Name: infecting mice with malassezia spp. to study the fungus-host interaction
Uploaded: 2019-11-06T13:00:00
Duration: 6 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Infecting Mice with Malassezia spp. to Study the Fungus-Host Interaction at JoVE.com

Эта работа была поддержана Цюрихским университетом, Швейцария.

<ol>
	<li>Iliev, I. D., Leonardi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+dysbiosis:+immunity+and+interactions+at+mucosal+barriers.">Fungal dysbiosis: immunity and interactions at mucosal barriers.</a> Nature Reviews Immunology. 17 (10), 635-646 (2017).</li><li>Findley, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographic+diversity+of+fungal+and+bacterial+communities+in+human+skin.">Topographic diversity of fungal and bacterial communities in human skin.</a> Nature. 498 (7454), 367-370 (2013).</li><li>Gemmer, C. M., DeAngelis, Y. M., Theelen, B., Boekhout, T., Dawson, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast,+noninvasive+method+for+molecular+detection+and+differentiation+of+Malassezia+yeast+species+on+human+skin+and+application+of+the+method+to+dandruff+microbiology.">Fast, noninvasive method for molecular detection and differentiation of Malassezia yeast species on human skin and application of the method to dandruff microbiology.</a> Journal of Clinical Microbiology. 40 (9), 3350-3357 (2002).</li><li>Theelen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malassezia+ecology,+pathophysiology,+and+treatment.">Malassezia ecology, pathophysiology, and treatment.</a> Medical Mycology. 56, 10-25 (2018).</li><li>Williams, M. R., Gallo, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+skin+microbiome+in+atopic+dermatitis.">The role of the skin microbiome in atopic dermatitis.</a> Current Allergy and Asthma Reports. 15 (11), 65 (2015).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Malassezia and the Skin. , (2010).</li><li>Sparber, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Skin+Commensal+Yeast+Malassezia+Triggers+a+Type+17+Response+that+Coordinates+Anti-fungal+Immunity+and+Exacerbates+Skin+Inflammation.">The Skin Commensal Yeast Malassezia Triggers a Type 17 Response that Coordinates Anti-fungal Immunity and Exacerbates Skin Inflammation.</a> Cell Host Microbe. 25 (3), 389-403 (2019).</li><li>Koh, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+models+of+Candida+gastrointestinal+colonization+and+dissemination.">Murine models of Candida gastrointestinal colonization and dissemination.</a> Eukaryotic Cell. 12 (11), 1416-1422 (2013).</li><li>Solis, N. V., Filler, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+of+oropharyngeal+candidiasis.">Mouse model of oropharyngeal candidiasis.</a> Nature Protocols. 7 (4), 637-642 (2012).</li><li>Russel, W. M. S., Burch, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Principles of Humane Experimental Technique. , (1959).</li><li>Wu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genus-Wide+Comparative+Genomics+of+Malassezia+Delineates+Its+Phylogeny,+Physiology,+and+Niche+Adaptation+on+Human+Skin.">Genus-Wide Comparative Genomics of Malassezia Delineates Its Phylogeny, Physiology, and Niche Adaptation on Human Skin.</a> PLoS Genetics. 11 (11), 1005614 (2015).</li><li>Leong, C., Buttafuoco, A., Glatz, M., Bosshard, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifungal+Susceptibility+Testing+of+Malassezia+spp.+with+an+Optimized+Colorimetric+Broth+Microdilution+Method.">Antifungal Susceptibility Testing of Malassezia spp. with an Optimized Colorimetric Broth Microdilution Method.</a> Journal of Clinical Microbiology. 55 (6), 1883-1893 (2017).</li><li>Schonherr, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intraspecies+diversity+of+C.+albicans+triggers+qualitatively+and+temporally+distinct+host+responses+that+determine+the+balance+between+commensalism+and+pathogenicity.">The intraspecies diversity of C. albicans triggers qualitatively and temporally distinct host responses that determine the balance between commensalism and pathogenicity.</a> Mucosal Immunology. 10 (5), 1335-1350 (2017).</li><li>Igyarto, B. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin-resident+murine+dendritic+cell+subsets+promote+distinct+and+opposing+antigen-specific+T+helper+cell+responses.">Skin-resident murine dendritic cell subsets promote distinct and opposing antigen-specific T helper cell responses.</a> Immunity. 35 (2), 260-272 (2011).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+Epicutaneous+Exposure+Drives+Skin+Inflammation+via+IL-36-Mediated+T+Cell+Responses.">Staphylococcus aureus Epicutaneous Exposure Drives Skin Inflammation via IL-36-Mediated T Cell Responses.</a> Cell Host Microbe. 22 (5), 653-666 (2017).</li><li>Nakagawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+Virulent+PSMalpha+Peptides+Induce+Keratinocyte+Alarmin+Release+to+Orchestrate+IL-17-Dependent+Skin+Inflammation.">Staphylococcus aureus Virulent PSMalpha Peptides Induce Keratinocyte Alarmin Release to Orchestrate IL-17-Dependent Skin Inflammation.</a> Cell Host Microbe. 22 (5), 667-677 (2017).</li><li>Sparber, F., LeibundGut-Landmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+Responses+to+Malassezia+spp.+in+the+Mammalian+Skin.">Host Responses to Malassezia spp. in the Mammalian Skin.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1614 (2017).</li><li>Yamasaki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-type+lectin+Mincle+is+an+activating+receptor+for+pathogenic+fungus,+Malassezia.">C-type lectin Mincle is an activating receptor for pathogenic fungus, Malassezia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (6), 1897-1902 (2009).</li></ol>

