Name: infecting mice with malassezia spp. to study the fungus-host interaction
Uploaded: 2019-11-06T13:00:00
Duration: 6 min 19 s
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Este trabalho foi apoiado pela Universidade de Zurique, na Suíça.

Todos os procedimentos descritos neste protocolo foram realizados de acordo com a portaria sobre o manuseio de organismos em sistemas contidos do Escritório Federal do Meio Ambiente, Suíça (www.bafu.admin.ch). Os experimentos com camundongos foram realizados em estrita conformidade com as diretrizes da Lei Suíça de Proteção de Animais e foram realizados os protocolos aprovados pelo Escritório Veterinário do Cantão de Zurique, Suíça (licença número 168/2018).
1. Cultivo de Malassezia em condições de laboratório
NOTA: Armazenar todos os reagentes e meios utilizados para este protocolo à temperatura ambiente (RT, 20 - 25 ° C), a menos que indicado o contrário, como a temperatura mais baixa pode inibir o crescimento fúngico.
<ol><li>Prepare o líquido modificado Dixon (mDixon) médio para o crescimento malassezia. Para preparar 500 mL de mDixon líquido médio, dissolva 18 g de extrato de malte, 10 g dessecado Ox-bile, 5 mL Tween-40, 3 g Peptone, 1 mL Glicerol e 1 mL Ácido Oleico em 500 mL destilado H2O (dH2O). Ajuste o médio ao pH 6 com HCl e autoclave. Armazenar o meio em RT.</li>
	<li>Prepare placas de ágar mDixon adicionando 7,5 g de ágar a 500 mL mDixon médio antes da autocllaving. Arrefecer lentamente o ágar mDixon após a autoclismo usando uma barra de direção e uma placa de aquecimento magnético para evitar a solidificação parcial do meio, enquanto esfriando.</li>
	<li>Uma vez que o ágar esfriou para 50 - 60 °C, dispense o líquido em pratos de Petri em uma capa de fluxo laminar e deixe-os secar no RT durante a noite. NOTA: As placas de ágar podem ser armazenadas a 4 °C por várias semanas quando embrulhadas e mantidas de cabeça para baixo para evitar a evaporação.</li>
	<li>Obter malassezia isola e reviver lyophilized estoques de Malassezia de acordo com as instruções obtidas pelo provedor.</li>
	<li>Inocular 10 mL de mDixon líquido médio em um frasco estéril de Erlenmeyer de 100 mL com a suspensão malassezia revivida de acordo com as instruções obtidas pelo provedor. Incubar a cultura em uma incubadora tremendo em 30 °C e 180 rpm.</li>
	<li>Inspecione o crescimento da cultura Malassezia regularmente, verificando o aparecimento de cor creme e turbidez. A cinética do crescimento depende da espécie e da estirpe de Malassezia e pode ser particularmente lenta quando Malassezia é recentemente revivida a partir de um estoque lyophilizado. (Figura 1A).</li>
	<li>Prepare os estoques de glicerol misturando 3 partes da cultura Malassezia densamente cultivada no mDixon médio com 1 parte do glicerol estéril de 99%. Aliquot a mistura Malassezia/ glicerol em tubos estéril parafuso-tampão e armazenar a -80 °C.</li>
	<li>Para a propagação in vitro, placa Malassezia da cultura líquida em mDixon ou do estoque congelado do glycerol em uma placa do ágar de mDixon (trazida ao RT de 4 °C) usando um laço da inoculação. NOTA: Transfira placas de ágar mDixon para RT de 4 °C antes do uso, já que o ágar de mDixon frio inibe o crescimento fúngico.</li>
	<li>Incubaa a placa de ágar (s) com Malassezia de cabeça para baixo em uma incubadora (não tremer) a 30 °C. Inspecione o crescimento das colônias malassezia regularmente. NOTA: Malassezia colônias em placas de ágar mDixon aparecem dentro de 3 - 5 dias e são de cor creme maçante, suave com elevação convexa (Figura 1B).</li>
	<li>Armazenar colônias Malassezia em placas de ágar mDixon em RT para ~ 2 semanas. Depois disso, prepare uma nova placa de ágar mDixon por Malassezia listrado do estoque de glicerol congelado, como descrito em 1,7.</li>
</ol>2. Preparação do inóculo para a infecção experimental malassezia de camundongos
<ol><li>Inocular 10 mL de mDixon líquido médio em um estéril 100 mL Erlenmeyer frasco com 3 - 5 colônias individuais Malassezia de uma placa de ágar mDixon (ver passo 1, Figura 1B).</li>
	<li>Incubar a cultura Malassezia para ~ 48 a 96 h a 30 °C e 180 rpm até que a cultura é de cor creme e turva (Figura 1A). NOTA: O tempo necessário para o crescimento malassezia depende da espécie Malassezia e estirpe e da quantidade de fungo utilizado para a inoculação.</li>
	<li>Transfira 2 mL da cultura Malassezia para um tubo esterile 2 mL microcentrífuga e centrífuga por 1 min a 10.000 x g.
</li>
	<li>Descarte o supernatant e lave a pelota suspendendo-a em 1 mL da solução de sal tampão de fosfato (PBS). Centrífuga novamente por 1 min a 10.000 x g.</li>
