Name: an intestine/liver microphysiological system for drug pharmacokinetic and toxicological assessment
Uploaded: 2020-12-03T12:30:00
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Grazie alla Dott.ssa Christie Guguen-Guillouzo, al Dott. Philippe Gripon dell'Unità 522 INSERM e al Dott. Christian Trepo dell'Unità 271 INSERM per l'utilizzo del Materiale Biologico (Cellule Hepa RG) e per averci messo a disposizione per svolgere la ricerca accademica.

1. Produzione di equivalenti tissutali per la coltivazione nel 2-OC
<ol><li>Produzione equivalente barriera intestino tenue<ol>
<li>Mantenere le cellule Caco-2 e HT-29 usando il mezzo equivalente intestino: DMEM integrato con 10% FBS, 1% penicillina e streptomicina, e 1% amminoacidi non essenziali, che è chiamato come "DMEM S" in questo manoscritto.</li>
		<li>Rimuovere il mezzo, lavare due volte con 1x DPBS e aggiungere 8 mL dello 0,25% di tripina/EDTA per dissociare le cellule Caco-2 coltivate in contenitori di colt...

<ol>
	<li>Zhang, D., Luo, G., Ding, X., Lu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+experimental+models+of+drug+metabolism+and+disposition+in+drug+discovery+and+development.">Preclinical experimental models of drug metabolism and disposition in drug discovery and development.</a> Acta Pharmaceutica Sinica B. 2 (6), 549-561 (2012).</li><li>Hynds, R. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shp2+negatively+regulates+growth+in+cardiomyocytes+by+controlling+focal+adhesion+kinase/src+and+mTOR+pathways.">Shp2 negatively regulates growth in cardiomyocytes by controlling focal adhesion kinase/src and mTOR pathways.</a> Circulation Research. 103 (8), 813-824 (2008).</li><li>Linkert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metadata+matters:+Access+to+image+data+in+the+real+world.">Metadata matters: Access to image data in the real world.</a> Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OECD+TG+491+-+Short+Time+Exposure+In+vitro+Test+Method+for+Identifying+i)+Chemicals+Inducing+Serious+Eye+Damage+and+ii)+Chemicals+Not+Requiring+Classification+for+Eye+Irritation+or+Serious+Eye+Damage.">OECD TG 491 - Short Time Exposure In vitro Test Method for Identifying i) Chemicals Inducing Serious Eye Damage and ii) Chemicals Not Requiring Classification for Eye Irritation or Serious Eye Damage.</a> OECD. 14, (2018).</li><li>Fernandes, M. B., Gon&#231;alves, J. E., Tavares, L. C., Storpirtis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caco-2+cells+permeability+evaluation+of+nifuroxazide+derivatives+with+potential+activity+against+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+(MRSA).">Caco-2 cells permeability evaluation of nifuroxazide derivatives with potential activity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA).</a> Drug Development and Industrial Pharmacy. 41 (7), 1066-1072 (2015).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OECD+TG+492+-+Reconstructed+human+Cornea-like+Epithelium+(RhCE)+test+method+for+identifying+chemicals+not+requiring+classification+and+labelling+for+eye+irritation+or+serious+eye+damage.">OECD TG 492 - Reconstructed human Cornea-like Epithelium (RhCE) test method for identifying chemicals not requiring classification and labelling for eye irritation or serious eye damage.</a> OECD. 35, (2018).</li><li>OECD, O. E. C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OECD+TG+431+-+In+vitro+skin+corrosion:+reconstructed+human+epidermis+(RHE)+test+method.">OECD TG 431 - In vitro skin corrosion: reconstructed human epidermis (RHE) test method.</a> OECD. 8, (2016).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OECD+TG+439+-+In+vitro+Skin+Irritation:+Reconstructed+Human+Epidermis+Test+Method.">OECD TG 439 - In vitro Skin Irritation: Reconstructed Human Epidermis Test Method.</a> OECD. 21, (2015).</li><li>Marin, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetaminophen+absorption+and+metabolism+in+an+intestine/liver+microphysiological+system.">Acetaminophen absorption and metabolism in an intestine/liver microphysiological system.</a> Chemico-Biological Interactions. 299, 59-76 (2019).</li><li>Maass, C., Stokes, C. L., Griffith, L. G., Cirit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-functional+scaling+methodology+for+translational+pharmacokinetic+and+pharmacodynamic+applications+using+integrated+microphysiological+systems+(MPS).">Multi-functional scaling methodology for translational pharmacokinetic and pharmacodynamic applications using integrated microphysiological systems (MPS).</a> Integrative Biology (United Kingdom). 9 (4), 290-302 (2017).</li><li>Sung, J. H., Wang, Y., Shuler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+using+mathematical+modeling+approaches+to+design+and+interpret+multi-organ+microphysiological+systems+(MPS).">Strategies for using mathematical modeling approaches to design and interpret multi-organ microphysiological systems (MPS).</a> APL Bioengineering. 3 (2), 021501 (2019).</li></ol>

