Name: an intestine/liver microphysiological system for drug pharmacokinetic and toxicological assessment
Uploaded: 2020-12-03T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Intestine/Liver Microphysiological System for Drug Pharmacokinetic and Toxicological Assessment at JoVE.com

Vi takker Dr. Christie Guguen-Guillouzo, Dr. Philippe Gripon på Unit 522 INSERM og dr. Christian Trepo ved Unit 271 INSERM for bruk av biologisk materiale (Hepa RG celler) og for å gjøre da tilgjengelig for oss for å utføre den akademiske forskningen.

1. Produksjon av vevsekvivalenter for dyrking i 2-OC
<ol><li>Tynntarmbarriere tilsvarende produksjon<ol>
<li>Vedlikehold Caco-2 og HT-29 celler ved hjelp av tarmen tilsvarende medium: DMEM supplert med 10% FBS, 1% penicillin og streptomycin, og 1% ikke-essensielle aminosyrer, som er navngitt som "DMEM S" i dette manuskriptet.</li>
		<li>Fjern mediet, vask to ganger med 1x DPBS og tilsett 8 ml 0,25% Trypsin / EDTA for å dissosiere Caco-2 celler dyrket i cellekulturflasker (175 cm2). Inkuber i 5 min ved 37 °...

<ol>
	<li>Zhang, D., Luo, G., Ding, X., Lu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+experimental+models+of+drug+metabolism+and+disposition+in+drug+discovery+and+development.">Preclinical experimental models of drug metabolism and disposition in drug discovery and development.</a> Acta Pharmaceutica Sinica B. 2 (6), 549-561 (2012).</li><li>Hynds, R. E., Giangreco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relevance+of+human+stem+cell-derived+organoid+models+for+epithelial+translational+medicine.">The relevance of human stem cell-derived organoid models for epithelial translational medicine.</a> Stem Cells. 31 (3), 417-422 (2013).</li><li>Sivaraman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Microscale+In+vitro+Physiological+Model+of+the+Liver:+Predictive+Screens+for+Drug+Metabolism+and+Enzyme+Induction.">A Microscale In vitro Physiological Model of the Liver: Predictive Screens for Drug Metabolism and Enzyme Induction.</a> Current Drug Metabolism. 6 (6), 569-591 (2005).</li><li>Dehne, E. M., Hasenberg, T., Marx, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ascendance+of+microphysiological+systems+to+solve+the+drug+testing+dilemma.">The ascendance of microphysiological systems to solve the drug testing dilemma.</a> Future Science OA. 3 (2), 185 (2017).</li><li>Oleaga, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Organ+toxicity+demonstration+in+a+functional+human+in+vitro+system+composed+of+four+organs.">Multi-Organ toxicity demonstration in a functional human in vitro system composed of four organs.</a> Scientific Reports. 6, 20030 (2016).</li><li>Maschmeyer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+four-organ-chip+for+interconnected+long-term+co-culture+of+human+intestine,+liver,+skin+and+kidney+equivalents.">A four-organ-chip for interconnected long-term co-culture of human intestine, liver, skin and kidney equivalents.</a> Lab Chip. 15 (12), 2688-2699 (2015).</li><li>Esch, M. B., Mahler, G. J., Stokol, T., Shuler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Body-on-a-chip+simulation+with+gastrointestinal+tract+and+liver+tissues+suggests+that+ingested+nanoparticles+have+the+potential+to+cause+liver+injury.">Body-on-a-chip simulation with gastrointestinal tract and liver tissues suggests that ingested nanoparticles have the potential to cause liver injury.</a> Lab Chip. 14 (16), 3081-3092 (2014).</li><li>Materne, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Multi-organ+Chip+-+A+Microfluidic+Platform+for+Long-term+Multi-tissue+Coculture.">The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture.</a> Journal of Visualized Experiments. , e52526 (2015).</li><li>Esch, M. B., Ueno, H., Applegate, D. R., Shuler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular,+pumpless+body-on-a-chip+platform+for+the+co-culture+of+GI+tract+epithelium+and+3D+primary+liver+tissue.">Modular, pumpless body-on-a-chip platform for the co-culture of GI tract epithelium and 3D primary liver tissue.</a> Lab Chip. 16 (14), 2719-2729 (2016).</li><li>Sung, J. H., Kam, C., Shuler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+device+for+a+pharmacokinetic&#8211;pharmacodynamic+(PK-PD)+model+on+a+chip.">A microfluidic device for a pharmacokinetic&#8211;pharmacodynamic (PK-PD) model on a chip.</a> Lab on a Chip. 10 (4), 446-455 (2010).</li><li>Viravaidya, K., Sin, A., Shuler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Microscale+Cell+Culture+Analog+to+Probe+Naphthalene+Toxicity.">Development of a Microscale Cell Culture Analog to Probe Naphthalene Toxicity.