	<li>Após a lavagem, suspenda a pelota em 1 mL de PBS por tubulação vigorosa e medir a densidade óptica da solução em 600 nm (ODA600)usando um espectrômetro. Diluir a suspensão Malassezia 20 - 50 x com PBS para a medição od para garantir que a leitura está entre 0,1 e 1. NOTA: A densidade de uma cultura de 3 dias de Malassezia geralmente varia entre 15 e 30 ODA600, dependendo da espécie malassezia e tensão e sobre o número de células de levedura utilizadas para a inoculação da cultura (passo 2.1). Malassezia tende a formar agregados, portanto, tubulação vigorosa é necessária para garantir a homogeneidade da suspensão.</li>
	<li>Aliquot um volume da suspensão Malassezia em PBS que corresponde a uma densidade de 4 ODA600 em um tubo estéril 2 mL. Prepare 1 tubo por animal para ser infectado.</li>
	<li>Centrífuga s os tubos contendo Malassezia por 1 min em 10.000 x g.</li>
	<li>Descarte o supernatant e suspenda a pelota malassezia em 200 μL de azeite nativo (correspondente a 2 células de levedura ODA600/100 μl azeite de oliva). NOTA: O azeite foi encontrado para ser um bom veículo para a infecção epicutânea com Malassezia, como Malassezia é um fermento lipofílico e lipídio-dependente. O azeite é melhor absorvido pela pele do que pbs. No entanto, esteja ciente de que não é fácil suspender Malassezia em azeite. Melhorar a Suspensão Malassezia/azeite por vórtice. Mantenha a suspensão no RT até que seja usado para infecção.</li>
	<li>Prepare tubos com azeite sozinho para infecção simulada de animais controle.</li>
</ol>3. Infectando ratos com Malassezia
<ol><li>Encomende camundongos C57BL/6 fêmeas com idade de 6 a 8 semanas e permita que eles se aclimatem na instalação de animais experimentais por pelo menos uma semana. Calcule para 3 - 5 camundongos por grupo, incluindo um grupo controle não infectado.</li>
	<li>Prepare coquetel anestésico estéril contendo 1,3 mg/mL Xylazine e 6,5 mg/mL quetamina na PBS. 5 mL do coquetel anestésico é suficiente para anestesiar 20 animais. Ajuste o volume do coquetel de acordo com o número de animais a anestesiados.<ol>
<li>Animais de anestesia injetando 10 μL/g peso corporal do coquetel anestésico intraperitoneally (correspondente a 65 mg de quetamina e 13 mg de xilazine por kg de peso corporal) e colocar os animais anestesiados em uma almofada de aquecimento em 37 °C. NOTA: Na dose indicada, os animais geralmente permanecem anestesiados por ~ 30 - 60 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verifique os reflexos, beliscando o pé traseiro com fórceps para garantir que os animais são totalmente anestesiados.</li>
	<li>Aplique um creme para os olhos para evitar a desidratação durante a anestesia.</li>
	<li>Opcionalmente, medir a espessura da orelha de ambas as orelhas usando uma pinça (0 - 5 mm intervalo). Medir duas áreas diferentes de cada orelha e calcular a espessura média da orelha por orelha. NOTA: Medir a espessura da orelha é opcional e depende da pergunta da pesquisa. No entanto, se a espessura da orelha é usada como uma leitura para inflamação da pele, é necessário medir a espessura da orelha de base antes da infecção. (ver Passo 4).</li>
	<li>Opcionalmente, interrompa a barreira epidérmica da pele dorsal da orelha por fita suave descascando: aplique manualmente um pequeno pedaço de fita adesiva na pele e removê-lo novamente. Repita por 5 rodadas consecutivas usando um novo pedaço de fita para cada rodada. NOTA: Malassezia induz uma inflamação mais pronunciada da pele na pele barreira interrompida em comparação com a pele imperturbável(Figura 2A)7.</li>
	<li>Aplique topicamente 100 μL (2 ODA600)da suspensão Malassezia/azeite no lado dorsal de cada orelha usando uma pipeta estéril. Inclua um grupo controle de animais que são tratados apenas com azeite (grupo controle tratado por veículos). NOTA: Vortex a Malassezia/ suspensão do azeite vigorosamente para garantir uma suspensão homogênea Malassezia imediatamente antes da aplicação.</li>
	<li>Deixe os animais anestesiados na almofada de aquecimento para evitar a hipotermia até que mostrem sinais da recuperação (movimento do whisker, taxa de respiração aumentada, etc.).</li>
	<li>Injete 200 μL de solução de glicose 2% estéril e pré-aquecida subcutânea mente na dobra nucal para suportar seu metabolismo e reidratação. NOTA: Para preparar uma solução estéril de glicose de 2%, dissolva 1 mg de glicose em 50 mL PBS e filtre-o usando um filtro de 0,2 μm. A solução pode ser armazenada a 4 °C.</li>