La valutazione accurata e affidabile delle proprietà farmacologiche dei nuovi farmaci investigativi è fondamentale per ridurre il rischio nelle seguenti fasi di sviluppo. L'MPS è una tecnologia relativamente nuova, che mira a migliorare la potenza predittiva e ridurre i costi e il tempo trascorso con i test preclinici. Il nostro gruppo sta avanzando nella valutazione delle proprietà farmacocinetiche e tossicologiche per lo più necessarie per l'ottimizzazione del piombo. Abbiamo lavorato con il dispositivo microfluid...

A causa delle differenze genomiche e proteomiche, i modelli animali hanno un valore predittivo limitato per diversi risultati umani. Inoltre, sono dispendiosi in termini di tempo, costosi ed eticamente discutibili1. Mps è una tecnologia relativamente nuova che mira a migliorare la potenza predittiva e ridurre i costi e il tempo trascorso con i test precli clinici. Sono dispositivi microfluidi che coltivano organoidi (unità funzionali mimetiche artificiali di organi) sotto flusso mediatico che promuovono la comunicazione organoide-organoide. Gli organoidi composti da cellule umane aumentano la rilevanzatraslizionale 2,3,4. Ci si aspetta che le MPS funzionino meglio dei test sugli animali perché sono geneticamente umane e ricapitolano l'interazione tra i tessuti. Quando è pienamente funzionante, l'MPS fornirà risultati più significativi, a velocità più elevata e costi e rischiinferiori 4. Molti gruppi stanno sviluppando MPS per diversi scopi, in particolare modelli di malattia per testare l'efficacia del farmaco.
Il livello di esposizione è uno dei parametri più critici per valutare l'efficacia e la tossicità delfarmaco 5,6,7,8,9,10,11,12. La MPS consente un'integrazione organoide che emula l'esposizione sistemica e si prevede che funzioni meglio della tradizionale coltura di tessuti umani 2D. Questa tecnologia può migliorare significativamente la previsione dell'assorbimento intestinale composto e del metabolismoepatico 4.
Una MPS che integra un modello equivalente umano di intestino e fegato è un buon punto di partenza, considerando il ruolo centrale di questi due organi nella biodisponibilità del farmaco e nell'esposizionesistemica 13,14,15. APAP è un farmaco attraente per studiare una MPS senza un equivalente renale perché la sua metabolizzazione è fatta principalmente dal fegato16,17.
Il 2-OC è un dispositivo microfluidico a due camere adatto alla coltura di due diversi tessuti/organoidi equivalenti umani interconnessi da microcanali16. Al fine di emulare una somministrazione orale/endovenosa umana in vitro di un farmaco e valutare gli effetti del colloquio incrociato tra l'intestino e gli equivalenti epatici sulla farmacocinetica APAP, oltre alla funzionalità e alla vitalità degli organoidi, sono stati eseguiti tre diversi gruppi di MPS: (1) una "MPS intestino 2-OC" composta da un equivalente intestinale basato in un inserto di coltura contenente una cocoltura di cellule Caco-2 + HT-29, integrata nel dispositivo 2-OC; (2) una "MPS epatica a 2 OC" composta da sferoidi epatici costituiti da HepaRG + HHSteC (Cellule Stellate Epatiche Umane) integrati nel dispositivo 2-OC; e (3) una "MPS intestino/fegato 2-OC" composta dall'equivalente intestinale in un compartimento del dispositivo che comunica con l'equivalente epatico nell'altro dal flusso del fluido attraverso i canali microfluidici.
Tutti i saggi sono stati eseguiti in condizioni statiche (senza flusso) e dinamiche (con flusso) a causa dell'impatto degli stimoli meccanici (compressione, stiramento e taglio) sulla vitalità cellulare e sullefunzionalità 18,19,20. Il presente articolo descrive il protocollo per l'emulazione della somministrazione orale/endovenosa APAP e le rispettive analisi di assorbimento/metabolismo e tossicologiche nelle MPS a 2-OC contenenti modelli equivalenti all'intestino umano e al fegato.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x DPBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190235</td>
			<td>No calcium, no magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-OC</td>
			<td>TissUse GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Two-organ chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well Spheroid Microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3830</td>
			<td>Black/Clear, Round Bottom, Ultra-Low Attachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Use to fix cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetaminophen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7085</td>
			<td>Use to MPS assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Tedia</td>
			<td></td>
			<td>Used to perform HPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>confocal experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Used to perform HPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caco-2 cells</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>86010202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cacodylate buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12800017</td>
