Name: an intestine/liver microphysiological system for drug pharmacokinetic and toxicological assessment
Uploaded: 2020-12-03T12:30:00
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Agradecemos ao Dr. Christie Guguen-Guillouzo, ao Dr. Philippe Gripon na Unidade 522 INSERM e ao Dr. Christian Trepo na Unidade 271 INSERM pelo uso do Material Biológico (células Hepa RG) e por disponibilizar para nós, a fim de realizar a pesquisa acadêmica.

1. Produção de equivalentes teciduais para cultivo no 2-OC
<ol><li>Produção equivalente de barreira intestinal pequena<ol>
<li>Manter as células Caco-2 e HT-29 utilizando o meio equivalente intestinal: DMEM suplementado com 10% de FBS, 1% penicilina e estreptomicina, e 1% aminoácidos não essenciais, que é nomeado como "DMEM S" neste manuscrito.</li>
		<li>Retire o meio, lave duas vezes com 1x DPBS e adicione 8 mL de 0,25% Trypsin/EDTA para dissociar células Caco-2 cultivadas em frascos de cultura celular (175 ...

<ol>
	<li>Zhang, D., Luo, G., Ding, X., Lu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+experimental+models+of+drug+metabolism+and+disposition+in+drug+discovery+and+development.">Preclinical experimental models of drug metabolism and disposition in drug discovery and development.</a> Acta Pharmaceutica Sinica B. 2 (6), 549-561 (2012).</li><li>Hynds, R. 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B., Gon&#231;alves, J. E., Tavares, L. C., Storpirtis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caco-2+cells+permeability+evaluation+of+nifuroxazide+derivatives+with+potential+activity+against+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+(MRSA).">Caco-2 cells permeability evaluation of nifuroxazide derivatives with potential activity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA).</a> Drug Development and Industrial Pharmacy. 41 (7), 1066-1072 (2015).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OECD+TG+492+-+Reconstructed+human+Cornea-like+Epithelium+(RhCE)+test+method+for+identifying+chemicals+not+requiring+classification+and+labelling+for+eye+irritation+or+serious+eye+damage.">OECD TG 492 - Reconstructed human Cornea-like Epithelium (RhCE) test method for identifying chemicals not requiring classification and labelling for eye irritation or serious eye damage.</a> OECD. 35, (2018).</li><li>OECD, O. E. C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OECD+TG+431+-+In+vitro+skin+corrosion:+reconstructed+human+epidermis+(RHE)+test+method.">OECD TG 431 - In vitro skin corrosion: reconstructed human epidermis (RHE) test method.</a> OECD. 8, (2016).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OECD+TG+439+-+In+vitro+Skin+Irritation:+Reconstructed+Human+Epidermis+Test+Method.">OECD TG 439 - In vitro Skin Irritation: Reconstructed Human Epidermis Test Method.</a> OECD. 21, (2015).</li><li>Marin, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetaminophen+absorption+and+metabolism+in+an+intestine/liver+microphysiological+system.">Acetaminophen absorption and metabolism in an intestine/liver microphysiological system.</a> Chemico-Biological Interactions. 299, 59-76 (2019).</li><li>Maass, C., Stokes, C. L., Griffith, L. G., Cirit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-functional+scaling+methodology+for+translational+pharmacokinetic+and+pharmacodynamic+applications+using+integrated+microphysiological+systems+(MPS).">Multi-functional scaling methodology for translational pharmacokinetic and pharmacodynamic applications using integrated microphysiological systems (MPS).</a> Integrative Biology (United Kingdom). 9 (4), 290-302 (2017).</li><li>Sung, J. H., Wang, Y., Shuler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+using+mathematical+modeling+approaches+to+design+and+interpret+multi-organ+microphysiological+systems+(MPS).">Strategies for using mathematical modeling approaches to design and interpret multi-organ microphysiological systems (MPS).</a> APL Bioengineering. 3 (2), 021501 (2019).</li></ol>

A avaliação precisa e confiável das propriedades farmacológicas de novas drogas investigativas é fundamental para reduzir o risco nas seguintes etapas de desenvolvimento. O MPS é uma tecnologia relativamente nova, que visa melhorar o poder preditivo e reduzir os custos e o tempo gasto com testes pré-clínicos. Nosso grupo está avançando na avaliação de propriedades farmacocinéticas e toxicológicas, principalmente necessárias para otimização de chumbo. Trabalhamos com o dispositivo microfluido 2-OC, que po...

