Name: an intestine/liver microphysiological system for drug pharmacokinetic and toxicological assessment
Uploaded: 2020-12-03T12:30:00
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Agradecemos al Dr. Christie Guguen-Guillouzo, al Dr. Philippe Gripon en la Unidad 522 INSERM y al Dr. Christian Trepo en la Unidad 271 INSERM por el uso del Material Biológico (células Hepa RG) y por ponernos a nuestra disposición con el fin de realizar la investigación académica.

1. Producción de equivalentes de tejido para el cultivo en el 2-OC
<ol><li>Producción equivalente a barrera del intestino delgado<ol>
<li>Mantener las células de Caco-2 y HT-29 utilizando el medio equivalente intestinal: DMEM suplementado con 10% de FBS, 1% de penicilina y estreptomicina, y 1% de aminoácidos no esenciales, que se nombra como "DMEM S" en este manuscrito.</li>
		<li>Retire el medio, lave dos veces con 1 DPBS y agregue 8 ml de 0,25% de trippsina/EDTA para disociar las células de Caco-2 cultivadas en ...

<ol>
	<li>Zhang, D., Luo, G., Ding, X., Lu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+experimental+models+of+drug+metabolism+and+disposition+in+drug+discovery+and+development.">Preclinical experimental models of drug metabolism and disposition in drug discovery and development.</a> Acta Pharmaceutica Sinica B. 2 (6), 549-561 (2012).</li><li>Hynds, R. E., Giangreco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relevance+of+human+stem+cell-derived+organoid+models+for+epithelial+translational+medicine.">The relevance of human stem cell-derived organoid models for epithelial translational medicine.</a> Stem Cells. 31 (3), 417-422 (2013).</li><li>Sivaraman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Microscale+In+vitro+Physiological+Model+of+the+Liver:+Predictive+Screens+for+Drug+Metabolism+and+Enzyme+Induction.">A Microscale In vitro Physiological Model of the Liver: Predictive Screens for Drug Metabolism and Enzyme Induction.</a> Current Drug Metabolism. 6 (6), 569-591 (2005).</li><li>Dehne, E. M., Hasenberg, T., Marx, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ascendance+of+microphysiological+systems+to+solve+the+drug+testing+dilemma.">The ascendance of microphysiological systems to solve the drug testing dilemma.</a> Future Science OA. 3 (2), 185 (2017).</li><li>Oleaga, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Organ+toxicity+demonstration+in+a+functional+human+in+vitro+system+composed+of+four+organs.">Multi-Organ toxicity demonstration in a functional human in vitro system composed of four organs.</a> Scientific Reports. 6, 20030 (2016).</li><li>Maschmeyer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+four-organ-chip+for+interconnected+long-term+co-culture+of+human+intestine,+liver,+skin+and+kidney+equivalents.">A four-organ-chip for interconnected long-term co-culture of human intestine, liver, skin and kidney equivalents.</a> Lab Chip. 15 (12), 2688-2699 (2015).</li><li>Esch, M. B., Mahler, G. J., Stokol, T., Shuler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Body-on-a-chip+simulation+with+gastrointestinal+tract+and+liver+tissues+suggests+that+ingested+nanoparticles+have+the+potential+to+cause+liver+injury.">Body-on-a-chip simulation with gastrointestinal tract and liver tissues suggests that ingested nanoparticles have the potential to cause liver injury.</a> Lab Chip. 14 (16), 3081-3092 (2014).</li><li>Materne, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Multi-organ+Chip+-+A+Microfluidic+Platform+for+Long-term+Multi-tissue+Coculture.">The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture.</a> Journal of Visualized Experiments. , e52526 (2015).</li><li>Esch, M. B., Ueno, H., Applegate, D. R., Shuler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular,+pumpless+body-on-a-chip+platform+for+the+co-culture+of+GI+tract+epithelium+and+3D+primary+liver+tissue.">Modular, pumpless body-on-a-chip platform for the co-culture of GI tract epithelium and 3D primary liver tissue.</a> Lab Chip. 16 (14), 2719-2729 (2016).</li><li>Sung, J. H., Kam, C., Shuler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+device+for+a+pharmacokinetic&#8211;pharmacodynamic+(PK-PD)+model+on+a+chip.">A microfluidic device for a pharmacokinetic&#8211;pharmacodynamic (PK-PD) model on a chip.</a> Lab on a Chip. 10 (4), 446-455 (2010).</li><li>Viravaidya, K., Sin, A., Shuler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Microscale+Cell+Culture+Analog+to+Probe+Naphthalene+Toxicity.">Development of a Microscale Cell Culture Analog to Probe Naphthalene Toxicity.</a> Biotechnology Progress. 20 (1), 316-323 (2004).</li><li>Sin, A., Chin, K. C., Jamil, M. F., Kostov, Y., Rao, G., Shuler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Design+and+Fabrication+of+Three-Chamber+Microscale+Cell+Culture+Analog+Devices+with+Integrated+Dissolved+Oxygen+Sensors.">The Design and Fabrication of Three-Chamber Microscale Cell Culture Analog Devices with Integrated Dissolved Oxygen Sensors.</a> Biotechnology Progress. 20 (1), 338-345 (2004).</li><li>Tsamandouras, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+Gut+and+Liver+Microphysiological+Systems+for+Quantitative+In+vitro+Pharmacokinetic+Studies.">Integrated Gut and Liver Microphysiological Systems for Quantitative In vitro Pharmacokinetic Studies.</a> The AAPS Journal. 19 (5), 1499-1512 (2017).</li><li>Graham, G. G., Davies, M. J., Day, R. O., Mohamudally, A., Scott, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+modern+pharmacology+of+paracetamol:+Therapeutic+actions,+mechanism+of+action,+metabolism,+toxicity+and+recent+pharmacological+findings.">The modern pharmacology of paracetamol: Therapeutic actions, mechanism of action, metabolism, toxicity and recent pharmacological findings.