</a> Biotechnology Progress. 20 (1), 316-323 (2004).</li><li>Sin, A., Chin, K. C., Jamil, M. F., Kostov, Y., Rao, G., Shuler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Design+and+Fabrication+of+Three-Chamber+Microscale+Cell+Culture+Analog+Devices+with+Integrated+Dissolved+Oxygen+Sensors.">The Design and Fabrication of Three-Chamber Microscale Cell Culture Analog Devices with Integrated Dissolved Oxygen Sensors.</a> Biotechnology Progress. 20 (1), 338-345 (2004).</li><li>Tsamandouras, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+Gut+and+Liver+Microphysiological+Systems+for+Quantitative+In+vitro+Pharmacokinetic+Studies.">Integrated Gut and Liver Microphysiological Systems for Quantitative In vitro Pharmacokinetic Studies.</a> The AAPS Journal. 19 (5), 1499-1512 (2017).</li><li>Graham, G. G., Davies, M. J., Day, R. O., Mohamudally, A., Scott, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+modern+pharmacology+of+paracetamol:+Therapeutic+actions,+mechanism+of+action,+metabolism,+toxicity+and+recent+pharmacological+findings.">The modern pharmacology of paracetamol: Therapeutic actions, mechanism of action, metabolism, toxicity and recent pharmacological findings.</a> Inflammopharmacology. 21 (3), 201-232 (2013).</li><li>Hodgman, M. J., Garrard, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Review+of+Acetaminophen+Poisoning.">A Review of Acetaminophen Poisoning.</a> Critical Care Clinics. 28 (4), 499-516 (2012).</li><li>Maschmeyer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chip-based+human+liver-intestine+and+liver-skin+co-cultures+-+A+first+step+toward+systemic+repeated+dose+substance+testing+in+vitro.">Chip-based human liver-intestine and liver-skin co-cultures - A first step toward systemic repeated dose substance testing in vitro.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 95, 77-87 (2015).</li><li>Bessems, J. G. M., Vermeulen, N. P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracetamol+(acetaminophen)-induced+toxicity:+Molecular+and+biochemical+mechanisms,+analogues+and+protective+approaches.">Paracetamol (acetaminophen)-induced toxicity: Molecular and biochemical mechanisms, analogues and protective approaches.</a> Critical Reviews in Toxicology. 31 (1), 55-138 (2001).</li><li>Hirt, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+afterload+induces+pathological+cardiac+hypertrophy:+A+new+in+vitro+model.">Increased afterload induces pathological cardiac hypertrophy: A new in vitro model.</a> Basic Research in Cardiology. 107 (6), 307 (2012).</li><li>Fink, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+stretch+of+engineered+heart+tissue+induces+hypertrophy+and+functional+improvement.">Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement.</a> The FASEB journal official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 14 (5), 669-679 (2000).</li><li>Zhang, B., Peticone, C., Murthy, S. K., Radisic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+standalone+perfusion+platform+for+drug+testing+and+target+validation+in+micro-vessel+networks.">A standalone perfusion platform for drug testing and target validation in micro-vessel networks.</a> Biomicrofluidics. 7 (4), 044125 (2013).</li><li>Ara&#250;jo, F., Sarmento, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+the+characterization+of+an+in+vitro+triple+co-culture+intestine+cell+model+for+permeability+studies.">Towards the characterization of an in vitro triple co-culture intestine cell model for permeability studies.</a> International Journal of Pharmaceutics. 458 (1), 128-134 (2013).</li><li>Cadena-Herrera, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+three+viable-cell+counting+methods:+Manual,+semi-automated,+and+automated.">Validation of three viable-cell counting methods: Manual, semi-automated, and automated.</a> Biotechnology Reports. 7, 9-16 (2015).</li><li>Gripon, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+a+human+hepatoma+cell+line+by+hepatitis+B+virus.">Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (24), 15655-15660 (2002).</li><li>Guillouzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+hepatoma+HepaRG+cells:+A+highly+differentiated+model+for+studies+of+liver+metabolism+and+toxicity+of+xenobiotics.">The human hepatoma HepaRG cells: A highly differentiated model for studies of liver metabolism and toxicity of xenobiotics.</a> Chemico-Biological Interactions. 168 (1), 66-73 (2007).