Name: an intestine/liver microphysiological system for drug pharmacokinetic and toxicological assessment
Uploaded: 2020-12-03T12:30:00
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Wir danken Dr. Christie Guguen-Guillouzo, Dr. Philippe Gripon am Referat 522 INSERM und Dr. Christian Trepo am Referat 271 INSERM für den Einsatz des Biologischen Materials (Hepa RG Zellen) und für die bereitstellung für uns, um die akademische Forschung durchzuführen.

1. Herstellung von Gewebeäquivalenten für den Anbau im 2-OC
<ol><li>Dünndarmbarriere äquivalente Produktion<ol>
<li>Erhalten Sie Caco-2- und HT-29-Zellen mit dem Darmäquivalentmedium: DMEM ergänzt mit 10% FBS, 1% Penicillin und Streptomycin und 1% nicht essentiellen Aminosäuren, die in diesem Manuskript als "DMEM S" bezeichnet werden.</li>
		<li>Entfernen Sie das Medium, waschen Sie zweimal mit 1x DPBS und fügen Sie 8 ml 0,25% Trypsin/EDTA hinzu, um Caco-2-Zellen, die in Zellkulturkolben angebaut werden, zu dis...

<ol>
	<li>Zhang, D., Luo, G., Ding, X., Lu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+experimental+models+of+drug+metabolism+and+disposition+in+drug+discovery+and+development.">Preclinical experimental models of drug metabolism and disposition in drug discovery and development.</a> Acta Pharmaceutica Sinica B. 2 (6), 549-561 (2012).</li><li>Hynds, R. E., Giangreco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relevance+of+human+stem+cell-derived+organoid+models+for+epithelial+translational+medicine.">The relevance of human stem cell-derived organoid models for epithelial translational medicine.</a> Stem Cells. 31 (3), 417-422 (2013).</li><li>Sivaraman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Microscale+In+vitro+Physiological+Model+of+the+Liver:+Predictive+Screens+for+Drug+Metabolism+and+Enzyme+Induction.">A Microscale In vitro Physiological Model of the Liver: Predictive Screens for Drug Metabolism and Enzyme Induction.</a> Current Drug Metabolism. 6 (6), 569-591 (2005).</li><li>Dehne, E. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shp2+negatively+regulates+growth+in+cardiomyocytes+by+controlling+focal+adhesion+kinase/src+and+mTOR+pathways.">Shp2 negatively regulates growth in cardiomyocytes by controlling focal adhesion kinase/src and mTOR pathways.</a> Circulation Research. 103 (8), 813-824 (2008).</li><li>Linkert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metadata+matters:+Access+to+image+data+in+the+real+world.">Metadata matters: Access to image data in the real world.</a> Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OECD+TG+491+-+Short+Time+Exposure+In+vitro+Test+Method+for+Identifying+i)+Chemicals+Inducing+Serious+Eye+Damage+and+ii)+Chemicals+Not+Requiring+Classification+for+Eye+Irritation+or+Serious+Eye+Damage.">OECD TG 491 - Short Time Exposure In vitro Test Method for Identifying i) Chemicals Inducing Serious Eye Damage and ii) Chemicals Not Requiring Classification for Eye Irritation or Serious Eye Damage.</a> OECD. 14, (2018).</li><li>Fernandes, M. B., Gon&#231;alves, J. E., Tavares, L. C., Storpirtis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caco-2+cells+permeability+evaluation+of+nifuroxazide+derivatives+with+potential+activity+against+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+(MRSA).">Caco-2 cells permeability evaluation of nifuroxazide derivatives with potential activity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA).</a> Drug Development and Industrial Pharmacy. 41 (7), 1066-1072 (2015).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OECD+TG+492+-+Reconstructed+human+Cornea-like+Epithelium+(RhCE)+test+method+for+identifying+chemicals+not+requiring+classification+and+labelling+for+eye+irritation+or+serious+eye+damage.">OECD TG 492 - Reconstructed human Cornea-like Epithelium (RhCE) test method for identifying chemicals not requiring classification and labelling for eye irritation or serious eye damage.</a> OECD. 35, (2018).</li><li>OECD, O. E. C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OECD+TG+431+-+In+vitro+skin+corrosion:+reconstructed+human+epidermis+(RHE)+test+method.">OECD TG 431 - In vitro skin corrosion: reconstructed human epidermis (RHE) test method.</a> OECD. 8, (2016).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OECD+TG+439+-+In+vitro+Skin+Irritation:+Reconstructed+Human+Epidermis+Test+Method.">OECD TG 439 - In vitro Skin Irritation: Reconstructed Human Epidermis Test Method.</a> OECD. 21, (2015).</li><li>Marin, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetaminophen+absorption+and+metabolism+in+an+intestine/liver+microphysiological+system.">Acetaminophen absorption and metabolism in an intestine/liver microphysiological system.</a> Chemico-Biological Interactions. 299, 59-76 (2019).</li><li>Maass, C., Stokes, C. L., Griffith, L. G., Cirit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-functional+scaling+methodology+for+translational+pharmacokinetic+and+pharmacodynamic+applications+using+integrated+microphysiological+systems+(MPS).">Multi-functional scaling methodology for translational pharmacokinetic and pharmacodynamic applications using integrated microphysiological systems (MPS).</a> Integrative Biology (United Kingdom). 9 (4), 290-302 (2017).</li><li>Sung, J. H., Wang, Y., Shuler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+using+mathematical+modeling+approaches+to+design+and+interpret+multi-organ+microphysiological+systems+(MPS).">Strategies for using mathematical modeling approaches to design and interpret multi-organ microphysiological systems (MPS).</a> APL Bioengineering. 3 (2), 021501 (2019).</li></ol>