Авторам нечего раскрывать.

Этот протокол описывает инфекцию кожи широко используемого инбредного штамма мыши C57BL/6 Malassezia spp. Адаптация этого протокола к другим штаммам мыши с другим генетическим фоном (например, Balb/c) или генетически модифицированной мышью штаммы могут нуждаться в корректировке дозы инфекции, точечный момент (ы) анализа и т.д. Для обеспечения воспроизводимости, группы мышей всегда должны быть одного возраста и пола. Источник мышей должен быть стабильным, так как даже незначительные изменения в генетическом фоне и различия в микробиоте, которые существуют между поставщиками и могут существовать даже между различными единицами одного племенного предприятия, могут иметь непредсказуемое воздействие на инфекции. При настройке модели инфекции Malassezia, описанной в данном протоколе, рекомендуется провести экспериментальное исследование, чтобы тщательно контролировать ход инфекции, включая степень колонизации, кинетику грибкового зазора и степень воспаление и патология, которые могут быть индуцированы (например, если ухо кожи барьер-нарушендо до инфекции), чтобы определить оптимальные условия проверки.
Для обеспечения воспроизводимости и надежного выявления различий между экспериментальными группами количество животных, используемых в группе, должно быть рассчитано на основе статистического анализа. Размер выборки рассчитывается на основе размера эффекта, частоты ошибок и мощности, которые учитывают биологические и экспериментальные вариации (например, из-за изменения в иммунной системе). По этическим соображениям избегайте использования неоправданно большого количества животных. Что касается malassezia инфекции кожи, лечение только одно ухо с грибком и с помощью другого уха в качестве контроля в той же мыши, не рекомендуется, потому что мыши могут распространить грибок на оба уха при уходе. Тем не менее, использование 1 / 2 уха для различных методологических читать выходы, такие как определение грибковой нагрузки, изоляция иммунных клеток или гистологический анализ часто достаточно и приводит к значительному сокращению численности животных, используемых для экспериментов.
На сегодняшний день описано 18 различных видов малассезии. Меж- и внутривидовые вариации в роде Malassezia могут повлиять на взаимодействие с хозяином, как мы также узнали из исследований по другим человеческим патогенным грибам13. Различные виды и штаммы малассезии различаются по происхождению (например, M. pachydermatis является наиболее частым видом, изолированным от животных, в то время как M. restricta, M. globosa и M. sympodialis являются наиболее видных членов грибковой микробиом кожи у людей с переменным распределением этих видов между различными участками кожи). Некоторые виды были связаны с комменсализмом, в то время как другие считаются более патогенными, хотя подробные данные остаются относительно слабыми. Важно отметить, что некоторые виды и штаммы по своей сути труднее расти, чем другие. Таким образом, решение о том, какие виды/деформации использовать для инфекции, должно основываться на исследовательском вопросе.
Экспериментальная инфекция кожи мурин с некоторыми микробными организмами, такими как Candida albicans или золотистый стафилококк требуют нарушения эпидермального барьера до инфекции, например, с песчаной бумагой14, 15,16. В отличие от этого, модель инфекции Malassezia описано здесь одинаково эффективно с и без барьера нарушения7. Степень воспаления, вызванного грибком, значительно усиливается, если кожа лента раздели до инфекции7. Поэтому, следует ли манипулировать кожей до применения Malassezia зависит от вопроса исследования. Существуют различные модели хронического и острого воспаления кожи (например, модели для гиперчувствительности отложенного типа (DTH) и контактной гиперчувствительности (CHS)) и модели барьерного дефицита, которые могут представлять интерес для исследования вклада сопутствующих дрожжей к кожных патологиям.