	<li>Transfira os animais de volta para sua gaiola.</li>
</ol>4. Análise da inflamação da pele induzida por Malassezia
NOTA: Este procedimento descreve a análise do inchaço da orelha induzida por Malasseziadurante a infecção que serve como parâmetro de inflamação da pele. Um pré-requisito para analisar o inchaço da orelha induzida por fungos é medir a espessura da orelha de base antes de despir a fita e/ou infecção (Passo 3.5).
<ol><li>Prepare a câmara de isoflurane para anestesia de curto prazo de malassezia-animais infectados e de controle.</li>
	<li>Transfira um animal de cada vez para a câmara e espere que o animal seja totalmente anestesiado. NOTA: Sinais de anestesia adequada incluem relaxamento completo do corpo, bem como lento e pesado (flanco) respiração. Monitorar cuidadosamente a anestesia como exposição prolongada ao isoflurano pode ser fatal.</li>
	<li>Retire o animal da câmara e coloque-o em um tecido.</li>
	<li>Medir a espessura da orelha (s) usando uma pinça (intervalo 0 - 5 mm). Medir duas áreas diferentes de cada orelha e calcular a espessura média por orelha (ver passo 3,5).</li>
	<li>Transfira o animal de volta para a gaiola. NOTA: A anestesia de Isoflurane é muito curta, e os animais se recuperam dentro de ~ 30 s após a remoção da câmara isoflurane.</li>
	<li>Calcule o aumento na espessura da orelha subtraindo a espessura média da orelha de base, medida antes do descascamento e/ou infecção da fita, da espessura média da orelha medida em cada ponto de tempo após a infecção.</li>
	<li>Trace os valores calculados como o aumento da espessura da orelha ou, alternativamente, como a espessura total da orelha ao longo do tempo para cada animal ou grupo de animais(Figura 2B).</li>
</ol>5. Análise da carga fúngica na pele infectada
<ol><li>Prepare um tubo estéril de microcentrífuga de 2 mL para cada orelha ser colhida, contendo 0,5 mL de NP40 estéril de 0,05% em dH2O e uma bola de aço autocllavada (5 mm de diâmetro).</li>
	<li>Pese os tubos usando um equilíbrio de precisão e anote o peso preciso.</li>
	<li>Eutanásia os ratos por asfixia de CO2.</li>
	<li>Retire a orelha (s) na base e transfira para o tubo contendo 0,5 mL de NP40 estéril 0,05% em dH2O, como descrito nos passos 5.1 - 5.2.</li>
	<li>Pese o tubo contendo o tecido auditivo e calcule o peso real de cada amostra subtraindo o peso do tubo sem o órgão do peso do tubo com o órgão.</li>
	<li>Homogeneize o tecido auditivo por 6 min a 25 Hz usando um homogeneizador de tecido. Certifique-se de que o tecido está bem homogeneizado.</li>
	<li>Placa 100 μL de cada amostra (correspondente a 1/5 de cada homogeneato, fator de diluição = 5) em placas de ágar mDixon e incubar as placas de cabeça para baixo em uma incubadora de 30°C. NOTA: A quantidade de homogeneização banhada deve ser ajustada de acordo com a carga fúngica a ser esperada. Certifique-se de placa homogênea suficiente para obter pelo menos 10 e não mais de 250 colônias por placa para permitir a enumeração fácil. Opcionalmente, placa múltiplas placas por amostra com diferentes diluições de homogeneização.</li>
	<li>Inspecione o crescimento das colônias malassezia regularmente. NOTA: Colônias geralmente se tornam visíveis após 2 - 3 dias. O tempo necessário para as colônias malassezia para crescer depende da espécie e da estirpe de Malassezia.</li>
	<li>Conte as colônias por prato.</li>
	<li>Calcule o número de tecido CFU/g usando a seguinte fórmula: Tecido CFU/g = (número de colônias/placa) x (fator de diluição) / (peso da amostra de pele em g). NOTA: O limite de detecção mínimo aproximado pode ser avaliado usando a seguinte fórmula: limite mínimo de detecção = (1 colônia/placa) x (fator de diluição) / (peso médio de todas as amostras de pele em g).</li>
	<li>As cargas fúngicas são geralmente traçadas em escala logarítica(Figura 2C).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Iliev, I. D., Leonardi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+dysbiosis:+immunity+and+interactions+at+mucosal+barriers.">Fungal dysbiosis: immunity and interactions at mucosal barriers.</a> Nature Reviews Immunology. 17 (10), 635-646 (2017).</li><li>Findley, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographic+diversity+of+fungal+and+bacterial+communities+in+human+skin.">Topographic diversity of fungal and bacterial communities in human skin.</a> Nature. 498 (7454), 367-370 (2013).</li><li>Gemmer, C. M., DeAngelis, Y. M., Theelen, B., Boekhout, T., Dawson, T. 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Os autores não têm nada a divulgar.