Die genaue und zuverlässige Bewertung der pharmakologischen Eigenschaften von investigativen neuen Arzneimitteln ist entscheidend für die Verringerung des Risikos in den folgenden Entwicklungsschritten. Die MPS ist eine relativ neue Technologie, die darauf abzielt, die Vorhersageleistung zu verbessern und die Kosten und Zeit zu reduzieren, die mit präklinischen Tests verbracht werden. Unsere Gruppe schreitet bei der Bewertung pharmakokinetischer und toxikologischer Eigenschaften voran, die hauptsächlich für die Blei...

Aufgrund genomischer und proteomischer Unterschiede haben Tiermodelle einen begrenzten Vorhersagewert für mehrere menschliche Ergebnisse. Darüber hinaus sind sie zeitaufwändig, teuer und ethisch fragwürdig1. MPS ist eine relativ neue Technologie, die darauf abzielt, die Vorhersageleistung zu verbessern und die Kosten und zeitaufwand für präklinische Tests zu reduzieren. Sie sind mikrofluidische Geräte, die Organoide (künstliche Mimetik-Funktionseinheiten von Organen) unter Medienfluss kultivieren, die organoid-organoide Kommunikation fördert. Organoide aus menschlichen Zellen erhöhen die translationale Relevanz2,3,4. Es wird erwartet, dass MPS besser abschneidet als die Tierversuche, da sie genetisch menschlich sind und das Zusammenspiel zwischen Geweben rekapitulieren. Wenn das MPS voll funktionsfähig ist, liefert es aussagekräftigere Ergebnisse bei höherer Geschwindigkeit und niedrigeren Kosten und Risiken4. Viele Gruppen entwickeln MPS für mehrere Zwecke, vor allem Krankheitsmodelle, um die Wirksamkeit des Medikaments zu testen.
Expositionsniveau ist einer der kritischsten Parameter für die Bewertung der Wirksamkeit und Toxizität von Arzneimitteln5,6,7,8,9,10,11,12. MPS ermöglicht eine organoide Integration, die eine systemische Exposition emuliert und eine bessere Leistung als die traditionelle 2D-Gewebekultur erwartet. Diese Technologie kann die Vorhersage der zusammengesetzten Darmabsorption und Desleberstoffwechsel deutlich verbessern4.
Ein MPS, das menschlicheäquivalente Modell von Darm und Leber integriert, ist ein guter Ausgangspunkt, wenn man die zentrale Rolle dieser beiden Organe bei der Bioverfügbarkeit von Medikamenten und der systemischen Exposition13,14,15betrachtet. APAP ist ein attraktives Medikament für das Studium eines MPS ohne Nierenäquivalent, weil seine Metabolisierung vor allem von der Leber16,17erfolgt.
Das 2-OC ist ein zweikammeriges mikrofluidisches Gerät, das für die Kultur von zwei verschiedenen menschlichen Äquivalentgeweben/Organoiden geeignet ist, die durch Mikrokanäle16miteinander verbunden sind. Um eine orale/intravenöse Verabreichung eines Arzneimittels beim Menschen in vitro zu emulieren und die Auswirkungen des Kreuzgesprächs zwischen Darm- und Leberäquivalenten auf die APAP-Pharmakokinetik zu bewerten, wurden neben der Funktionalität und Lebensfähigkeit der Organoide drei verschiedene MPS-Baugruppen durchgeführt: (1) ein "Darm 2-OC MPS", das aus einem Darmäquivalent besteht, das in einem Kultureinsatz basiert, der eine Kokultur von Caco-2 + HT-29-Zellen enthält; (2) ein "Liver 2-OC MPS" bestehend aus Lebersphäroiden aus HepaRG + HHSteC (Human Hepatic Stellate Cells), die in das 2-OC-Gerät integriert sind; und (3) ein "Darm/Leber 2-OC MPS" bestehend aus dem Darmäquivalent in einem Gerätefach, das durch den Medienfluss durch die mikrofluidischen Kanäle mit dem Leberäquivalent im anderen kommuniziert.
Alle Assays wurden unter statischen (keinen Durchfluss) und dynamischen (mit Strömung) Bedingungen aufgrund der Auswirkungen der mechanischen Reize (Kompression, Dehnung und Scherung) auf die Zelllebensfähigkeit und Funktionalitäten18,19,20durchgeführt. Der vorliegende Artikel beschreibt das Protokoll für die APAP-Oral-/Intravenous-Verabreichungsemulation und die jeweiligen Absorptions-/Stoffwechsel- und toxikologischen Analysen in der 2-OC-MPS, die menschliche Darm- und Leberäquivalentmodelle enthält.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x DPBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190235</td>
			<td>No calcium, no magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-OC</td>
			<td>TissUse GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Two-organ chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well Spheroid Microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3830</td>
			<td>Black/Clear, Round Bottom, Ultra-Low Attachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Use to fix cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetaminophen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7085</td>
			<td>Use to MPS assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Tedia</td>
			<td></td>
			<td>Used to perform HPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>confocal experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Used to perform HPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caco-2 cells</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>86010202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cacodylate buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12800017</td>