</li><li>Wagner, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dynamic+multi-organ-chip+for+long-term+cultivation+and+substance+testing+proven+by+3D+human+liver+and+skin+tissue+co-culture.">A dynamic multi-organ-chip for long-term cultivation and substance testing proven by 3D human liver and skin tissue co-culture.</a> Lab on a Chip. 13 (18), 3538-3547 (2013).</li><li>Forrest, J. A. H., Clements, J. A., Prescott, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Pharmacokinetics+of+Paracetamol.">Clinical Pharmacokinetics of Paracetamol.</a> Clinical Pharmacokinetics. 7 (2), 93-107 (1982).</li><li>Dollery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Therapeutic Drugs. , (1999).</li><li>Shah, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioanalytical+method+validation-a+revisit+with+a+decade+of+progress.">Bioanalytical method validation-a revisit with a decade of progress.</a> Pharmaceutical research. 17 (12), 1551-1557 (2000).</li><li>Marin, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shp2+negatively+regulates+growth+in+cardiomyocytes+by+controlling+focal+adhesion+kinase/src+and+mTOR+pathways.">Shp2 negatively regulates growth in cardiomyocytes by controlling focal adhesion kinase/src and mTOR pathways.</a> Circulation Research. 103 (8), 813-824 (2008).</li><li>Linkert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metadata+matters:+Access+to+image+data+in+the+real+world.">Metadata matters: Access to image data in the real world.</a> Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OECD+TG+491+-+Short+Time+Exposure+In+vitro+Test+Method+for+Identifying+i)+Chemicals+Inducing+Serious+Eye+Damage+and+ii)+Chemicals+Not+Requiring+Classification+for+Eye+Irritation+or+Serious+Eye+Damage.">OECD TG 491 - Short Time Exposure In vitro Test Method for Identifying i) Chemicals Inducing Serious Eye Damage and ii) Chemicals Not Requiring Classification for Eye Irritation or Serious Eye Damage.</a> OECD. 14, (2018).</li><li>Fernandes, M. B., Gon&#231;alves, J. E., Tavares, L. C., Storpirtis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caco-2+cells+permeability+evaluation+of+nifuroxazide+derivatives+with+potential+activity+against+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+(MRSA).">Caco-2 cells permeability evaluation of nifuroxazide derivatives with potential activity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA).</a> Drug Development and Industrial Pharmacy. 41 (7), 1066-1072 (2015).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OECD+TG+492+-+Reconstructed+human+Cornea-like+Epithelium+(RhCE)+test+method+for+identifying+chemicals+not+requiring+classification+and+labelling+for+eye+irritation+or+serious+eye+damage.">OECD TG 492 - Reconstructed human Cornea-like Epithelium (RhCE) test method for identifying chemicals not requiring classification and labelling for eye irritation or serious eye damage.</a> OECD. 35, (2018).</li><li>OECD, O. E. C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OECD+TG+431+-+In+vitro+skin+corrosion:+reconstructed+human+epidermis+(RHE)+test+method.">OECD TG 431 - In vitro skin corrosion: reconstructed human epidermis (RHE) test method.</a> OECD. 8, (2016).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OECD+TG+439+-+In+vitro+Skin+Irritation:+Reconstructed+Human+Epidermis+Test+Method.">OECD TG 439 - In vitro Skin Irritation: Reconstructed Human Epidermis Test Method.</a> OECD. 21, (2015).</li><li>Marin, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetaminophen+absorption+and+metabolism+in+an+intestine/liver+microphysiological+system.">Acetaminophen absorption and metabolism in an intestine/liver microphysiological system.</a> Chemico-Biological Interactions. 299, 59-76 (2019).</li><li>Maass, C., Stokes, C. L., Griffith, L. G., Cirit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-functional+scaling+methodology+for+translational+pharmacokinetic+and+pharmacodynamic+applications+using+integrated+microphysiological+systems+(MPS).">Multi-functional scaling methodology for translational pharmacokinetic and pharmacodynamic applications using integrated microphysiological systems (MPS).</a> Integrative Biology (United Kingdom). 9 (4), 290-302 (2017).</li><li>Sung, J. H., Wang, Y., Shuler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+using+mathematical+modeling+approaches+to+design+and+interpret+multi-organ+microphysiological+systems+(MPS).">Strategies for using mathematical modeling approaches to design and interpret multi-organ microphysiological systems (MPS).</a> APL Bioengineering. 3 (2), 021501 (2019).</li></ol>