			<td>Add supplements: 10% fetal bovine serum, 100 units per mL penicillin, 100 &#181;g/mL streptomycin, and 1% non-essential amino acids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4540</td>
			<td>Add 2% to HepaRG media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Synth</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12657029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing medium OCT</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td></td>
			<td>Tissue-Tek&#174; O.C.T.&#8482; Compound is a formulation of watersoluble glycols and resins, providing a convenient specimen matrix for cryostat sectioning at temperatures of -10&#176;C and below.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin &#38; Eosin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepaRG cells</td>
			<td>Biopredic International</td>
			<td>HPR101</td>
			<td>Undifferentiated cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HHSTeC</td>
			<td>ScienCell Research Laboratories</td>
			<td>5300</td>
			<td>Cells and all culture supplements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>HCA experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT-29 cells</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>85061109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Insulin</td>
			<td>Invitrogen - Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12585014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H0888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>278475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Karnovsky&#8217;s fixative</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2916801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna C18 guard column SS</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td></td>
			<td>Used to perform HPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell 0.4 &#181;m pore size inserts</td>
			<td>Merck</td>
			<td>PIHP01250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell ERS-2 meter</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MERS00002</td>
			<td>Used to TEER measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker Deep Red</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>HCA experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>M6494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MX3000P system</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Counting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operetta High Content Imaging System</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td>Used to perform HCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P450-Glo CYP3A4 Assay with Luciferin-IPA</td>
			<td>Promega</td>
			<td>Cat.# V9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15070063</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF Syringe filter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.22 &#956;m pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reversed-phase Luna C18 column</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td></td>
			<td>Used to perform HPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker (IKA VXR Basic Vibrax)</td>
			<td>IKA Works GmbH &#38; Co</td>
			<td>2819000</td>
			<td>Used for spheroids to improve MTT assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stellate Cell Media (STeC CM)</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>5301</td>
			<td>Add STeC CM supplements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScriptIITM Reverse Transcriptase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green PCR Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRizol TM reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Trizol is a monophasic solution of phenol and guanidine isothiocyanate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R001100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low-attachment plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3471-24EA</td>
			<td>6 wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield plus DAPI mounting media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Opaque 96-well Microplate</td>
			<td>PerkinHelmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide-bore tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Williams E</td>
			<td>Pan Biotech</td>
			<td>P04-29510</td>
			<td>Add supplements: 10% fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine, 100 units per ml penicillin, 100 &#181;g/mL streptomycin and 5 &#181;g/mL human insulin</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an intestine/liver microphysiological system for drug pharmacokinetic and toxicological assessment