			<td>Add supplements: 10% fetal bovine serum, 100 units per mL penicillin, 100 &#181;g/mL streptomycin, and 1% non-essential amino acids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4540</td>
			<td>Add 2% to HepaRG media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Synth</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12657029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing medium OCT</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td></td>
			<td>Tissue-Tek&#174; O.C.T.&#8482; Compound is a formulation of watersoluble glycols and resins, providing a convenient specimen matrix for cryostat sectioning at temperatures of -10&#176;C and below.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin &#38; Eosin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepaRG cells</td>
			<td>Biopredic International</td>
			<td>HPR101</td>
			<td>Undifferentiated cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HHSTeC</td>
			<td>ScienCell Research Laboratories</td>
			<td>5300</td>
			<td>Cells and all culture supplements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>HCA experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT-29 cells</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>85061109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Insulin</td>
			<td>Invitrogen - Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12585014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H0888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>278475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Karnovsky&#8217;s fixative</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2916801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna C18 guard column SS</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td></td>
			<td>Used to perform HPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell 0.4 &#181;m pore size inserts</td>
			<td>Merck</td>
			<td>PIHP01250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell ERS-2 meter</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MERS00002</td>
			<td>Used to TEER measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker Deep Red</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>HCA experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>M6494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MX3000P system</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Counting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operetta High Content Imaging System</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td>Used to perform HCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P450-Glo CYP3A4 Assay with Luciferin-IPA</td>
			<td>Promega</td>
			<td>Cat.# V9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15070063</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF Syringe filter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.22 &#956;m pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reversed-phase Luna C18 column</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td></td>
			<td>Used to perform HPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker (IKA VXR Basic Vibrax)</td>
			<td>IKA Works GmbH &#38; Co</td>
			<td>2819000</td>
			<td>Used for spheroids to improve MTT assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stellate Cell Media (STeC CM)</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>5301</td>
			<td>Add STeC CM supplements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScriptIITM Reverse Transcriptase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green PCR Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRizol TM reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Trizol is a monophasic solution of phenol and guanidine isothiocyanate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R001100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low-attachment plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3471-24EA</td>
			<td>6 wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield plus DAPI mounting media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Opaque 96-well Microplate</td>
			<td>PerkinHelmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide-bore tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Williams E</td>
			<td>Pan Biotech</td>
			<td>P04-29510</td>
			<td>Add supplements: 10% fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine, 100 units per ml penicillin, 100 &#181;g/mL streptomycin and 5 &#181;g/mL human insulin</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an intestine/liver microphysiological system for drug pharmacokinetic and toxicological assessment