Este protocolo descreve a infecção da pele da cepa de camundongo sem raça comumente usada C57BL/6 por Malassezia spp. Adaptando este protocolo a outras cepas de camundongos com um fundo genético diferente (por exemplo, Balb/c) ou para camundongogeneticamente modificado cepas podem precisar de ajuste da dose de infecção, o ponto de tempo (s) da análise, etc. Para garantir a reprodutibilidade, grupos de camundongos devem sempre ser da mesma idade e sexo. A fonte de camundongos deve ser mantida estável, pois mesmo pequenas mudanças no contexto genético e diferenças na microbiota, que existem entre fornecedores e podem existir mesmo entre diferentes unidades de uma única instalação de reprodução, podem ter um impacto imprevisível curso de infecção. Ao configurar o modelo de infecção malassezia descrito neste protocolo, é aconselhável realizar um estudo piloto para monitorar cuidadosamente o curso da infecção, incluindo a extensão da colonização, a cinética da desminagem fúngica e o grau de inflamação e patologia que podem ser induzidas (por exemplo, se a pele do ouvido for interrompida por barreiras antes da infecção) para determinar as condições ideais de ensaio.
Para garantir a reprodutibilidade e detectar de forma confiável as diferenças entre os grupos experimentais, o número de animais utilizados por grupo deve ser calculado com base na análise estatística. O tamanho da amostra é calculado com base no tamanho do efeito, taxa de erro e potência, que consideram variações biológicas e experimentais (por exemplo, devido à variação no sistema imunológico). Por razões éticas, evite usar um número desnecessariamente alto de animais. A respeito da infecção de pele de Malassezia, tratando somente uma orelha com o fungo e usando a outra orelha como um controle dentro do mesmo rato, não é recomendado porque os ratos podem espalhar o fungo a ambas as orelhas ao grooming. No entanto, o uso de 1/2 ouvido para diferentes outs metodológicos lidos, como determinação da carga fúngica, isolamento de células imunes ou análise histológica, é muitas vezes suficiente e resulta em uma redução significativa no número de animais usados para experimentos.
18 espécies diferentes de Malassezia foram descritas até à data. Variações inter e intraespécies dentro do gênero Malassezia podem afetar a interação com o hospedeiro, como também aprendemos com estudos sobre outros fungos patogênicos humanos13. Diferentes espécies malassezia e cepas diferem em sua origem (por exemplo, M. paquidermate é a espécie mais freqüente isolada de animais, enquanto M. restricta, M. globosa e M. sympodialis são os mais frequentes membros proeminentes do microbioma da pele fúngica em seres humanos com distribuição variável dessas espécies entre diferentes áreas da pele). Algumas espécies têm sido associadas ao commensalismo, enquanto outras são consideradas mais patogênicas, embora evidências detalhadas permaneçam relativamente fracas. Importante, algumas espécies e cepas são inerentemente mais difíceis de crescer do que outros. Assim, a decisão de quais espécies/cepa usar para a infecção deve ser baseada na questão da pesquisa.
A infecção experimental da pele de urina com alguns organismos microbianos, como Candida albicans ou Staphylococcus aureus, requer a interrupção da barreira epidérmica antes da infecção, por exemplo, com papel de areia14, 15,16. Em contraste, o modelo de infecção malassezia descrito aqui é igualmente eficiente com e sem ruptura barreira7. O grau de inflamação induzida pelo fungo é maciçamente reforçada se a pele é fita despojada antes da infecção7. Portanto, se a pele deve ser manipulada antes da aplicação de Malassezia depende da questão da pesquisa. Existem vários modelos de inflamação crônica e aguda da pele (por exemplo, modelos para hipersensibilidade do tipo atrasado (DTH) e hipersensibilidade de contato (CHS)) e existem modelos de deficiência de barreira que podem ser de interesse para investigar a contribuição da levedura commensal às patologias da pele.
Camundongos enredados mantidos condições específicas de patógeno livre (FPS) são (ao nosso conhecimento) não naturalmente colonizados com Malassezia. Portanto, a aplicação experimental de Malassezia para a pele da orelha do rato representa uma exposição primária ao fungo que induz uma resposta aguda no hospedeiro, o que por sua vez leva à limpeza fúngica dentro de 1 - 2 semanas7. Enquanto o modelo descrito neste protocolo, portanto, reflete apenas parcialmente a situação em seres humanos imunocompetentes ou outros organismos hospedeiros que são permanentemente colonizados com Malassezia, a infecção experimental permite uma ampla janela de oportunidade de estudar a imunidade antifúngica e os mecanismos celulares e moleculares subjacentes a essa resposta. Também permite investigar variações na resposta a diferentes espécies malassezia e cepas diferentes condições experimentais (por exemplo, com e sem ruptura de barreira da pele).
O estudo de Malassezia - interações host foram limitados no passado a experimentos in vitro com tipos de células isoladas em culturas (por exemplo, linhas de células queratinócitos, PBMCs). Embora esses estudos tenham derramado alguma luz sobre determinantes fúngicos e hospedeiros que moldam a interação entre Malassezia e o hospedeiro17,eles não permitem obter uma compreensão abrangente do fungo - interação do hospedeiro no complexo ambiente da pele, que envolve múltiplos tipos de células que estão em constante comunicação, tais como queratinócitos, fibroblastos e células imunes residentes em tecidos, mas também populações de leukócitos que se infiltram no tecido apenas após encontro microbiano do Pele. Esta rede multicelular não pode ser totalmente reproduzida nos modelos in vitro, mesmo com sistemas organóides mais avançados. Assim, a infecção experimental de camundongos ainda representa o padrão ouro na imunologia e pesquisa de doenças infecciosas, e a disponibilidade do modelo descrito aqui representa um avanço no campo da pesquisa malassezia. Importante, este modelo baseia-se na aplicação epicutânea de Malassezia na pele da orelha do rato de outra forma imperturbável, e não implica a inoculação do fungo por injeção no tecido, por exemplo, subcutânea ou intraperitoneally, como estudos anteriores relataram18, ambos os quais estão mais distantes da situação em hospedeiros colonizados naturalmente.
A possibilidade de combinar o modelo de infecção malassezia descrito neste protocolo com outros modelos de mouse disponíveis aumenta muito o escopo e a flexibilidade da aplicação. Estes últimos incluem vários modelos de distúrbios de pele específicos, como o modelo de deficiência de barreira que imita características importantes da dermatite atópica, uma doença associada com Malassezia em seres humanos e cães. Além disso, a infecção epicutânea da pele com Malassezia pode ser facilmente aplicada a camundongos com defeitos genéticos em genes hospedeiros de interesse, ou camundongos em que um tipo de interesse celular é geneticamente excluído ou pode ser farmacologicamente esgotado (por exemplo, por meio de administração de toxinas difteria em camundongos que expressam o receptor de toxina difteria). Tais modelos representam uma ferramenta inevitável para dissecar a resposta do hospedeiro aos micróbios commensal e patogênicos, incluindo Malassezia,e para avaliar o papel desses genes e do tipo de célula na interação fungo-hospedeiro. As análises da interação da pele malassezia-hospedeiropodem ser expandidas muito além do que é descrito neste protocolo. Estes incluem análises por histologia (por exemplo, para determinar o grau de patologia da pele ou o espessamento epidérmico induzido pelo fungo), por imunohistoquímica ou coloração imunofluorescente de seções de tecidos usando anticorpos dirigidos contra o tipo de célula marcadores específicos ou outras moléculas de interesse. Também pode envolver o isolamento de células (por exemplo, residentes de tecido ou subconjuntos de leukócitos infiltrados de tecido) do tecido da pele infectado para estudar a polarização, regulação e dinâmica da resposta imune a Malassezia em grande profundidade.