Инбреты мышей поддерживается в соответствии с конкретными патогена свободных (SPF) условия (насколько нам известно) не естественно колонизированы с Malassezia. Таким образом, экспериментальное применение Malassezia на кожу мыши ухо представляет собой первичное воздействие грибка, который вызывает острую реакцию у хозяина, который, в свою очередь, приводит к грибкового зазора в течение 1 - 2 недель7. Хотя модель, описанная в этом протоколе, поэтому лишь частично отражает ситуацию в иммунокомпетентных людей или других организмов хозяина, которые постоянно колонизированы с Malassezia, экспериментальная инфекция позволяет достаточно окно возможность изучения противогрибкового иммунитета и клеточных и молекулярных механизмов, лежащих в основе этой реакции. Он также позволяет исследовать различия в реакции на различные виды малассезии и штаммы в различных экспериментальных условиях (например, с и без барьера нарушения кожи).
Изучение Malassezia - взаимодействия хозяина были ограничены в прошлом, чтобы в пробирке эксперименты с изолированными типами клеток в культурах (например, кератиноцитов клеточных линий, PBMCs). Хотя эти исследования пролили некоторый свет на грибковые и принимающие детерминанты, которые формируют взаимодействие между Malassezia и принимающей17, они не позволяют получить полное понимание гриба - принимающей взаимодействия в комплексе окружающей среды кожи, которая включает в себя несколько типов клеток, которые находятся в постоянной связи, таких как кератиноциты, фибробласты и ткани-резидентиммунных иммунных клеток, но и лейкоцитов населения, которые проникают в ткани только при микробной встрече Кожи. Эта многоклеточная сеть не может быть полностью воспроизведена в моделях in vitro, даже с самыми передовыми органоидными системами. Таким образом, экспериментальная инфекция мышей по-прежнему представляет собой золотой стандарт в иммунологии и инфекционных заболеваний исследований, и наличие модели, описанной здесь представляет собой прорыв в области исследований Malassezia. Важно отметить, что эта модель опирается на эпикутанеозное применение Malassezia на иначе невозмутимой кожи мыши уха, и это не подразумевает прививку грибка путем инъекции в ткани, например, подкожно или интраперитоне, как Предыдущие исследования сообщили18, оба из которых более далеки от ситуации в естественно колонизированных хостов.
Возможность совместить модель инфекции Malassezia, описанную в этом протоколе, с другими доступными моделями мыши значительно увеличивает объем и гибкость применения. Последние включают в себя различные модели специфических кожных заболеваний, таких как модель барьерного дефицита, который имитирует важные особенности атопического дерматита, болезни, связанной с Malassezia у людей и собак. Кроме того, эпикутанетная инфекция кожи с Malassezia может быть легко применена к мышам с генетическими дефектами в генах-хозяинах, представляющих интерес, или мышей, в которых тип интереса клетки генетически удалены или могут быть фармакологически истощены (например, с помощью средств введения дифтерии токсина в дифтерии токсина рецепторов-выражающих мышей). Такие модели представляют собой неизбежный инструмент для вскрытия принимающей реакции на сопутствующие и патогенные микробы, в том числе Malassezia, и оценить роль этих генов и типа клеток в взаимодействии гриба-хозяина. Анализ взаимодействия кожи Малассезия-хозяинаможет быть расширен далеко за пределы того, что описано в этом протоколе. К ним относятся анализы гистологии (например, для определения степени патологии кожи или эпидермального утолщения, индуцированного грибком), иммуногистохимией или иммунофлуоресцентным окрашиванием секций тканей с использованием антител, направленных против клеточного типа конкретные маркеры или другие молекулы, представляющие интерес. Это также может включать в себя изоляцию клеток (например, ткани резидентов или ткани инфильтрации лейкоцитов подмножества) от инфицированных тканей кожи для изучения поляризации, регулирования и динамики иммунного ответа на Malassezia в большой глубине.