Die kürzlich eingeführten mikrophysiologischen Systeme (MPS), die humane Organoide kultivieren, sollen in der präklinischen Testphase des Arzneimittelentwicklungsprozesses besser abschneiden als Tiere, da sie genetisch menschlich sind und das Zusammenspiel zwischen Geweben rekapitulieren. In dieser Studie wurden die menschliche Darmbarriere (emuliert durch eine Kokultur von Caco-2- und HT-29-Zellen) und das Leberäquivalent (emuliert durch Sphäroide aus differenzierten HepaRG-Zellen und humanen Hepatic Stellate-Zellen) in einen Zwei-Organ-Chip (2-OC) mikrofluidischen Gerät integriert, um einige Acetaminophen (APAP) pharmakokinetische (PK) und toxische Eigenschaften zu bewerten. Die MPS hatte drei Baugruppen: Darm nur 2-OC, Leber nur 2-OC, und Darm/Leber 2-OC mit dem gleichen Medium durchdringen beide Organoide. Für PK-Bewertungen dosierten wir das APAP in den Medien zu voreingestellten Zeitpunkten, nachdem wir es entweder über die Darmbarriere (Emulierung des oralen Weges) oder in den Medien (Emulierung des intravenösen Weges) verabreicht hatten, auf 12 m bzw. 2 m. Die Medienproben wurden mittels umgekehrter Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) analysiert. Organoide wurden auf Genexpression, für TEER-Werte, auf Proteinexpression und -aktivität analysiert und dann gesammelt, fixiert und einer Reihe morphologischer Auswertungen unterzogen. Die MTT-Technik schnitt bei der Beurteilung der Organoid-Lebensfähigkeit gut ab, aber die Hochgehaltsanalysen (HCA) konnten sehr frühe toxische Ereignisse als Reaktion auf die APAP-Behandlung erkennen. Wir haben überprüft, dass der Medienfluss die APAP-Absorption nicht signifikant beeinflusst, während er die Leberäquivalentfunktionalität erheblich verbessert. Die aPAP menschliche Darmabsorption und Leberstoffwechsel könnte im MPS emuliert werden. Die Verbindung zwischen MPS-Daten und der Silico-Modellierung hat ein großes Potenzial, die Vorhersehbarkeit der In-vitro-Methoden zu verbessern und eine bessere Genauigkeit als Tiermodelle in pharmakokinetischen und toxikologischen Studien zu bieten.

Um die PK APAP-Tests im 2-OC MPS durchzuführen, besteht der erste Schritt darin, den menschlichen Darm und Leberäquivalente (Organoide) herzustellen. Sie sind in das 2-OC mikrofluidische Gerät(Abbildung 1A) 24 h vor Beginn des PK APAP-Assays integriert. Am nächsten Tag wird das Medium geändert, und das Modell wird APAP ausgesetzt. Abbildung 1 zeigt die Darm- und Leberäquivalente, die sich innerhalb des 2-OC-Geräts (Abbildung 1B</stron...