Devido a diferenças genômicas e proteômicas, os modelos animais têm valor preditivo limitado para vários desfechos humanos. Além disso, são demorados, caros e eticamente questionáveis1. O MPS é uma tecnologia relativamente nova que visa melhorar a potência preditiva e reduzir os custos e o tempo gasto com testes pré-clínicos. São dispositivos microfluidos que cultivam organoides (unidades funcionais de mimética artificial de órgãos) sob fluxo de mídia que promove a comunicação organóide-organóide. Organoides feitos de células humanas aumentam a relevância translacional2,3,4. Espera-se que o MPS se comtrate melhor do que os testes em animais porque eles são geneticamente humanos e recapitulam a interação entre tecidos. Quando totalmente funcional, o MPS fornecerá resultados mais significativos, em maior velocidade e menores custos e riscos4. Muitos grupos estão desenvolvendo MPS para vários propósitos, especialmente modelos de doenças para testar a eficácia da droga.
O nível de exposição é um dos parâmetros mais críticos para avaliar a eficácia e toxicidade da droga5,6,7,8,9,10,11,12. O MPS permite a integração organoide que emula exposição sistêmica e espera-se que seja melhor do que a cultura tradicional do tecido humano 2D. Esta tecnologia pode melhorar significativamente a previsão de absorção intestinal composta e metabolismo hepático4.
Um MPS integrando modelo equivalente humano de intestino e fígado é um bom ponto de partida, considerando o papel central desses dois órgãos na biodisponibilidade de medicamentos e exposição sistêmica13,14,15. APAP é uma droga atraente para estudar um MPS sem um equivalente renal porque sua metabolização é feita principalmente pelo fígado16,17.
O 2-OC é um dispositivo microfluido de duas câmaras adequado para a cultura de dois diferentes tecidos/organoides equivalentes humanos interligados por microcanais16. A fim de emular uma administração oral/intravenosa humana in vitro de uma droga e avaliar os efeitos da conversa cruzada entre o intestino e os equivalentes hepáticos na farmacocinética APAP, além da funcionalidade e viabilidade dos organoides, foram realizados três diferentes conjuntos de MPS: (1) um "Intestino 2-OC MPS" composto por um equivalente intestinal baseado em uma inserção cultural contendo uma cocultura de células Caco-2 + HT-29, integrada ao dispositivo 2-OC; (2) um "Liver 2-OC MPS" composto por esferoides hepáticos feitos de HepaRG + HHSteC (Células Estelares Hepáticas Humanas) integrados no dispositivo 2-OC; e (3) um "Intestino/Fígado 2-OC MPS" composto pelo equivalente do intestino em um compartimento de dispositivo comunicando-se com o equivalente hepático no outro pelo fluxo de mídia através dos canais microfluidos.
Todos os ensaios foram realizados sob condições estáticas (sem fluxo) e dinâmicas (com fluxo) devido ao impacto dos estímulos mecânicos (compressão, alongamento e cisalhamento) na viabilidade e funcionalidades da célula18,19,20. O presente artigo descreve o protocolo para emulação de administração oral/intravenosa da APAP e as respectivas análises de absorção/metabolismo e toxicológicas no MPS 2-OC contendo modelos equivalentes de intestino humano e fígado.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x DPBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190235</td>
			<td>No calcium, no magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-OC</td>
			<td>TissUse GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Two-organ chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well Spheroid Microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3830</td>
			<td>Black/Clear, Round Bottom, Ultra-Low Attachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Use to fix cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetaminophen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7085</td>
			<td>Use to MPS assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Tedia</td>
			<td></td>
			<td>Used to perform HPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>confocal experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Used to perform HPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caco-2 cells</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>86010202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cacodylate buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12800017</td>
			<td>Add supplements: 10% fetal bovine serum, 100 units per mL penicillin, 100 &#181;g/mL streptomycin, and 1% non-essential amino acids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4540</td>
			<td>Add 2% to HepaRG media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Synth</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12657029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing medium OCT</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td></td>
			<td>Tissue-Tek&#174; O.C.T.&#8482; Compound is a formulation of watersoluble glycols and resins, providing a convenient specimen matrix for cryostat sectioning at temperatures of -10&#176;C and below.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin &#38; Eosin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepaRG cells</td>
			<td>Biopredic International</td>
			<td>HPR101</td>
			<td>Undifferentiated cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HHSTeC</td>
			<td>ScienCell Research Laboratories</td>
			<td>5300</td>
			<td>Cells and all culture supplements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>HCA experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT-29 cells</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>85061109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Insulin</td>
			<td>Invitrogen - Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12585014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H0888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>278475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Karnovsky&#8217;s fixative</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2916801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna C18 guard column SS</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td></td>
			<td>Used to perform HPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell 0.4 &#181;m pore size inserts</td>
			<td>Merck</td>
			<td>PIHP01250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell ERS-2 meter</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MERS00002</td>
			<td>Used to TEER measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker Deep Red</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>HCA experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>M6494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MX3000P system</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Counting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operetta High Content Imaging System</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td>Used to perform HCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P450-Glo CYP3A4 Assay with Luciferin-IPA</td>
			<td>Promega</td>
			<td>Cat.# V9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15070063</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF Syringe filter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.22 &#956;m pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reversed-phase Luna C18 column</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td></td>
			<td>Used to perform HPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker (IKA VXR Basic Vibrax)</td>
			<td>IKA Works GmbH &#38; Co</td>
			<td>2819000</td>
			<td>Used for spheroids to improve MTT assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stellate Cell Media (STeC CM)</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>5301</td>
			<td>Add STeC CM supplements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScriptIITM Reverse Transcriptase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green PCR Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRizol TM reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Trizol is a monophasic solution of phenol and guanidine isothiocyanate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R001100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low-attachment plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3471-24EA</td>
			<td>6 wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield plus DAPI mounting media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Opaque 96-well Microplate</td>
			<td>PerkinHelmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide-bore tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Williams E</td>
			<td>Pan Biotech</td>
			<td>P04-29510</td>
			<td>Add supplements: 10% fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine, 100 units per ml penicillin, 100 &#181;g/mL streptomycin and 5 &#181;g/mL human insulin</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an intestine/liver microphysiological system for drug pharmacokinetic and toxicological assessment