Кожа населена множеством различных микробов. Постоянное воздействие кожи на микробиоту способствует формированию и обучению иммунной системы хозяина. Грибы все чаще признаются как жизненно важная часть микробиоты, и они выполняют важную роль для принимающей физиологии и иммунитета, похожие на бактерии и вирусы1. Виды рода Malassezia на сегодняшний день являются наиболее распространенными грибами колонизации кожи теплокровных позвоночных, и они составляют более 90% человеческой кожи микобиом2,3. Восемнадцать различных видов Malassezia до сих пор были определены из человека и животного кожи4.
Различные патологии кожи, как полагают, возникают, по крайней мере частично, в результате диссбалансированного состава микробиоты. Дисбактериоз может привести к разрастанию видов с патогенным потенциалом, что приводит к оппортунистическим инфекциям и болезни5. Последовательно, есть все больше доказательств того, что Malassezia, помимо его сословия образа жизни, способствует развитию различных патологий кожи, начиная от перхоти и pityriarsis versicolor к более тяжелым воспалительным расстройствам, такие как как себорейный дерматит и атопический дерматит4,6. Хотя причинно-следственная связь между Malassezia и pityriarsis versicolor была установлена, патофизиологическая роль гриба в более тяжелых патологий кожи остается в значительной степени неизвестно.
Определение роли Malassezia в гомеостазе кожи и болезни требует более углубленного знания о взаимодействии гриба с кожей и кожной иммунной системы. Следует отметить, что исследования по Malassezia, по сравнению с другими человеческими грибковых патогенов (например, Candida albicans или Aspergillus fumigatus), все еще в молодой стадии. Это можно объяснить трудностями в выращивании Malassezia в лабораторных условиях и отсутствием соответствующих экспериментальных моделей для изучения гриба в контакте с хозяином in vivo. Предыдущие эксперименты с изолированными клетками в культуре показали широкий спектр прямых и косвенных взаимодействий между Malassezia и различных иммунных и неиммунных клеток7. Тем не менее, эти эксперименты in vitro лишь частично резюмируют ситуацию сложной среды кожи in vivo, где одновременно происходят многочисленные клеточные и молекулярные события между грибком и различными типами клеток.
В этом случае мы наметили протокол для экспериментальной модели инфекции кожи Malassezia у мышей, которую мы недавно установили, для изучения взаимодействия гриба-хозяина in vivo7. Это включает в себя процедуры для (1) успешного выращивания Malassezia in vitro, (2) эпикутанеозное применение Malassezia на кожу уха, и (3) технические детали того, как анализировать Маласезияиндуцированной кожи воспаление и грибковое бремя инфицированной кожи. Важно отметить, что эта модель не опирается на иммуносупрессию (например, кортикостероиды) или лечение антибиотиками мышей до инфекции, как это практикуется в других моделях мыши грибковой инфекции8,9. В свою очередь, это позволяет изучать весь спектр врожденного и адаптивного иммунного ответа против Malassezia в нормальной коже. Следует отметить, что инбредные мыши дикого типа, соблюдаемые в специфических условиях без патогена (SPF), естественным образом не колонизированы с Малассезией и, следовательно, их воздействие гриба не приводит к постоянной колонизации, но очищается от хозяина внутри около 1,5 недель. Однако модель позволяет изучать механизмы инициирования и регуляции реакции противогрибкового хозяина, что, в свою очередь, является основой того, как генерируется иммунная память. Модель является универсальной в том, что она может быть легко применена к широкому спектру генетически модифицированных штаммов мыши и может быть объединена с другими существующими моделями кожных заболеваний, таких как модели барьерного дефицита, для изучения воздействия Malassezia под патологические и воспалительные заболевания кожи7. Таким образом, описанная модель экспериментальной инфекции кожи Malassezia у мышей обеспечивает высокую степень гибкости для исследования взаимодействия гриба с иммунной системой кожи в контексте гомеостаза и болезни.