Den nøyaktige og pålitelige vurderingen av de farmakologiske egenskapene til undersøkende nye legemidler er avgjørende for å redusere risikoen i følgende utviklingstrinn. MPS er en relativt ny teknologi, som tar sikte på å forbedre den prediktive kraften og redusere kostnadene og tiden som brukes med prekliniske tester. Vår gruppe er fremme i vurderingen av farmakokinetiske og toksikologiske egenskaper hovedsakelig nødvendig for bly optimalisering. Vi jobbet med 2-OC mikrofluidisk enhet, som har to kamre, slik ...

På grunn av genomiske og proteomiske forskjeller har dyremodeller begrenset prediktiv verdi for flere menneskelige resultater. Videre er de tidkrevende, dyre og etisk tvilsomme1. MPS er en relativt ny teknologi som tar sikte på å forbedre den prediktive kraften og redusere kostnadene og tiden som brukes med prekliniske tester. De er mikrofluidiske enheter som dyrker organoider (kunstige mimetika funksjonelle enheter av organer) under mediestrømmen som fremmer organoid-organoid kommunikasjon. Organoider laget av menneskelige celler øker translasjonellrelevans 2,3,4. MPS forventes å yte bedre enn dyretestene fordi de er genetisk menneskelige og rekafulerer samspillet mellom vev. Når det er fullt funksjonelt, vil MPS gi mer meningsfulle resultater, med høyere hastighet og lavere kostnader og risiko4. Mange grupper utvikler MPS for flere formål, spesielt sykdomsmodeller for å teste stoffets effekt.
Eksponeringsnivå er en av de mest kritiske parametrene for evaluering av legemiddeleffektivitet ogtoksisitet 5,6,7,8,9,10,11,12. MPS tillater organoid integrasjon som emulerer systemisk eksponering og forventes å yte bedre enn den tradisjonelle 2D menneskelige vevskulturen. Denne teknologien kan forbedre prediksjonen av sammensatt tarmabsorpsjon og levermetabolisme4.
En MPS integrere menneskelig ekvivalent modell av tarm og lever er et godt utgangspunkt, vurderer den sentrale rollen til disse to organene i narkotika biotilgjengelighet og systemisk eksponering13,14,15. APAP er et attraktivt stoff for å studere en MPS uten nyreekvivalent fordi metaboliseringen gjøres hovedsakelig avleveren 16,17.
2-OC er en to-kammers mikrofluidisk enhet egnet for kulturen til to forskjellige menneskelige ekvivalente vev / organoider forbundet med mikrokanaler16. For å etterligne en in vitro human oral/intravenøs administrering av et legemiddel og vurdere effekten av kryss-snakk mellom tarmen og leverekvivalenter på farmakokinetikken til APAP, i tillegg til organoider funksjonalitet og levedyktighet, tre forskjellige MPS-samlinger ble utført: (1) en "Tarm 2-OC MPS" består av en tarm tilsvarende basert i en kultur innsats som inneholder en Caco-2 + HT-29 celler kokultur, integrert i 2-OC enhet; (2) en "Liver 2-OC MPS" bestående av leversfæroider laget av HepaRG + HHSteC (Human Hepatic Stellate Cells) integrert i 2-OC-enheten; og (3) en "Tarm/Lever 2-OC MPS" bestående av tarmen tilsvarende i ett enhetsrom kommunisere med leveren tilsvarende i den andre av media flyter gjennom mikrofluidiske kanaler.
Alle analyser ble utført under statiske (ingen flyt) og dynamiske (med strømning) forhold på grunn av virkningen av de mekaniske stimuli (kompresjon, strekking og skjær) på celle levedyktighet og funksjonalitet18,19,20. Den nåværende artikkelen beskriver protokollen for APAP oral/intravenøs administrasjon emulering og de respektive absorpsjon /metabolisme og toksikologiske analyser i 2-OC MPS som inneholder humant tarm og leverekvivalente modeller.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x DPBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190235</td>
			<td>No calcium, no magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-OC</td>
			<td>TissUse GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Two-organ chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well Spheroid Microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3830</td>
			<td>Black/Clear, Round Bottom, Ultra-Low Attachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Use to fix cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetaminophen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7085</td>
			<td>Use to MPS assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Tedia</td>
			<td></td>
			<td>Used to perform HPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>confocal experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Used to perform HPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caco-2 cells</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>86010202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cacodylate buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12800017</td>
			<td>Add supplements: 10% fetal bovine serum, 100 units per mL penicillin, 100 &#181;g/mL streptomycin, and 1% non-essential amino acids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4540</td>
			<td>Add 2% to HepaRG media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Synth</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12657029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing medium OCT</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td></td>
			<td>Tissue-Tek&#174; O.C.T.&#8482; Compound is a formulation of watersoluble glycols and resins, providing a convenient specimen matrix for cryostat sectioning at temperatures of -10&#176;C and below.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin &#38; Eosin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepaRG cells</td>
			<td>Biopredic International</td>
			<td>HPR101</td>
			<td>Undifferentiated cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HHSTeC</td>
			<td>ScienCell Research Laboratories</td>
			<td>5300</td>
			<td>Cells and all culture supplements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>HCA experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT-29 cells</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>85061109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Insulin</td>
			<td>Invitrogen - Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12585014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H0888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>278475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Karnovsky&#8217;s fixative</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2916801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna C18 guard column SS</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td></td>
			<td>Used to perform HPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell 0.4 &#181;m pore size inserts</td>
			<td>Merck</td>
			<td>PIHP01250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell ERS-2 meter</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MERS00002</td>
			<td>Used to TEER measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker Deep Red</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>HCA experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>M6494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MX3000P system</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Counting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operetta High Content Imaging System</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td>Used to perform HCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P450-Glo CYP3A4 Assay with Luciferin-IPA</td>
			<td>Promega</td>
			<td>Cat.# V9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15070063</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF Syringe filter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.22 &#956;m pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reversed-phase Luna C18 column</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td></td>
			<td>Used to perform HPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker (IKA VXR Basic Vibrax)</td>
			<td>IKA Works GmbH &#38; Co</td>
			<td>2819000</td>
			<td>Used for spheroids to improve MTT assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stellate Cell Media (STeC CM)</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>5301</td>
			<td>Add STeC CM supplements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScriptIITM Reverse Transcriptase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green PCR Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRizol TM reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Trizol is a monophasic solution of phenol and guanidine isothiocyanate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R001100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low-attachment plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3471-24EA</td>
			<td>6 wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield plus DAPI mounting media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Opaque 96-well Microplate</td>
			<td>PerkinHelmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide-bore tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Williams E</td>
			<td>Pan Biotech</td>
			<td>P04-29510</td>
			<td>Add supplements: 10% fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine, 100 units per ml penicillin, 100 &#181;g/mL streptomycin and 5 &#181;g/mL human insulin</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an intestine/liver microphysiological system for drug pharmacokinetic and toxicological assessment