Espera-se que os sistemas microfisiológicos (MPS) recém-introduzidos que cultivam organoides humanos tenham um desempenho melhor do que os animais na fase de testes pré-clínicos do processo de desenvolvimento de medicamentos porque são geneticamente humanos e recapitulam a interação entre tecidos. Neste estudo, a barreira intestinal humana (emulada por uma co-cultura de células Caco-2 e HT-29) e o equivalente hepático (emulado por esferoides feitos de células hepaRG diferenciadas e células estelares hepáticas humanas) foram integrados em um dispositivo microfluido de dois órgãos (2-OC) para avaliar algumas propriedades farmacocinóficas (APAP) e toxicológicas. O MPS tinha três conjuntos: Intestino apenas 2-OC, Fígado apenas 2-OC, e Intestino/Fígado 2-OC com a mesma mídia perfusando ambos organoides. Para avaliações de PK, dosamos o APAP na mídia em momentos de predefinição após a administração sobre a barreira intestinal (emulando a rota oral) ou na mídia (emulando a rota intravenosa), a 12 μM e 2 μM, respectivamente. As amostras de mídia foram analisadas por cromatografia líquida de alta pressão de fase invertida (HPLC). Os organoides foram analisados para expressão genética, para valores de TEER, para expressão e atividade proteica, e depois coletados, fixos e submetidos a um conjunto de avaliações morfológicas. A técnica MTT teve um bom desempenho na avaliação da viabilidade organoide, mas as análises de alto teor (HCA) foram capazes de detectar eventos tóxicos muito precoces em resposta ao tratamento apap. Verificamos que o fluxo de mídia não afeta significativamente a absorção de APAP, enquanto melhora significativamente a funcionalidade equivalente hepática. A absorção intestinal humana apap e o metabolismo hepático poderiam ser emulados no MPS. A associação entre os dados do MPS e na modelagem de sílico tem grande potencial para melhorar a previsibilidade dos métodos in vitro e proporcionar melhor precisão do que os modelos animais em estudos farmacocinéticos e toxicológicos.