A pele é povoada por muitos micróbios diferentes. A exposição constante da pele à microbiota contribui para moldar e educar o sistema imunológico do hospedeiro. Os fungos são cada vez mais reconhecidos como uma parte vital da microbiota e eles cumprem um papel importante para a fisiologia e imunidade do hospedeiro, semelhante s bactérias e vírus1. Espécies do gênero Malassezia são, de longe, os fungos mais abundantes colonizando a pele de vertebrados de sangue quente e eles compõem mais de 90% do mycobiome pele humana2,3. Dezoito espécies diferentes de Malassezia foram identificadas até agora a partir da pele humana e animal4.
Acredita-se que várias patologias da pele surjam, pelo menos parcialmente, como resultado de uma composição de microbiota disequilibrada. A disbiose pode levar ao crescimento excessivo de espécies com potencial patogênico, resultando em infecções oportunistas e doença5. Consistentemente, há uma evidência crescente de que Malassezia, além de seu estilo de vida comensal, contribui para o desenvolvimento de várias patologias da pele, que vão desde caspa e piedade versicolor para distúrbios inflamatórios mais graves, tais como como dermatite seborréica e dermatite atópica4,6. Embora tenha sido estabelecida uma ligação causal entre Malassezia e pityriarsis versicolor, o papel fiopatológico do fungo em patologias de pele mais graves permanece em grande parte desconhecido.
Determinar o papel de Malassezia na homeostase e na doença da pele exige um conhecimento mais detalhado sobre a interação do fungo com a pele e o sistema imunitário cutâneo. De notar, a pesquisa sobre Malassezia é, em comparação com outros patógenos fúngicos humanos (por exemplo, Candida albicans ou Aspergillus fumigatus), ainda em fase incipiente. Isso pode ser atribuído à dificuldade no cultivo de Malassezia em condições laboratoriais e à falta de modelos experimentais adequados para estudar o fungo em contato com o hospedeiro in vivo. Experimentos anteriores com células isoladas na cultura indicaram uma ampla gama de interações diretas e indiretas entre Malassezia e várias células imunes e não imunes7. No entanto, esses experimentos in vitro apenas recapitulam parcialmente a situação do complexo ambiente de pele in vivo, onde numerosos eventos celulares e moleculares ocorrem concomitantemente entre o fungo e vários tipos de células.
Aqui, descrevemos o protocolo para um modelo experimental de infecção de pele Malassezia em camundongos, que recentemente estabelecemos, para estudar a interação fungo-hospedeiro in vivo7. Isso inclui procedimentos para (1) o cultivo bem sucedido de Malassezia in vitro, (2) a aplicação epicutânea de Malassezia na pele da orelha de urina, e (3) os detalhes técnicos de como analisar malasseziainduzida pele inflamação e o fardo fúngico da pele infectada. Importante, este modelo não depende de imunossupressão (por exemplo, por corticosteroides) ou tratamento antibiótico de camundongos antes da infecção, como é praticado em outros modelos de camundongos de infecção fúngica8,9. Por sua vez, permite estudar todo o espectro da resposta imune inata e adaptativa contra Malassezia na pele normal. De nota, camundongos do tipo selvagem consanguíneos mantidos condições específicas livres de patógenos (FPS) não são colonizados naturalmente com Malassezia e, portanto, sua exposição ao fungo não resulta em colonização persistente, mas é desmatada do hospedeiro dentro aproximadamente 1,5 semanas. No entanto, o modelo permite o estudo dos mecanismos de iniciação e regulação de resposta antifúngica do hospedeiro que, por sua vez, é a base de como a memória imune é gerada. O modelo é versátil na medida em que pode ser facilmente aplicado a uma grande variedade de cepas de camundongos geneticamente modificadas e pode ser combinado com outros modelos existentes de doenças de pele, como modelos de deficiência de barreira, para estudar o impacto de Malassezia condições patológicas e inflamatórias da pele7. Portanto, o modelo descrito de infecção experimental da pele malassezia em camundongos fornece um alto grau de flexibilidade para investigar a interação do fungo com o sistema imunológico da pele no contexto da homeostase e doença.
Este protocolo descreve a infecção experimental da pele dos ratos com spp de Malassezia. Devido a seu potencial patogênico, malassezia spp. são classificados como micróbios patogénicos BSL2 em alguns países, incluindo Switzerland. Por favor, verifique as diretrizes locais e siga os regulamentos das autoridades locais. Os organismos classificados com BSL2 devem ser manipulados por pessoal treinado um gabinete de biossegurança certificado pela BSL2 (BSC). Os resíduos biológicos contaminados com organismos classificados por BSL2, bem como carcaças de camundongos infectados com tais organismos, devem ser autocllaved antes do descarte. Para experimentos com camundongos, todos os esforços devem ser feitos para minimizar o sofrimento e garantir os mais altos padrões éticos e humanos de acordo com os princípios 3R (substituir, refinar, reduzir)10. Os experimentos descritos neste protocolo foram realizados com M. pachydermatis (ATCC 14522), M. furfur (ATCC 14521) e M. sympodialis (ATCC 42132)7.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1296-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attane Isoflurane</td>
			<td>Piramal Healthcare</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosaftey cabinet (BSC) Faster Ultra Safe</td>
			<td>DASIT GROUP</td>
			<td>TEC 5594</td>
			<td>BSL2 certified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415D</td>
			<td>compatible with 2ml Eppendorf tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dessicated Ox-bile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>70168-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tubes (2 ml)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 120.094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49159-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gylcerol (99 %)</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>10314830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Eickenmeyer</td>
			<td>648048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator Hereaus B20</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>412047753</td>
			<td>BSL2 certified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketasol (100 mg)</td>
			<td>Graeub AG</td>
			<td>6680416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magentic heating plate MR Hei-Standard</td>
			<td>Heidolph Instruments</td>
			<td>442-1355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malassezia spp.</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>14522, 14521, 42132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malt extract</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>70167-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiply Biosphere Tubes (200 &#181;l)</td>
			<td>Sarstedt AG</td>
			<td>7084211</td>
			<td>Safelock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Native olive oil</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>commerc. available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P40</td>
			<td>Axon Lab</td>
			<td>A1694,0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oditest measurment devise</td>
			<td>Kroeplin</td>
			<td>S0247</td>
			<td>range 0-5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75090-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Sarstedt AG</td>
			<td>82.1473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphat buffered salt solution (PBS, 1x)</td>
			<td>Amimed/Bioconcept</td>
			<td>3-05F39</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rompun (2 %)</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>KP0BFHR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator Infors Minitron</td>
			<td>Infors</td>
			<td>-</td>
			<td>BSL2 certified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrometer</td>
			<td>Jenway</td>
			<td>20308</td>
			<td>optical density measurement at 600nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrometer Cuvettes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>613101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel balls (5mm)</td>
			<td>ABF</td>
			<td>KU.5G80 1.3541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes 1 ml Sub-Q</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>305501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Lyzer II</td>
			<td>Quiagen</td>
			<td>85300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transpore Hypoallergic Tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>1527-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 40</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1504-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin A Retinoli Palmitas Eye Cream</td>
			<td>BAUSCH &#38; LOMB</td>
			<td></td>
			<td>commerc. available</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