Этот протокол описывает экспериментальную инфекцию кожи мышей с Malassezia spp. Из-за его патогенного потенциала, Malassezia spp. классифицируются как ПАтогенные микроорганизмы BSL2 в некоторых странах, включая Швейцарию. Пожалуйста, проверьте местные руководящие принципы и следуйте правилам местных властей. BSL2 классифицированных организмов должны обрабатываться квалифицированным персоналом в соответствии с BSL2 сертифицированных биобезопасности кабинета (BSC). Биологические отходы, загрязненные организмами, классифицированными BSL2, а также туши мышей, инфицированных такими организмами, должны быть аутоклавированы до их удаления. Для экспериментов с мышами необходимо приложить все усилия, чтобы свести к минимуму страдания и обеспечить высочайшие этические и гуманные стандарты в соответствии с принципами 3R (заменить, уточнить, уменьшить)10. Эксперименты, описанные в этом протоколе, были проведены с Помощью M. pachydermatis (ATCC 14522), M. furfur (ATCC 14521) и M. sympodialis (ATCC 42132)7.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1296-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attane Isoflurane</td>
			<td>Piramal Healthcare</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosaftey cabinet (BSC) Faster Ultra Safe</td>
			<td>DASIT GROUP</td>
			<td>TEC 5594</td>
			<td>BSL2 certified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415D</td>
			<td>compatible with 2ml Eppendorf tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dessicated Ox-bile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>70168-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tubes (2 ml)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 120.094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49159-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gylcerol (99 %)</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>10314830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Eickenmeyer</td>
			<td>648048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator Hereaus B20</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>412047753</td>
			<td>BSL2 certified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketasol (100 mg)</td>
			<td>Graeub AG</td>
			<td>6680416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magentic heating plate MR Hei-Standard</td>
			<td>Heidolph Instruments</td>
			<td>442-1355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malassezia spp.</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>14522, 14521, 42132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malt extract</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>70167-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiply Biosphere Tubes (200 &#181;l)</td>
			<td>Sarstedt AG</td>
			<td>7084211</td>
			<td>Safelock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Native olive oil</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>commerc. available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P40</td>
			<td>Axon Lab</td>
			<td>A1694,0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oditest measurment devise</td>
			<td>Kroeplin</td>
			<td>S0247</td>
			<td>range 0-5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75090-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Sarstedt AG</td>
			<td>82.1473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphat buffered salt solution (PBS, 1x)</td>
			<td>Amimed/Bioconcept</td>
			<td>3-05F39</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rompun (2 %)</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>KP0BFHR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator Infors Minitron</td>
			<td>Infors</td>
			<td>-</td>
			<td>BSL2 certified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrometer</td>
			<td>Jenway</td>
			<td>20308</td>
			<td>optical density measurement at 600nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrometer Cuvettes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>613101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel balls (5mm)</td>
			<td>ABF</td>
			<td>KU.5G80 1.3541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes 1 ml Sub-Q</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>305501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Lyzer II</td>
			<td>Quiagen</td>
			<td>85300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transpore Hypoallergic Tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>1527-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 40</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1504-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin A Retinoli Palmitas Eye Cream</td>
			<td>BAUSCH &#38; LOMB</td>
			<td></td>
			<td>commerc. available</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