Para realizar os testes PK APAP no MPS de 2-OC, o primeiro passo é fabricar o intestino humano e equivalentes hepáticos (organoides). Eles são integrados ao dispositivo microfluido 2-OC(Figura 1A) 24 h antes do início do ensaio PK APAP. No dia seguinte, o meio é alterado, e o modelo é exposto ao APAP. A Figura 1 ilustra os equivalentes do intestino e fígado colocados dentro do dispositivo 2-OC(Figura 1B) e do curso de tempo d...

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An Intestine/Liver Microphysiological System for Drug Pharmacokinetic and Toxicological Assessment

Expusemos um sistema microfisiológico (MPS) com organoides intestinais e hepáticos ao acetaminofeno (APAP). Este artigo descreve os métodos de produção organoide e avaliações de propriedade farmacocinética e toxicológica apap no MPS. Também descreve as análises de funcionalidade tecidual necessárias para validar os resultados.

Um sistema microfisiológico intestinal/hepático para avaliação farmacocinética e toxicológica de drogas

The recently introduced microphysiological systems (MPS) cultivating human organoids are expected to perform better than animals in the preclinical tests ...

Sistemas microfisiológicos têm a capacidade de emular a resposta farmacocinética e toxicológica do corpo humano a tratamentos específicos de interesses. Sistemas microfisiológicos têm o potencial de substituir testes em animais, pois seu uso pode melhorar o poder preditivo dos métodos in vitro e reduzir o custo e o tempo de estudos farmacocinéticos e toxicológicos. 24 horas antes da administração da substância de teste, divida uma alíquota de 800 microliteres de médio William ES entre os compartimentos maiores e menores do chip de dois órgãos, e aspire o meio basolateral e apical de cada barreira intestinal equivalente nas 24 placas de poço preparadas.Usando fórceps estéreis, integre uma inserção por dois circuitos de chip de órgão no compartimento maior e adicione 200 microliters de DMEMS ao lado apical. Usando pontas largas de furo, integre 20 equivalentes hepáticos por circuito no compartimento menor do chip de dois órgãos e conecte o sistema à unidade de controle. Em seguida, conecte a unidade de controle a uma fonte de ar pressurizada e coloque a pressão em aproximadamente mais ou menos 300 barras e uma frequência de bombeamento de 0,3 Hertz.No dia seguinte, diluir a solução de acetaminofeno de estoque para uma concentração de 12 micromolares. Para substituir o meio no sistema, aspire a mídia basolateral e apical a partir da barreira intestinal equivalente no chip de dois órgãos e adicione 500 microliters de meio de cultura fresco apropriado no grande compartimento no lado organoide basolateral e 300 microlitres ao pequeno compartimento. Após verificar bolhas, emule a administração oral com a adição de 200 microliters de uma solução de acetaminofeno de 12 micromolares no lado apical da cultura intestinal e conecte o sistema microfisiológico à unidade de controle.Colete o volume total tanto dos lados apical e basolateral intestinal, quanto do pequeno compartimento em triplicado nos pontos de tempo indicados. Quando todas as amostras tiverem sido coletadas, defina todos os parâmetros relevantes para a análise do HPLC conforme indicado na tabela e filtre a fase móvel através de um filtro de membrana de 0,4 míccros sob vácuo. Em seguida, filtre as amostras através de um filtro de seringa PVDF tamanho 0,22 mícrons e armazene as amostras em um frasco antes de iniciar a medição UV hplc.Para avaliar a viabilidade organoide, transfira todos os 20 esferoides de cada um se replicar para poços individuais de uma placa de poço 96 e transfira as inserções da cultura celular para poços individuais de uma placa de 24 poços. Lave