De nylig introduserte mikrofysiologiske systemene (MPS) som dyrker menneskelige organoider forventes å yte bedre enn dyr i den prekliniske testfasen av stoffutviklingsprosessen fordi de er genetisk menneskelige og rekapulerer samspillet mellom vev. I denne studien ble den menneskelige tarmbarrieren (emulert av en co-kultur av Caco-2 og HT-29 celler) og leverekvivalenten (emulert av sfæroider laget av differensierte HepaRG-celler og humane hepatiske stellateceller) integrert i en toorganchip (2-OC) mikrofluidisk enhet for å vurdere noen paracetamol (APAP) farmakokinetiske (PK) og toksikologiske egenskaper. MPS hadde tre forsamlinger: Tarmen bare 2-OC, Liver bare 2-OC, og Tarm / Lever 2-OC med samme media perfusing begge organoider. For PK-vurderinger doserte vi APAP i media ved forhåndsinnstilte tidspunkter etter administrering av det enten over tarmbarrieren (emulering av den orale ruten) eller i media (emulerer intravenøs rute), ved henholdsvis 12 μM og 2 μM. Medieprøvene ble analysert av omvendt fase høytrykks flytende kromatografi (HPLC). Organoider ble analysert for genuttrykk, for TEER-verdier, for proteinuttrykk og aktivitet, og deretter samlet inn, fast og sendt til et sett med morfologiske evalueringer. MTT-teknikken gjorde det bra i vurderingen av organoid levedyktighet, men de høye innholdsanalysene (HCA) var i stand til å oppdage svært tidlige toksiske hendelser som svar på APAP-behandling. Vi bekreftet at mediestrømmen ikke påvirker APAP-absorpsjonen betydelig, mens den forbedrer leverekvivalentfunksjonaliteten betydelig. APAP menneskelig intestinal absorpsjon og levermetabolisme kan emuleres i MPS. Sammenhengen mellom MPS-data og silicomodellering har stort potensial til å forbedre forutsigbarheten til in vitro-metodene og gi bedre nøyaktighet enn dyremodeller i farmakokinetiske og toksikologiske studier.