infecting mice with malassezia spp. to study the fungus-host interaction

Os modelos animais são cruciais para a pesquisa de doenças infecciosas. Eles fornecem uma base importante para analisar todo o espectro de interações que ocorrem entre micróbios e seu hospedeiro in vivo de forma específica do tecido. Os fungos patogênicos são cada vez mais reconhecidos como uma séria ameaça para os seres humanos e explorar tais modelos de infecção melhoraram muito a nossa compreensão da patogenicidade fúngica. As espécies do gênero Malassezia são os fungos mais abundantes da microbiota da pele humana e também estão associadas ao desenvolvimento de doenças inflamatórias graves da pele, como dermatite seborréica e dermatite atópica. No entanto, uma ligação causal entre Malassezia e patogênese da doença permanece desconhecida, fato que pode ser atribuído ao mau conhecimento do complexo crosstalk de Malassezia com o sistema imunológico da pele. Este protocolo descreve o estabelecimento de um modelo experimental do rato que permita estudar a interação de Malassezia com a pele mamífero in vivo. Ele descreve o método para cultivar Malassezia spp. condições de laboratório, como infectar a pele de urina com Malassezia spp. e como avaliar o resultado da infecção por meio da inflamação da pele e análises de carga fúngica. O modelo descrito aqui funciona em animais totalmente imunocompetentes e não depende de pré-tratamento imunossupressor ou antibiótico dos animais. É, além disso, adaptável a praticamente todas as cepas de camundongos geneticamente modificadas e pode ser combinada com outros modelos de doenças de pele. Estas características fazem deste modelo da infecção uma ferramenta muito poderosa para estudar em detalhe a resposta imune inato e adaptativa do anfitrião de encontro a Malassezia na pele in vivo.