infecting mice with malassezia spp. to study the fungus-host interaction

Модели животных имеют решающее значение для исследований инфекционных заболеваний. Они обеспечивают важную основу для анализа всего спектра взаимодействий, которые происходят между микробами и их хозяина in vivo в ткани-специфическим образом. Патогенные грибы все чаще признаются в качестве серьезной угрозы для людей и эксплуатации таких моделей инфекции значительно улучшили наше понимание грибковой патогенности. Виды рода Malassezia являются наиболее распространенными грибами микробиоты кожи человека, и они также связаны с развитием тяжелых воспалительных кожных заболеваний, таких как себорейный дерматит и атопический дерматит. Тем не менее, причинно-следственная связь между Malassezia и патогенез болезни остается неизвестным, факт, который может быть связано с плохим знанием сложного перекрестного разговора Malassezia с иммунной системой кожи. Этот протокол описывает создание экспериментальной модели мыши, которая позволяет изучать взаимодействие Malassezia с кожей млекопитающих in vivo. В нем излагается метод выращивания Malassezia spp. в лабораторных условиях, как заразить кожу мурин с помощью Malassezia spp. и как оценить исход инфекции с помощью воспаления кожи и грибковых анализов бремени. Описанная здесь модель работает у полностью иммунокомпетентных животных и не полагается на иммунную супрессивную или антибиотиковую предварительную обработку животных. Кроме того, он адаптируется практически ко всем генетически модифицированным штаммам мыши и может быть объединен с другими моделями кожных заболеваний. Эти особенности делают эту модель инфекции очень мощным инструментом для детального изучения врожденного и адаптивного иммунного ответа хозяина против Malassezia в коже in vivo.

В пробирке выращивания Malassezia По сравнению с другими более часто используемыми грибковыми патогенами модели, такими как C. albicans или A. fumigatus, Malassezia труднее культивировать в пробирке. Это можно объяснить тем фактом, что Malassezia полагается на экзогенные липидные источники для своих питательных потребностей, из-за его неспособности синтезировать жирные кислоты11. Среда mDixon подходит для культивирования нескольких видов Малассезии, включая M. pachydermatis, M. furfur, M. sympodialis, M. slooffiae, M. globosa и M. yamatoensis in vitro7 ,12. На рисунке 1 показаны репрезентативные изображения для роста M. sympodialis в жидкой среде mDixon и на агаре mDixon, как описано в шаге 1 и шаге 2.
Анализ воспаления кожи и грибкового бремени воспаления кожи Малассезии Воздействие Malassezia на кожу мыши уха, которая была барьер нарушается лентой-зачистки до инфекции приводит к обострению воспаления кожи, характеризуется эпидермальной и дермальной гиперплазии и развития отеков7. Шаг 4 и 5 наметить методы для анализа Malassezia-индуцированнойотек уха и грибковое бремя кожи. Оба параметра представляют собой ключевые считывания для мониторинга течения инфекции. Рисунок 2иллюстрирует увеличение толщины уха, которое можно наблюдать после воздействия М. фуры на кожу, которая была нарушена по сравнению с невозмутимым кожей мышей WT C57BL/6. На рисунке 2B показан репрезентативный сводный график увеличения толщины уха с течением времени. Рисунок 2C отображает грибковое бремя в коже уха на второй день после заражения M. pachydermatis.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60175/60175fig01.jpg"> Рисунок 1: В пробирке выращивания Malassezia. (A) M. sympodialis штамм ATCC 42132 выросли в течение 3 дней при 30 градусах По кв и 180 об/мин в жидком мДиксон среды (слева) рядом с контролем Erlenmeyer колбу, содержащую mDixon среды, которая не была привита (справа). (B) Колонии M. sympodialis штамм ATCC 42132 на mDixon агар после 5 дней инкубации при 30 градусах Цельсия. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60175/60175fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60175/60175fig02.jpg"> Рисунок 2: Анализ инфекции кожи Малассезии на основе толщины уха и грибковой нагрузки. (A) Гистология ушных секций, полученных от мышей C57BL/6, которые лечились оливковым маслом (автомобиль, слева) или заражены штаммом M. furfur JPLK23 в течение 5 дней (средний и правый). Справа, ухо кожи была лентой-полосатый до инфекции. Разделы были окрашены гематоксилин и эозин (H и E). (B) Резюме графики, показывающие увеличение толщины уха с течением времени для C57BL/6 мышей, которые подверглись воздействию Malassezia или оставили неинфицированных в качестве контроля. Абсолютная толщина штамма M. pachydermatis ATCC 14522-экспонированных или транспортных средств обработанных ухо кожи в каждый момент времени отображается слева; увеличение толщины уха в указанные временные точки относительно базовой линии на 0 день показано справа. (C) Грибковое бремя в коже C57BL/6 мышей, которые были инфицированы штаммом M. pachydermatis ATCC 14522 или обработаны оливковым маслом в качестве контроля (транспортного средства). В обоих случаях кожа была обрезана лентой. Каждый символ в сводных графиках B и C представляет собой одно животное. Статистическая значимость различий между группами была рассчитана с использованием одностороннего ANOVA (B) или студенческого t-теста (C). р lt;0.001, "p йlt;0.0001, D.L.: Ограничение обнаружения <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60175/60175fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Infecting Mice with Malassezia spp. to Study the Fungus-Host Interaction at JoVE.com