For å utføre PK APAP-testene i 2-OC MPS, er det første trinnet å produsere tarmen og leverekvivalenter (organoider). De er integrert i 2-OC mikrofluidisk enhet (figur 1A) 24 h før oppstart av PK APAP-analysen. Neste dag endres mediet, og modellen er utsatt for APAP. Figur 1 illustrerer tarmen og leverekvivalenter plassert inne i 2-OC-enheten (figur 1B) og APAP PK-eksperimenttidskurset (figur 1C). V...

Watch this Scientific Journal Video about An Intestine/Liver Microphysiological System for Drug Pharmacokinetic and Toxicological Assessment at JoVE.com

An Intestine/Liver Microphysiological System for Drug Pharmacokinetic and Toxicological Assessment

Vi eksponerte et mikrofysiologisk system (MPS) med tarm- og leverorganoider for paracetamol (APAP). Denne artikkelen beskriver metodene for organoid produksjon og APAP farmakokinetiske og toksikologiske eiendomsvurderinger i MPS. Den beskriver også vevfunksjonsanalysene som er nødvendige for å validere resultatene.

Et mikrofysiologisk system for farmakokinetisk og toksikologisk vurdering av tarmen/leveren

The recently introduced microphysiological systems (MPS) cultivating human organoids are expected to perform better than animals in the preclinical tests ...