Cultivo in vitro de Malassezia Em comparação com outros patógenos modelo fúngico mais comumente usado, como C. albicans ou A. fumigatus, Malassezia é mais difícil de cultura in vitro. Isso pode ser atribuído ao fato de que Malassezia depende de fontes lipídicas exógenas para seus requisitos nutritivos, devido à sua incapacidade de sintetizar ácidos graxos11. O mDixon médio é adequado para a culturing várias espécies Malassezia incluindo M. pachydermatis, M. furfur, M. sympodialis, M. slooffiae, M. globosa e M. yamatoensis in vitro7 12de ano. A Figura 1 mostra imagens representativas para o crescimento de M. sympodialis em mDixon médio líquido e no mDixon ágar, conforme descrito no passo 1 e passo 2.
Análise da inflamação da pele e da carga fúngica da inflamação da pele malassezia A exposição de Malassezia à pele da orelha do rato que foi barreira interrompida por fita-descascamento antes da infecção resulta em inflamação exacerbada da pele, caracterizada por hiperplasia epidérmica e dérmica e desenvolvimento de edema7. Passo 4 e 5 delinear os métodos para analisar Malasseziainduzida inchaço da orelha e a carga fúngica da pele. Ambos os parâmetros representam leituras-chave para monitorar o curso da infecção. A Figura 2A ilustra o aumento da espessura da orelha que pode ser observado após a exposição de pele sm à pele que foi interrompida por barreiras em comparação com a pele imperturbável dos camundongos WT C57BL/6. A Figura 2B mostra um gráfico sumário representativo do aumento da espessura da orelha ao longo do tempo. Figura 2C exibe a carga fúngica na pele do ouvido no dia 2 após a infecção com M. paquidermate.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60175/60175fig01.jpg"> Figura 1: Cultivo in vitro de Malassezia. (A) M. sympodialis cepa ATCC 42132 cultivada por 3 dias a 30 °C e 180 rpm em mDixon líquido médio (esquerda) ao lado de um frasco Erlenmeyer controle contendo mDixon médio que não foi inoculado (direita). (B) Colônias de M. sympodialis estirpe ATCC 42132 em mDixon ágar após 5 dias de incubação a 30 °C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60175/60175fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste número.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60175/60175fig02.jpg"> Figura 2: Análise da infecção de pele malassezia com base na espessura da orelha e carga fúngica. (A) Histologia de seções de ouvido obtidas de camundongos C57BL/6 que foram tratados com azeite (veículo, à esquerda) ou infectados com m. peles cepa JPLK23 por 5 dias (meio e direito). À direita, a pele da orelha foi despojada antes da infecção. As seções foram manchadas com hematoxilina e eosina (H&E). (B) Gráficos sumários que mostram o aumento da espessura da orelha ao longo do tempo para camundongos C57BL/6 que foram expostos a Malassezia ou não infectados como controles. A espessura absoluta da cepa M. pachydermatis ATCC 14522-exposta ou veículo-tratado pele da orelha em cada ponto de tempo é exibido à esquerda; o aumento da espessura da orelha nos pontos de tempo indicados em relação à linha de base no dia 0 é mostrado à direita. (C)Carga fúngica na pele de camundongos C57BL/6 que foram infectados com m. paquidermate estirpe ATCC 14522 ou tratados com azeite como um controle (veículo). Em ambos os casos, a pele foi despojada. Cada símbolo nos gráficos sumários B e C representa um animal. A significância estatística das diferenças entre os grupos foi calculada usando a ANOVA (B) de sentido único ou o t-test do estudante (C). p <0.001, ****p <0.0001, D.L.: Limite de detecção <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60175/60175fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste número.</a>

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Infecting Mice with Malassezia spp. to Study the Fungus-Host Interaction

Este protocolo descreve o estabelecimento de um modelo de camundongo para estudar malassezia-hostinterações na pele. Descreve o cultivo de Malassezia in vitro, a infecção da pele de urina com Malassezia,e a análise subseqüente da inflamação e da carga fúngica no tecido da pele.

Infectando ratos com malassezia spp. para estudar a interação Fungo-Host

Animal models are crucial for infectious disease research. They provide an important basis for analyzing the full spectrum of interactions that occur ...