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An Intestine/Liver Microphysiological System for Drug Pharmacokinetic and Toxicological Assessment

Wir haben ein mikrophysiologisches System (MPS) mit Darm- und Leberorganoiden Acetaminophen (APAP) ausgesetzt. Dieser Artikel beschreibt die Methoden für die Organoidproduktion und APAP pharmakokinetische und toxikologische Eigenschaftenbewertungen im MPS. Es beschreibt auch die Gewebefunktionsanalysen, die notwendig sind, um die Ergebnisse zu validieren.

Ein Mikrophysiologisches System für die pharmakokinetische und toxikologische Beurteilung von Arzneimitteln/Leber

The recently introduced microphysiological systems (MPS) cultivating human organoids are expected to perform better than animals in the preclinical tests ...

Mikrophysiologische Systeme haben die Fähigkeit, pharmakokinetische und die toxikologische Reaktion des menschlichen Körpers auf spezifische Behandlungen von Interessen zu emulieren. Mikrophysiologische Systeme haben das Potenzial, Tierversuche zu ersetzen, da ihre Verwendung die Vorhersagekraft von In-vitro-Methoden verbessern und die Kosten und die Zeit pharmakokinetischer und toxikologischer Studien reduzieren kann. 24 Stunden vor der Verabreichung der Prüfsubstanz ein 800-Mikroliter-Aliquot von William ES-Medium zwischen den größeren und kleineren Fächern der beiden Organchips aufteilen und das basolaterale und apikale Medium aus jedem Darmbarriereäquivalent in den vorbereiteten 24 Bohrplatten ansaugen.Mit sterilen Zangen einen Einsatz pro zwei Organchip-Schaltung in das größere Fach integrieren und 200 Mikroliter DMEMS auf die apikale Seite geben. Mit breiten Bohrungsspitzen 20 Leberäquivalente pro Schaltung in das kleinere Fach der beiden Organchips integrieren und das System an das Steuergerät anschließen. Schließen Sie dann das Steuergerät an eine Druckluftzufuhr an und stellen Sie den Druck auf etwa plus oder minus 300 bar und eine Pumpfrequenz von 0,3 Hertz ein.Am nächsten Tag die Acetaminophen-Lösung des Lagers auf eine Konzentration von 12 Mikromolaren verdünnen. Um das Medium im System zu ersetzen, saugen Sie die basolateralen und apikalen Medien aus dem Darmbarriereäquivalent in den beiden Organchips und fügen Sie 500 Mikroliter frisches geeignetes Kulturmedium in das große Fach an der organoiden basolateralen Seite und 300 Mikroliter in das kleine Fach ein. Nach der Prüfung auf Blasen, emulieren orale Verabreichung mit der Zugabe von 200 Mikroliter einer 12 Mikromolar Acetaminophen Lösung auf der apikalen Seite der Darmkultur Einsätze und verbinden Sie das mikrophysiologische System an die Steuereinheit.Sammeln Sie das Gesamtvolumen sowohl von den Darm-apischen und basolateralen Seiten, als auch aus dem kleinen Fach in dreifacher Auslage zu den angegebenen Zeitpunkten. Wenn alle Proben gesammelt wurden, stellen Sie alle relevanten Parameter für die HPLC-Analyse ein, wie in der Tabelle angegeben, und filtern Sie die mobile Phase durch einen 0,4-Mikron-Membranfilter unter Vakuum. Filtern Sie die Proben dann durch einen PVDF-Spritzenfilter in Porengröße von 0,22 Mikron und lagern Sie die Proben in einer Durchstechflasche, bevor Sie mit der HPLC-UV-Messung beginnen.Um die Organoid-Lebensfähigkeit zu beurteilen, übertragen Sie alle 20 Sphäroide von jedem Replizieren auf einzelne Brunnen einer 96-Well-Platte und übertragen Sie die Zellkultureinsätze auf einzelne Brunnen einer 24-Well-Platte. Waschen Sie die Gewebeäquivalente dreimal mit frischen DPBS pro Wäsche und fügen Sie 300 Mikroliter einer ein Milligramm pro Milliliter MTT-Lösung zu jedem experimentellen Brunnen hinzu. Nach