I sistemi microfisiologici (MPS) recentemente introdotti che coltivano organoidi umani dovrebbero funzionare meglio degli animali nella fase di test preclinici del processo di sviluppo dei farmaci perché sono geneticamente umani e ricapitolano l'interazione tra i tessuti. In questo studio, la barriera intestinale umana (emulata da una co-coltura di cellule Caco-2 e HT-29) e l'equivalente epatico (emulato da sferoidi fatti di cellule EpaRG differenziate e cellule stellate epatiche umane) sono stati integrati in un dispositivo microfluidico a chip a due organi (2-OC) per valutare alcune proprietà farmacocinetiche (APAP) ad acetaminofene (APAP) e tossicologiche. La MPS aveva tre gruppi: intestino solo 2-OC, fegato solo 2-OC, e intestino / fegato 2-OC con lo stesso supporto che permea entrambi gli organoidi. Per le valutazioni della chiave di piattaforma, abbiamo dosato l'APAP nel supporto a punti di tempo preimpostati dopo averli somministrati sopra la barriera intestinale (emulando la via orale) o nel supporto (emulando la via endovenosa), rispettivamente a 12 μM e 2 μM. I campioni di supporto sono stati analizzati mediante cromatografia liquida ad alta pressione in fase invertita (HPLC). Gli organoidi sono stati analizzati per l'espressione genica, per i valori TEER, per l'espressione e l'attività proteica, e quindi raccolti, fissati e sottoposti a una serie di valutazioni morfologiche. La tecnica MTT ha funzionato bene nel valutare la fattibilità organoide, ma le analisi ad alto contenuto (HCA) sono state in grado di rilevare eventi tossici molto presto in risposta al trattamento APAP. Abbiamo verificato che il flusso del supporto non influisce in modo significativo sull'assorbimento apap, mentre migliora significativamente la funzionalità equivalente al fegato. L'assorbimento intestinale umano APAP e il metabolismo epatico potrebbero essere emulati nelle MPS. L'associazione tra i dati delle MPS e la modellazione in silico ha un grande potenziale per migliorare la prevedibilità dei metodi in vitro e fornire una migliore accuratezza rispetto ai modelli animali negli studi farmacocinetici e tossicologici.

Per eseguire i test PK APAP nelle MPS a 2-OC, il primo passo è produrre l'intestino umano e gli equivalenti epatici (organoidi). Sono integrati nel dispositivo microfluidico 2-OC (Figura 1A) 24 ore prima dell'inizio del test APAP PK. Il giorno successivo, il supporto viene modificato e il modello viene esposto all'APAP. La figura 1 illustra gli equivalenti intestinali e epatici collocati all'interno del dispositivo 2-OC (Figura 1B)...

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An Intestine/Liver Microphysiological System for Drug Pharmacokinetic and Toxicological Assessment

Abbiamo esposto un sistema microfisiologico (MPS) con organoidi intestinali e epatici ad acetaminofene (APAP). Questo articolo descrive i metodi per la produzione di organoidi e le valutazioni della proprietà farmacocinetica e tossicologica APAP nelle MPS. Descrive anche le analisi della funzionalità tissutale necessarie per convalidare i risultati.

Un sistema microfisiologico intestino/fegato per la valutazione farmacocinetica e tossicologica

The recently introduced microphysiological systems (MPS) cultivating human organoids are expected to perform better than animals in the preclinical tests ...