Infecting Mice with Malassezia spp. to Study the Fungus-Host Interaction

Этот протокол описывает создание мышиной модели для изучения взаимодействия Malassezia-хозяинав коже. Он описывает выращивание Malassezia in vitro, инфекции кожи морин с Malassezia, и последующий анализ воспаления и грибковой нагрузки в ткани кожи.

Заражение мышей с Malassezia spp. для изучения взаимодействия гриба-хозяина

Animal models are crucial for infectious disease research. They provide an important basis for analyzing the full spectrum of interactions that occur ...

Этот протокол описывает создание новой модели мыши для изучения грибка кожи, Malassezia, и его взаимодействие с кожей млекопитающих in vivo. В отличие от подходов in vitro, эта модель инфекции позволяет изучать врожденные и адаптивные иммунные механизмы против Malassezia в полной сложности и в ткани специфическим образом. Малассезия связана с различными кожными расстройствами, такими как атопический дерматит.Понимание иммунного ответа на гриб может обеспечить новые стратегии для лечения таких частых и хронических воспалительных заболеваний кожи. Экспериментальная инфекция кожи с Malassezia обеспечивает долгожданную модель для изучения того, как кожа commensal грибы модулировать иммунную систему и тем самым повлиять на ход и тяжесть различных кожных заболеваний. Для подготовки Malassezia inoculum добавьте 10 миллилитров жидкой mDixon средней и от трех до пяти отдельных колоний Malassezia из пластины mDixon agar в стерильную 100-миллилитровую колбу Эрленмайера.Затем поместите колбу при 30 градусах цельсия и 180 вращениях в минуту в течение 48-96 часов. Когда культура кремового цвета и мутная, перенесите два миллилитров культуры в стерильную двухмилитровую микроцентрифугную трубку и осадите дрожжи центрифугированием. Повторное распределение гранул в один миллилитр PBS для второй центрифугации с последующим повторное успение в один миллилитр свежего PBS с энергичной пипетки.Разбавить подвеску Malassezia 20 до 50 раз с PBS, чтобы убедиться, что показания между 0,1 и один и измерить OD 600 на спектрометре. Aliquot том подвески Malassezia в PBS, что соответствует OD 600 из четырех в один стерильный две миллилитровые трубки на животное, чтобы быть инфицированы и осадок дрожжей центрифугации. Затем повторно посовесить гранулы в 200 микролитров родного оливкового масла.Чтобы инициировать инфекцию Malassezia, подтвердите отсутствие реакции на педаль рефлекс в анестезировали шесть-восемь недель самка C57 Black6 мыши и применить мазь к глазам животного. Используйте калипер для измерения толщины двух различных областей обоих ушей, чтобы позволить расчет средней толщины на ухо. Затем нанесите небольшой кусок ленты на кожу одного уха, прежде чем быстро удалить ленту из кожи уха пять раз с помощью нового куска ленты каждый раз.После зачистки используйте стерильную пипетку, чтобы нанести 100 микролитров подвески оливкового масла Malassezia на спинную сторону каждого уха и ввести 200 микролитров стерильных, предварительно подкожных растворов глюкозы в нухальную складку для поддержки метаболизма и регидратации. Затем позвольте мыши восстановиться на грелке в течение 30 минут с мониторингом, прежде чем вернуть животное в клетку. В соответствующих экспериментальных точек времени, использовать калипер для измерения двух различных областях каждого уха мыши, чтобы позволить расчет средней толщины на ухо.Чтобы измерить грибковое бремя в инфицированной коже, добавьте 500 микролитров стерильных 0,05%NP40 в дистиллированной воде и автоклавный стальной шар диаметром пять миллилитров в одну двухми миллилитровую микроцентрифугную трубку на ухо и взвесьте каждую трубку на балансе. Затем, урожай уши от каждого животного у основания и поместить ткани в отдельные трубки NP40. Взвесить каждую трубку на балансе, чтобы определить вес каждого образца уха, прежде чем гомогенизации тканей уха в течение шести минут на 25 Герц.Затем обойтись 100 микролитров каждого образца на mDixon агар пластин и распространять подвески однородно через агар до их перевернутой инкубации при 30 градусов по Цельсию. Здесь показаны репрезентативные изображения для роста Malassezia sympodialis в жидкой среде mDixon и на mDixon agar, как показано на фото. Увеличение толщины уха можно наблюдать после применения Malassezia furfur к коже, которая была нарушена барьером по сравнению с невозмутимой кожей диких мышей типа C57 Black6.Действительно, количественная оценка увеличения толщины уха с течением времени показывает, что изменение толщины является значительным по сравнению с автомобилем обработанной кожи. Кроме того, грибковое бремя в коже уха на второй день после заражения Malassezia pachydermatis в 100-1000 раз превышает предел обнаружения. Malassezia, как правило, образуют агрегаты и не легко приостановить.Таким образом, обеспечить гомогенизацию подвески масляного гриба путем обширного вихря. Дополнительные считывания могут включать в себя, гистологии для определения патологии кожи и изоляции иммунных клеток от кожи и слива лимфатических узлов для исследования противогрибкового иммунного ответа. Эта модель открывает возможности для изучения иммунного ответа против Malassezia и исследовать роль гриба как commensal в контексте различных кожных заболеваний.В некоторых странах виды малассезии классифицируются как организмы BSL-2. Будьте уверены, чтобы следовать правилам ваших местных органов власти и использовать соответствующие меры безопасности.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Infecting Mice with Malassezia spp. to Study the Fungus-Host Interaction