einer dreistündigen Inkubation im Zellkultur-Inkubator ersetzen Sie die MTT-Lösung durch 200 Mikroliter Isopropanol pro Brunnen für eine nächtliche Inkubation bei vier Grad Celsius, um das MTT-Formazan aus dem Darm und den Leberäquivalenten zu extrahieren.Am nächsten Morgen 200 Mikroliter jedes Überstandes in die 96-Well-Platte übertragen und das Formazan auf einem Plattenleser bei 570 Nanometern ablesen, um die Berechnung der relativen Fähigkeit der Zellen zu ermöglichen, MTT unter Verwendung der durchschnittlichen optischen Dichte jedes Zeitpunkts im Vergleich zur negativen Kontrolle zu reduzieren. Für die zytochemische und histologische Analyse der Proben, fixieren Sie zunächst den Darm und Leberäquivalente in 4%Paraformaldehyd in 0,1 moligen PBS für 25 Minuten bei Raumtemperatur. Am Ende der Inkubation die Organoide fünfmal in PBS für 10 Minuten pro Wäsche waschen, bevor Sie die Darm- und Leberäquivalente mit Tetramethylrhodamine Isothiocyanat Phalloidin Alexa Fluor 647 phalloidin für eine Stunde bei Raumtemperatur färben.Am Ende der Inkubation die Proben für einige Minuten auf das Gefriermedium übertragen, bevor sie das Gewebe in flüssigem Stickstoff einfrieren. Als nächstes verwenden Sie ein Kryostat, um 10 bis 12 Mikrometer dicke Lebersphäroid-Kryo-Abschnitte zu erwerben und die Gewebeabschnitte in Montagemedium mit DAPI für die Bildgebung durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie zu montieren. Für die mitochondriale und nukleare Färbung die Proben vollständig mit mitochondrialer Färbungslösung für eine 15- bis 45-minütige Inkubation bei 37 Grad Celsius in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% Kohlendioxid abdecken.Am Ende der Inkubation die Färbelösung bei Raumtemperatur 15 Minuten lang sorgfältig durch 2 bis 4% Paraformaldehyd in PBS ersetzen. Nach der Fixierung die Zellen zwei Mal mit frischem PBS für fünf Minuten pro Wäsche abspülen, bevor Sie die Proben mit Nukleinsäure-Färbungsarbeitslösung 10 Minuten bei Raumtemperatur beschriften. Waschen Sie am Ende der Inkubation die Proben mit drei, fünf minütigen, lichtgeschützten Wähmern in PBS und verwenden Sie den Nukleinsäurefleck, um die Quantifizierung der Anzahl der mitochondrialen Fleckenexzierungszellen auf einem Fluoreszenzmikroskop mit den entsprechenden Filtersätzen zu erleichtern.Die Integration der menschlichen Darmbarriere und eines Leberäquivalents in ein mikrofluidisches Gerät mit zwei Organchips ermöglicht die Beurteilung der pharmakokinetischen und toxikologischen Eigenschaften von Behandlungen von Interesse. Nach der Behandlung können die Medienproben per HPLC analysiert werden. Die Organoide können auf ihre Genexpression, transepitheliale elektrische Widerstandswerte, Proteinexpression und -aktivität sowie auf ihre morphologischen Eigenschaften analysiert werden.MTT-Analyse kann durchgeführt werden, um die Organoid-Lebensfähigkeit zu bewerten, sowie sehr frühe toxische Ereignisse als Reaktion auf Acetaminophen-Behandlung zu erkennen. Der Medienfluss hat keinen signifikanten Einfluss auf die Acetaminophen-Absorption, während er die Funktion des Leberäquivalents signifikant verbessert, was darauf hindeutet, dass die Aufnahme von humanem Darmacetaminophen und Leberstoffwechsel in diesem mikrophysiologischen System emuliert werden kann. Mikrophysiologische Systeme haben das Potenzial, Tiermodelle in der Arzneimittelentwicklung und -entdeckung zu ersetzen, da sie die menschliche Physiologie besser nachahmen und verwendet werden können, um die Arzneimittelentwicklung mit höherer Geschwindigkeit und niedrigeren Kosten für Risiko und Komplexität zu fördern.