I sistemi microfisiologici hanno la capacità di emulare la farmacocinetica e la risposta tossicologica del corpo umano a trattamenti specifici di interessi. I sistemi microfisiologici hanno il potenziale per sostituire i test sugli animali in quanto il loro uso può migliorare il potere predittivo dei metodi in vitro e ridurre il costo e il tempo degli studi farmacocinetici e tossicologici. 24 ore prima della somministrazione della sostanza in esame, dividere un'aliquota di 800 microliter del mezzo William ES tra i compartimenti più grandi e più piccoli del chip a due organi e aspirare il mezzo basolaterale e apicali da ogni equivalente barriera intestinale nelle 24 piastre del pozzo preparate.Utilizzando forcep sterili, integrare un inserto per due circuiti di chip per organo nel vano più grande e aggiungere 200 microlitri di DMEMS al lato apicali. Utilizzando ampie punte di foro, integrare 20 equivalenti epatici per circuito nel compartimento più piccolo del chip dei due organi e collegare il sistema all'unità di controllo. Quindi collegare l'unità di controllo a un alimentatore d'aria pressurizzato e impostare la pressione su circa più o meno 300 barre e una frequenza di pompaggio di 0,3 Hertz.Il giorno successivo diluire la soluzione di acetaminofene stock a una concentrazione di 12 micromolari. Per sostituire il mezzo nel sistema, aspirare il mezzo basolaterale e apicali dall'equivalente barriera intestinale nel chip a due organi e aggiungere 500 microlitri di nuovo mezzo di coltura appropriato nel grande compartimento sul lato basolaterale organoide e 300 microlitri al piccolo compartimento. Dopo aver verificato la presenza di bolle, emulare la somministrazione orale con l'aggiunta di 200 microlitri di una soluzione di acetaminofene micromolare sul lato apicico degli inserti della coltura intestinale e collegare il sistema microfisiologico alla centralina.Raccogliere il volume totale sia dal lato intestinale apicali che basolaterali, nonché dal piccolo compartimento in triplice copia nei punti temporali indicati. Una volta raccolti tutti i campioni, impostare tutti i parametri rilevanti per l'analisi HPLC come indicato nella tabella e filtrare la fase mobile attraverso un filtro a membrana da 0,4 micron sotto vuoto. Quindi filtrare i campioni attraverso un filtro siringa PVDF di dimensioni dei pori da 0,22 micron e conservare i campioni in una fiala prima di iniziare la misurazione UV HPLC.Per valutare la vitalità organoide, trasferire tutti i 20 sferoidi da ciascuno replicare a singoli pozzi di una piastra da 96 pozza e trasferire gli inserti di coltura cellulare in singoli pozzi di una piastra di 24 pozza. Lavare gli equivalenti tissutali tre volte con DPBS fresco per lavaggio e aggiungere 300 microlitri di una soluzione MTT milligrammo per millilitro ad ogni pozzo sperimentale. Dopo un'incubazione di tre ore nell'incubatore di coltura cellulare, sostituire la soluzione MTT con 200 microlitri di isopropanolo per pozzo per un'incubazione notturna a quattro gradi Celsius per estrarre l'MTT formazan dall'intestino e dagli equivalenti epatici.La mattina seguente, trasferire 200 microlitri di ogni supernatante al pozzo appropriato nella piastra del pozzo 96 e leggere il formazan su un lettore di lastre a 570 nanometri per consentire il calcolo della capacità relativa delle cellule di ridurre l'MTT utilizzando la densità ottica media di ogni punto di tempo rispetto al controllo negativo. Per l'analisi citochimica e istologica dei campioni, fissare prima l'intestino e gli equivalenti epatici in paraformaldeide al 4% in PBS molare 0,1 per 25 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, lavare gli organoidi cinque volte in PBS per 10 minuti per lavaggio, prima di macchiare gli equivalenti intestinali e epatici con tetrametilhodamina isotiocianato phalloidin Alexa Fluor 647 phalloidin per un'ora a temperatura ambiente.Alla fine dell'incubazione, trasferire i campioni sul mezzo di congelamento per alcuni minuti prima di congelare i tessuti in azoto liquido. Successivamente, utilizzare un criostato per acquisire crio-sezioni di crioide epatiche spesse da 10 a 12 micron e montare le sezioni tissutali in mezzo di montaggio con DAPI per l'imaging mediante microscopia a fluorescenza confocale. Per la colorazione mitocondriale e nucleare, coprire completamente i campioni con soluzione di colorazione mitocondriale per un'incubazione da 15 a 45 minuti a 37 gradi Celsius in un'atmosfera umidificata con 5% di anidride carbonica.Al termine dell'incubazione, sostituire con cura la soluzione di colorazione con paraformaldeide dal 2 al 4% in PBS per 15 minuti a temperatura ambiente. Dopo il fissaggio, sciacquare delicatamente le cellule due volte con PBS fresco per cinque minuti per lavaggio prima di etichettare i campioni con soluzione di lavoro di colorazione dell'acido nucleico per 10 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, lavare i campioni con lavaggi di tre, cinque minuti in PBS protetti dalla luce e utilizzare la macchia di acido nucleico per facilitare la quantificazione del numero di macchie mitocondriali che esprimono cellule su un microscopio fluorescente con i set di filtri appropriati.L'integrazione della barriera intestinale umana e di un equivalente epatico in un dispositivo microfluidico a due chip d'organo consente di valutare le proprietà farmacocinetiche e tossicologiche dei trattamenti di interesse. Dopo il trattamento, i campioni di supporti possono essere analizzati da HPLC. Gli organoidi possono essere analizzati per la loro espressione genica, i valori di resistenza elettrica transeteliale, l'espressione e l'attività proteica, nonché per le loro caratteristiche morfologiche.L'analisi MTT può essere eseguita per valutare la fattibilità organoide, nonché per rilevare eventi tossici molto precoci in risposta al trattamento con acetaminofene. Il flusso del supporto non influisce significativamente sull'assorbimento dell'acetaminofene, mentre migliora significativamente la funzionalità equivalente epatica, indicando che l'assorbimento dell'acetaminofene intestinale umano e il metabolismo epatico possono essere emulati in questo sistema microfisiologico. I sistemi microfisiologici hanno il potenziale per sostituire i modelli animali nello sviluppo e nella scoperta di farmaci in quanto imitano meglio la fisiologia umana e possono essere utilizzati per promuovere lo sviluppo di farmaci a una velocità più elevata e a costi inferiori per rischio e complessità.

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