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Измерение бактериальной нагрузки и иммунного ответа в мышей, инфицированных Listeria моноцитогенес</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Простой протокол Chelex для выделения ДНК из<em&gt; Anopheles</em&gt; SPP.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

High and Low Throughput Screens with Root-knot Nematodes Meloidogyne spp.

High and Low Throughput Screens with Root-knot Nematodes Meloidogyne spp.

Высокая и низкая пропускная способность экранов с галловой нематодой Meloidogyne SPP.</em

Root-knot nematodes (genus Meloidogyne) are obligate plant parasites. They are extremely polyphagous and considered one of the most economically important ...

Cecal Ligation and Puncture-induced Sepsis as a Model To Study Autophagy in Mice

Слепой кишки Лигирование и прокол, вызванной Сепсис как модель для изучения аутофагии у мышей

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method, which causes polymicrobial sepsis. Here, a protocol is ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

Трансплантация кожи хвоста изучать Аллогенная лимфоцитов CD4 ответов у мышей

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Development of an in vitro model system for studying the interaction of Equus caballus IgE with its high-affinity receptor Fc&#949;RI

Development of an in vitro model system for studying the interaction of Equus caballus IgE with its high-affinity receptor FcÃƒÅ½Ã‚ÂµRI

Разработка<em&gt; В пробирке</em&gt; Модельной системой для изучения взаимодействия<em&gt; Equus</em&gt;<em&gt; Caballus</em&gt; IgE с рецептором с высоким сродством FcεRI

The interaction of IgE with its high-affinity Fc receptor (Fc&#949;RI) followed by an antigenic challenge is the principal pathway in IgE mediated ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Анализ лимфоцитов экстравазации спользование<em&gt; In Vitro</em&gt; Модель человеческого гематоэнцефалический барьер

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Сверхэкспрессия и очищение человека<em&gt; Cis</em&gt; -пренилтрансфераза в<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Высок объём платформы для проверки Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Induction of Drug-Induced, Autoimmune Hepatitis in BALB/c Mice for the Study of Its Pathogenic Mechanisms

Индукция лекарственно-индуцированного аутоиммунного гепатита у мышей BALB/c для изучения его патогенных механизмов

Drug-induced autoimmune hepatitis (DIH) is the most common hepatic drug-induced hypersensitization process observed in approximately 9 to 12% of patients ...