os equivalentes teciduais três vezes com DPBS frescos por lavagem e adicione 300 microliters de uma solução de um mililitro MTT a cada poço experimental. Após uma incubação de três horas na incubadora de cultura celular, substitua a solução MTT por 200 microlitrais de isopropanol por poço para uma incubação noturna a quatro graus Celsius para extrair o formazan MTT do intestino e equivalentes hepáticos.Na manhã seguinte, transfira 200 microlitadores de cada supernante para o poço apropriado na placa de poço 96 e leia o formazan em um leitor de placas a 570 nanômetros para permitir o cálculo da capacidade relativa das células de reduzir o MTT usando a densidade óptica média de cada ponto de tempo em comparação com o controle negativo. Para análise citoquímica e histológica das amostras, primeiro fixe o intestino e os equivalentes hepáticos em 4% de paraformaldeído em 0,1 PBS molar por 25 minutos à temperatura ambiente. No final da incubação, lave os organoides cinco vezes em PBS por 10 minutos por lavagem, antes de coloricar os equivalentes intestinais e hepáticos com tetrametilodamina isotocianato phalloidin Alexa Fluor 647 por uma hora à temperatura ambiente.No final da incubação, transfira as amostras para o meio de congelamento por alguns minutos antes de encaixe congelar os tecidos em nitrogênio líquido. Em seguida, use um criostat para adquirir crio-seções de crioide spheroid de fígado de 10 a 12 mícrons de espessura e montar as seções teciduais em meio de montagem com DAPI para imagem por microscopia de fluorescência de confocal. Para coloração mitocondrial e nuclear, cubra completamente as amostras com solução de coloração mitocondrial para uma incubação de 15 a 45 minutos a 37 graus Celsius em uma atmosfera umidificada com 5% de dióxido de carbono.Ao final da incubação, substitua cuidadosamente a solução de coloração por 2 a 4% de paraformaldeído em PBS por 15 minutos em temperatura ambiente. Após a fixação, enxágue suavemente as células duas vezes com PBS fresco por cinco minutos por lavagem antes de rotular as amostras com solução de trabalho de coloração de ácido nucleico por 10 minutos à temperatura ambiente. Ao final da incubação, lave as amostras com três, cinco minutos de lavagem em PBS protegidas da luz, e use a mancha de ácido nucleico para facilitar a quantificação do número de células expressas de manchas mitocondriais em um microscópio fluorescente com os conjuntos de filtros apropriados.Integrar a barreira intestinal humana e um equivalente hepático em um dispositivo microfluido de dois chips de órgão permite a avaliação das propriedades farmacocinéticas e toxicológicas dos tratamentos de interesse. Após o tratamento, as amostras de mídia podem ser analisadas pelo HPLC. Os organoides podem ser analisados por sua expressão genética, valores de resistência elétrica trans-epitelial e expressão e atividade proteica, bem como por suas características morfológicas.A análise de MTT pode ser realizada para avaliar a viabilidade organoide, bem como para detectar eventos tóxicos muito precoces em resposta ao tratamento de acetaminofeno. O fluxo de mídia não afeta significativamente a absorção de acetaminofeno, enquanto melhora significativamente a funcionalidade equivalente hepática, indicando que a absorção de acetaminofeno intestinal humano e o metabolismo hepático podem ser emulados neste sistema microfisiológico. Sistemas microfisiológicos têm o potencial de substituir modelos animais no desenvolvimento e descoberta de medicamentos, pois imitam melhor a fisiologia humana e podem ser usados para promover o desenvolvimento de medicamentos em maior velocidade e menor custo para o risco e complexidade.

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