂抹在一只耳朵的皮肤上，然后每次使用新胶带将胶带从耳皮上快速取下五次。剥离后，使用无菌移液器将100微升的马拉塞齐亚橄榄油悬浮液涂抹到每只耳朵的背侧，并注射200微升的无菌、预战的2%葡萄糖溶液皮下到努卡折叠中，以支持新陈代谢和再水合。然后让鼠标在加热垫上恢复 30 分钟，然后将动物返回到笼子。在适当的实验时间点，使用卡钳测量每个小鼠耳朵的两个不同区域，以便计算每个耳朵的平均厚度。为了测量受感染皮肤的真菌负担，在蒸馏水中加入500微升无菌0.05%NP40，并在每耳一个两毫升的微离沙管中自动处理五毫升直径的钢球，并在平衡上称重每个管。接下来，从基地的每个动物中采集耳朵，将组织放入NP40的单个管中。在平衡下称量每个管，确定每个耳样的重量，然后以 25 赫兹使耳组织均质 6 分钟。然后将每个样品的100微升分配到mDixon阿加子板上，并在30摄氏度下倒置孵育之前，将悬浮液均匀地分配到阿加片上。这里显示了在液体mDixon介质和mDixon agar上生长的马拉塞齐亚符号的生长具有代表性的图像。与野生C57 Black6小鼠的未扰动皮肤相比，Malassezia furfur应用到被阻隔的皮肤后，耳朵厚度增加。事实上，随着时间的推移，耳朵厚度的增加量化表明，与车辆处理的皮肤相比，厚度的变化是显著的。此外，感染马拉塞齐亚帕奇德马提斯后的第二天，耳皮的真菌负担是高于检测限值的100至1000倍。马拉塞齐亚倾向于形成聚合体，不容易挂起。因此，通过广泛涡流确保油真菌悬浮液的均质化。其他读数可能包括，组织学确定皮肤病理学和免疫细胞从皮肤分离和排干淋巴结，以研究抗真菌免疫反应。该模型为研究对马拉塞齐亚的免疫反应和研究真菌在各种皮肤疾病背景下的共生作用提供了机会。马拉塞齐亚物种在一些国家被归类为BSL-2生物。请务必遵守当地当局的规定，并采用适当的安全措施。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Infecting Mice with Malassezia spp. to Study the Fungus-Host Interaction

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

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测量细菌感染小鼠和免疫反应李斯特菌</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

科研

免疫与感染

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

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一个简单的的Chelex协议对DNA的提取<em&gt;按蚊</em&gt;属。

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

High and Low Throughput Screens with Root-knot Nematodes Meloidogyne spp.

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根结线虫的高和低通量筛选根结线虫。</em

Root-knot nematodes (genus Meloidogyne) are obligate plant parasites. They are extremely polyphagous and considered one of the most economically important ...

Cecal Ligation and Puncture-induced Sepsis as a Model To Study Autophagy in Mice

盲肠结扎穿孔致脓毒症作为模型小鼠中自噬研究

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method, which causes polymicrobial sepsis. Here, a protocol is ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

尾部皮肤来研究异基因CD4 + T细胞应答的小鼠移植

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Development of an in vitro model system for studying the interaction of Equus caballus IgE with its high-affinity receptor Fc&#949;RI

Development of an in vitro model system for studying the interaction of Equus caballus IgE with its high-affinity receptor FcÃƒÅ½Ã‚ÂµRI

的发展<em&gt;在体外</em&gt;模型研究的交互系统<em&gt;雅科仕</em&gt;<em&gt; caballus</em&gt;以其高亲和力受体了FcεRI的IgE

The interaction of IgE with its high-affinity Fc receptor (Fc&#949;RI) followed by an antigenic challenge is the principal pathway in IgE mediated ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

使用的淋巴细胞外渗分析<em&gt;体外</em&gt;人类血脑屏障模型

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

人类的过表达和纯化<em&gt;顺</emβ-肾上腺素转移酶<em&gt;大肠杆菌</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

沙门氏菌筛选的高通量平台.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Induction of Drug-Induced, Autoimmune Hepatitis in BALB/c Mice for the Study of Its Pathogenic Mechanisms

诱导BALB/c小鼠药物诱导的自身免疫性肝炎研究其致病机制

Drug-induced autoimmune hepatitis (DIH) is the most common hepatic drug-induced hypersensitization process observed in approximately 9 to 12% of patients ...