Este protocolo descreve o estabelecimento de um novo modelo de camundongo para estudar o fungo da pele, malassezia, e sua interação com a pele dos mamíferos in vivo. Em contraste com abordagens in vitro, este modelo de infecção permite o estudo de mecanismos imunológicos inatos e adaptativos contra malassezia em plena complexidade e de forma específica do tecido. A malassezia está associada a vários distúrbios da pele, como dermatite atópica.Entender a resposta imune ao fungo pode fornecer novas estratégias para tratar doenças inflamatórias inflamatórias tão frequentes e crônicas da pele. A infecção experimental de pele com Malassezia fornece um modelo muito aguardado para estudar como os fungos commensais da pele modulam o sistema imunológico e, assim, impactam o curso e a gravidade de vários distúrbios da pele. Para preparar um inóculo malassezia adicione 10 mililitros de mDixon líquido médio e três a cinco colônias individuais malassezia de uma placa de ágar mDixon a um frasco estéril de 100 mililitros Erlenmeyer.Em seguida, coloque o frasco a 30 graus Celsius e 180 rotações por minuto durante 48 a 96 horas. Quando a cultura for cor de creme e turva, transfira dois mililitros da cultura em um tubo de microcentrífugo estéril de dois mililitros e sedimente a levedura por centrifugação. Resuspend a pelota em um mililitro de PBS para uma segunda centrifugação seguida de resuspensão em um mililitro de PBS fresco com tubulação vigorosa.Diluir a suspensão malassezia 20 a 50 vezes com PBS para garantir que a leitura esteja entre 0,1 e um e medir o OD 600 em um espectrômetro. Aliquot um volume da suspensão malassezia em PBS que corresponde a um OD 600 de quatro em um tubo estéril de dois mililitros por animal para ser infectado e sedimentar a levedura por centrifugação. Em seguida, resuspend as pelotas em 200 microliters de azeite nativo.Para iniciar uma infecção pela Malassezia, confirme a falta de resposta ao reflexo do pedal em um camundongo C57 Black6 fêmea anestinado de seis a oito semanas de idade e aplique pomada aos olhos do animal. Use uma pinça para medir a espessura de duas áreas diferentes de ambas as orelhas para permitir o cálculo da espessura média por orelha. Em seguida, aplique um pequeno pedaço de fita na pele de uma orelha antes de remover rapidamente a fita da pele da orelha cinco vezes usando um novo pedaço de fita cada vez.Após a desmontagem, use uma pipeta estéril para aplicar 100 microlitadores da suspensão do azeite malassezia ao lado dorsal de cada orelha e injete 200 microliters de solução de glicose estéril e pré-armada de 2%subcutânea na dobra nucal para suportar o metabolismo e a reidratação. Em seguida, deixe o rato se recuperar em uma almofada de aquecimento por 30 minutos com monitoramento antes de devolver o animal à sua gaiola. Nos pontos de tempo experimentais apropriados, use uma pinça para medir duas áreas diferentes de cada orelha de rato para permitir o cálculo da espessura média por orelha.Para medir a carga fúngica na pele infectada, adicione 500 microliters de 0,05% NP40 em água destilada e uma bola de aço de cinco mililitros autoclavados de diâmetro para um tubo de microcentrifuuge de dois mililitros por orelha e pese cada tubo em um equilíbrio. Em seguida, colde as orelhas de cada animal na base e coloque os tecidos em tubos individuais de NP40. Pesar cada tubo na balança para determinar o peso de cada amostra de ouvido antes de homogeneizar os tecidos auditivos por seis minutos a 25 Hertz.Em seguida, distribua 100 microlitadores de cada amostra em placas de ágar mDixon e distribua as suspensões de forma homogênea através do ágar antes de sua incubação de cabeça para baixo a 30 graus Celsius. Aqui são mostradas imagens representativas para o crescimento de sympodialis malassezia em mDixon líquido médio e no ágar mDixon, como demonstrado. Um aumento na espessura da orelha pode ser observado após a aplicação de furfur malassezia na pele que foi rompida em comparação com a pele não perturbada de camundongos c57 black6 tipo selvagem.De fato, a quantificação do aumento da espessura da orelha ao longo do tempo revela que a mudança na espessura é significativa em comparação com a pele tratada pelo veículo. Além disso, a carga fúngica na pele do ouvido no segundo dia após a infecção com paquidermatis malassezia está 100 a 1000 vezes acima do limite de detecção. Malassezia tende a formar agregados e não é facilmente suspensível.Portanto, garanta a homogeneização da suspensão do fungo do óleo por vórtice extensivo. Leituras adicionais podem incluir, histologia para determinar a patologia da pele e o isolamento de células imunes da pele e linfonodos drenantes para investigar a resposta imune antifúngica. Esse modelo abre as oportunidades para estudar a resposta imune contra malassezia e investigar o papel do fungo como commensal no contexto de vários distúrbios da pele.As espécies malassezia são classificadas como organismos BSL-2 em alguns países. Certifique-se de seguir a regulamentação de suas autoridades locais e usar as medidas de segurança adequadas.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Desenvolvimento de um<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema modelo para estudar a interacção de<em&gt; Equus</em&gt;<em&gt; Caballus</em&gt; IgE ao seu receptor de elevada afinidade FceRI

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Análise de Linfócitos extravasamento Usando um<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo do Sangue-Cérebro humano Barreira

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

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Sobreexpressão e purificação do ser humano<em&gt; Cis</em&gt; -preniltransferase em<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

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Uma plataforma de alto rendimento para o rastreio de Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Induction of Drug-Induced, Autoimmune Hepatitis in BALB/c Mice for the Study of Its Pathogenic Mechanisms

Indução de Hepatite Autoimune Induzida por Drogas em CAMUNDONGOS BALB/c para o Estudo de Seus Mecanismos Patogênicos

Drug-induced autoimmune hepatitis (DIH) is the most common hepatic drug-induced hypersensitization process observed in approximately 9 to 12% of patients ...