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Preparation and Characterization of SDF-1&#945;-Chitosan-Dextran Sulfate Nanoparticles

Preparation and Characterization of SDF-1ÃƒÅ½Ã‚Â±-Chitosan-Dextran Sulfate Nanoparticles

Herstellung und Charakterisierung von SDF-1α-Chitosan-Nanopartikel Dextransulfat

Chitosan (CS) and dextran sulfate (DS) are charged polysaccharides (glycans), which form polyelectrolyte complex-based nanoparticles when mixed under ...

Forschung

Chemie

Preparation and Characterization of Individual and Multi-drug Loaded Physically Entrapped Polymeric Micelles

Herstellung und Charakterisierung von Einzel-und Multi-Wirkstoff beladen Körperlich Eingeschlossene Polymermicellen

Amphiphilic block copolymers like polyethyleneglycol-block-polylactic acid (PEG-b-PLA) can self-assemble into micelles above their critical micellar ...

Protocol for the Synthesis of Ortho-trifluoromethoxylated Aniline Derivatives

Protocol for the Synthesis of Ortho-trifluoromethoxylated Aniline Derivatives

Protokoll für die Synthese von<em&gt; Ortho</em&gt; -trifluoromethoxylated Anilin-Derivate

Molecules bearing trifluoromethoxy (OCF3) group often show desired pharmacological and biological properties. However, facile synthesis of ...

PTR-ToF-MS Coupled with an Automated Sampling System and Tailored Data Analysis for Food Studies: Bioprocess Monitoring, Screening and Nose-space Analysis

PTR-ToF-MS gekoppelt mit einem automatisierten Probenahmesystem und einer maßgeschneiderten Datenanalyse für Lebensmittelstudien: Bioprozessüberwachung, Screening und Nasenraumanalyse

Proton Transfer Reaction (PTR), combined with a Time-of-Flight (ToF) Mass Spectrometer (MS) is an analytical approach based on chemical ionization that ...

An Aptamer-based Sensor for Unchelated Gadolinium(III)

An Aptamer-based Sensor for Unchelated GadoliniumIII

Ein Aptamer-basierten Sensor für unchelatisierte Gadolinium (III)

A method for determining the presence of unchelated trivalent gadolinium ion (Gd3+) in aqueous solution is demonstrated. Gd3+ is often present in samples ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

Echtzeit-Atem-Analyse mithilfe von sekundären Nanoelectrospray Ionisation mit hochauflösenden Massenspektrometrie gekoppelt

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

An Engineered Split-TET2 Enzyme for Chemical-inducible DNA Hydroxymethylation and Epigenetic Remodeling

Ein veränderter Split-TET2 Enzym für chemische-induzierbaren DNA Hydroxymethylation und epigenetische Umbau

DNA methylation is a stable and heritable epigenetic modification in the mammalian genome and is involved in regulating gene expression to control ...

Generation of Electronic Cigarette Aerosol by a Third-Generation Machine-Vaping Device: Application to Toxicological Studies

Generation der elektronischen Zigarette Aerosol durch einen dritten Generation Maschine dampfen: Anwendung auf toxikologische Studien

Electronic-cigarette (e-cig) devices use heat to produce an inhalable aerosol from a liquid (e-liquid) composed mainly of humectants, nicotine, and ...

High-throughput and Comprehensive Drug Surveillance Using Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

High-Throughput und umfassende Droge-Überwachung mittels Massenspektrometrie Multisegment-Injektion-Kapillar-Elektrophorese

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug ...

An Electrochemical Cholesteric Liquid Crystalline Device for Quick and Low-Voltage Color Modulation

Eine elektrochemische cholesterischen flüssig kristallinen Gerät für schnelle und Niedervolt-Farbe Modulation

We demonstrate a method for fabricating a prototype reflective display device that contains cholesteric liquid crystal (LC) as an active component. The ...