Mikrofysiologiske systemer har evnen til å etterligne farmakokinetiske og den toksikologiske responsen fra menneskekroppen til spesifikke behandlinger av interesser. Mikrofysiologiske systemer har potensial til å erstatte dyretester som deres bruk kan forbedre den prediktive kraften i in vitro metoder og redusere kostnadene og tiden for farmakokinetiske og toksikologiske studier. 24 timer før teststoffet administrasjon, dele en 800 mikroliter aliquot av William ES medium mellom større og mindre rom av de to organ chip, og aspirere basolateral og apical medium fra hver tarmbarriere tilsvarende i de forberedte 24 brønnplater.Ved hjelp av sterile tang, integrere en innsats per to organ chip krets i større rom og legge til 200 mikroliter dmems til den aktuelle siden. Bruk brede borespisser, integrer 20 leverekvivalenter per krets i det mindre rommet på de to organbrikkene og koble systemet til styreenheten. Koble deretter styreenheten til en trykklufttilførsel og sett trykket til omtrent pluss eller minus 300 barer og en pumpefrekvens på 0,3 Hertz.Neste dag fortynner bestanden paracetamol løsning til en 12 mikromosentrasjon. For å erstatte mediet i systemet, aspirer basolaterale og a apical media fra tarmbarrieren tilsvarende i de to organbrikke og legg til 500 mikroliter av friskt egnet kulturmedium i det store rommet på organoid basolateral side og 300 mikroliter til det lille rommet. Etter å ha sjekket for bobler, emuler oral administrasjon med tillegg av 200 mikroliter av en 12 mikromosaceaminophen løsning på den a apiske siden av tarmkulturen setter inn og kobler mikrofysiologisk system til kontrollenheten.Samle det totale volumet fra både tarmapotiske og basolaterale sider, samt fra det lille rommet i triplicate på de angitte tidspunktene. Når alle prøvene er samlet inn, angir du alle relevante parametere for HPLC-analysen som angitt i tabellen, og filtrerer mobilfasen gjennom et 0,4 mikron membranfilter under vakuum. Deretter filtrerer du prøvene gjennom et PVDF-sprøytefilter i PVDF-sprøytestørrelse på 0,22 mikron og oppbevar prøvene i et hetteglass før du starter HPLC UV-målingen.For å vurdere organoid levedyktighet, overføre alle 20 sfæroider fra hver replikere til individuelle brønner av en 96 brønnplate og overføre cellekulturinnsatser til individuelle brønner av en 24 brønnplate. Vask vevsekvivalentene tre ganger med friske DPBS per vask og tilsett 300 mikroliter av en ett mg per milliliter MTT-løsning til hver eksperimentelle brønn. Etter en tre timers inkubasjon i cellekulturinkubatoren, erstatt MTT-løsningen med 200 mikroliter isopropanol per brønn for en overnattingsinkubasjon ved fire grader Celsius for å trekke ut MTT-formazanen fra tarmen og leverekvivalenter.Neste morgen, overføre 200 mikroliter av hver supernatant til riktig brønn i 96 brønnplate og lese formazan på en plateleser på 570 nanometer for å tillate beregning av den relative evnen til cellene for å redusere MTT ved hjelp av gjennomsnittlig optisk tetthet av hvert tidspunkt i forhold til den negative kontrollen. For cytokjemisk og histologisk analyse av prøvene, må du først fikse tarmen og leverekvivalentene i 4% paraformaldehyd i 0,1 molar PBS i 25 minutter ved romtemperatur. På slutten av inkubasjonen vasker du organoidene fem ganger i PBS i 10 minutter per vask, før du flekker tarm- og leverekvivalenter med tetrametylrhodaminisothiocyanat falloidin Alexa Fluor 647 falloidin i en time ved romtemperatur.På slutten av inkubasjonen, overfør prøvene til frysemediet i noen minutter før du klikker fryse vevet i flytende nitrogen. Deretter bruker du en kryostat til å skaffe 10 til 12 mikron tykk leversfæroide kryo-seksjoner og montere vevseksjonene i monteringsmedium med DAPI for avbildning ved konfokal fluorescensmikroskopi. For mitokondrie- og kjernefysisk farging, dekk helt prøvene med mitokondriefargingsløsning for en 15 til 45 minutters inkubasjon ved 37 grader Celsius i en fuktet atmosfære med 5% karbondioksid.Ved slutten av inkubasjonen, må du forsiktig erstatte fargeløsningen med 2 til 4 % paraformaldehyd i PBS i 15 minutter ved romtemperatur. Etter fiksering, skyll cellene forsiktig to ganger med fersk PBS i fem minutter per vask før du merker prøvene med nukleinsyrefargingsløsning i 10 minutter ved romtemperatur. På slutten av inkubasjonen vask prøvene med tre, fem minutters vasker i PBS beskyttet mot lys, og bruk nukleinsyreflekken for å lette kvantifiseringen av antall mitokondrieflekk som uttrykker celler på et fluorescerende mikroskop med de riktige filtersettene.Integrering av den menneskelige tarmbarrieren og en leverekvivalent i en to organbrikke mikrofluidisk enhet gjør det mulig å vurdering av de farmakokinetiske og toksikologiske egenskapene til behandlinger av interesse. Etter behandling kan medieprøvene analyseres av HPLC. Organoidene kan analyseres for deres genuttrykk, transepiteliske elektriske motstandsverdier, og proteinuttrykk og aktivitet, samt for deres morfologiske egenskaper.MTT-analyse kan utføres for å vurdere organoid levedyktighet, samt å oppdage svært tidlige toksiske hendelser som respons på paracetamolbehandling. Mediestrømmen påvirker ikke signifikant paracetamolabsorpsjon, mens det forbedrer leverekvivalentfunksjonaliteten betydelig, noe som indikerer at human intestinal paracetamolabsorpsjon og levermetabolisme kan emuleres i dette mikrofysiologiske systemet. Mikrofysiologiske systemer har potensial til å erstatte dyremodeller i narkotikautvikling og oppdagelse som de bedre etterligne menneskelig fysiologi og kan brukes til å fremme narkotikautvikling med høyere hastighet og lavere kostnader til risiko og kompleksitet.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacology

Chemistry

Unit 1

Pharmacokinetics

SCIENTISTS IN ACTION

Preparation and Characterization of SDF-1&#945;-Chitosan-Dextran Sulfate Nanoparticles

Preparation and Characterization of SDF-1ÃƒÅ½Ã‚Â±-Chitosan-Dextran Sulfate Nanoparticles

Utarbeidelse og karakterisering av SDF-1α-Chitosan-dekstransulfat Nanopartikler

Chitosan (CS) and dextran sulfate (DS) are charged polysaccharides (glycans), which form polyelectrolyte complex-based nanoparticles when mixed under ...

Preparation and Characterization of Individual and Multi-drug Loaded Physically Entrapped Polymeric Micelles

Utarbeidelse og karakterisering av Individuell og Multi-drug Loaded fysisk innesperret Polymer Miceller

Amphiphilic block copolymers like polyethyleneglycol-block-polylactic acid (PEG-b-PLA) can self-assemble into micelles above their critical micellar ...

Protocol for the Synthesis of Ortho-trifluoromethoxylated Aniline Derivatives

Protocol for the Synthesis of Ortho-trifluoromethoxylated Aniline Derivatives

Protokoll for syntese av<em&gt; Ortho</em&gt; -trifluoromethoxylated anilinderivater

Molecules bearing trifluoromethoxy (OCF3) group often show desired pharmacological and biological properties. However, facile synthesis of ...

PTR-ToF-MS Coupled with an Automated Sampling System and Tailored Data Analysis for Food Studies: Bioprocess Monitoring, Screening and Nose-space Analysis

PTR-ToF-MS kombinert med et automatisert utvalgssystem og skreddersydd dataanalyse for matstudier: Bioprosessovervåking, screening og nese-romanalyse

Proton Transfer Reaction (PTR), combined with a Time-of-Flight (ToF) Mass Spectrometer (MS) is an analytical approach based on chemical ionization that ...

An Aptamer-based Sensor for Unchelated Gadolinium(III)

An Aptamer-based Sensor for Unchelated GadoliniumIII

En Aptamer basert sensor for uchelatert gadolinium (III)

A method for determining the presence of unchelated trivalent gadolinium ion (Gd3+) in aqueous solution is demonstrated. Gd3+ is often present in samples ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

Sanntid pusten analyse ved hjelp av sekundære Nanoelectrospray Ionization koblet til høy oppløsning massespektrometri

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

An Engineered Split-TET2 Enzyme for Chemical-inducible DNA Hydroxymethylation and Epigenetic Remodeling

En konstruert Split-TET2 enzymet for kjemisk-induserbart DNA Hydroxymethylation og Epigenetic Remodeling

DNA methylation is a stable and heritable epigenetic modification in the mammalian genome and is involved in regulating gene expression to control ...

Generation of Electronic Cigarette Aerosol by a Third-Generation Machine-Vaping Device: Application to Toxicological Studies

Generering av elektronisk sigarett Aerosol av en tredje generasjons maskin-Vaping enhet: programmet toksikologiske studier

Electronic-cigarette (e-cig) devices use heat to produce an inhalable aerosol from a liquid (e-liquid) composed mainly of humectants, nicotine, and ...

High-throughput and Comprehensive Drug Surveillance Using Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

Høy gjennomstrømming og omfattende narkotika overvåkning bruker Multisegment injeksjon-kapillære geleelektroforese massespektrometri

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug ...

An Electrochemical Cholesteric Liquid Crystalline Device for Quick and Low-Voltage Color Modulation

En elektrokjemisk Cholesteric flytende krystallinsk enhet for rask og lav spenning modulering

We demonstrate a method for fabricating a prototype reflective display device that contains cholesteric liquid crystal (LC) as an active component. The ...