</a> Inflammopharmacology. 21 (3), 201-232 (2013).</li><li>Hodgman, M. J., Garrard, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Review+of+Acetaminophen+Poisoning.">A Review of Acetaminophen Poisoning.</a> Critical Care Clinics. 28 (4), 499-516 (2012).</li><li>Maschmeyer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chip-based+human+liver-intestine+and+liver-skin+co-cultures+-+A+first+step+toward+systemic+repeated+dose+substance+testing+in+vitro.">Chip-based human liver-intestine and liver-skin co-cultures - A first step toward systemic repeated dose substance testing in vitro.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 95, 77-87 (2015).</li><li>Bessems, J. G. M., Vermeulen, N. P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracetamol+(acetaminophen)-induced+toxicity:+Molecular+and+biochemical+mechanisms,+analogues+and+protective+approaches.">Paracetamol (acetaminophen)-induced toxicity: Molecular and biochemical mechanisms, analogues and protective approaches.</a> Critical Reviews in Toxicology. 31 (1), 55-138 (2001).</li><li>Hirt, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+afterload+induces+pathological+cardiac+hypertrophy:+A+new+in+vitro+model.">Increased afterload induces pathological cardiac hypertrophy: A new in vitro model.</a> Basic Research in Cardiology. 107 (6), 307 (2012).</li><li>Fink, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+stretch+of+engineered+heart+tissue+induces+hypertrophy+and+functional+improvement.">Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement.</a> The FASEB journal official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 14 (5), 669-679 (2000).</li><li>Zhang, B., Peticone, C., Murthy, S. K., Radisic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+standalone+perfusion+platform+for+drug+testing+and+target+validation+in+micro-vessel+networks.">A standalone perfusion platform for drug testing and target validation in micro-vessel networks.</a> Biomicrofluidics. 7 (4), 044125 (2013).</li><li>Ara&#250;jo, F., Sarmento, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+the+characterization+of+an+in+vitro+triple+co-culture+intestine+cell+model+for+permeability+studies.">Towards the characterization of an in vitro triple co-culture intestine cell model for permeability studies.</a> International Journal of Pharmaceutics. 458 (1), 128-134 (2013).</li><li>Cadena-Herrera, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+three+viable-cell+counting+methods:+Manual,+semi-automated,+and+automated.">Validation of three viable-cell counting methods: Manual, semi-automated, and automated.</a> Biotechnology Reports. 7, 9-16 (2015).</li><li>Gripon, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+a+human+hepatoma+cell+line+by+hepatitis+B+virus.">Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (24), 15655-15660 (2002).</li><li>Guillouzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+hepatoma+HepaRG+cells:+A+highly+differentiated+model+for+studies+of+liver+metabolism+and+toxicity+of+xenobiotics.">The human hepatoma HepaRG cells: A highly differentiated model for studies of liver metabolism and toxicity of xenobiotics.</a> Chemico-Biological Interactions. 168 (1), 66-73 (2007).</li><li>Wagner, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dynamic+multi-organ-chip+for+long-term+cultivation+and+substance+testing+proven+by+3D+human+liver+and+skin+tissue+co-culture.">A dynamic multi-organ-chip for long-term cultivation and substance testing proven by 3D human liver and skin tissue co-culture.</a> Lab on a Chip. 13 (18), 3538-3547 (2013).</li><li>Forrest, J. A. H., Clements, J. A., Prescott, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Pharmacokinetics+of+Paracetamol.">Clinical Pharmacokinetics of Paracetamol.</a> Clinical Pharmacokinetics. 7 (2), 93-107 (1982).</li><li>Dollery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Therapeutic Drugs. , (1999).</li><li>Shah, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioanalytical+method+validation-a+revisit+with+a+decade+of+progress.">Bioanalytical method validation-a revisit with a decade of progress.</a> Pharmaceutical research. 17 (12), 1551-1557 (2000).</li><li>Marin, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shp2+negatively+regulates+growth+in+cardiomyocytes+by+controlling+focal+adhesion+kinase/src+and+mTOR+pathways.">Shp2 negatively regulates growth in cardiomyocytes by controlling focal adhesion kinase/src and mTOR pathways.</a> Circulation Research. 103 (8), 813-824 (2008).</li><li>Linkert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metadata+matters:+Access+to+image+data+in+the+real+world.">Metadata matters: Access to image data in the real world.</a> Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OECD+TG+491+-+Short+Time+Exposure+In+vitro+Test+Method+for+Identifying+i)+Chemicals+Inducing+Serious+Eye+Damage+and+ii)+Chemicals+Not+Requiring+Classification+for+Eye+Irritation+or+Serious+Eye+Damage.">OECD TG 491 - Short Time Exposure In vitro Test Method for Identifying i) Chemicals Inducing Serious Eye Damage and ii) Chemicals Not Requiring Classification for Eye Irritation or Serious Eye Damage.</a> OECD. 14, (2018).</li><li>Fernandes, M. B., Gon&#231;alves, J. E., Tavares, L. C., Storpirtis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caco-2+cells+permeability+evaluation+of+nifuroxazide+derivatives+with+potential+activity+against+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+(MRSA).">Caco-2 cells permeability evaluation of nifuroxazide derivatives with potential activity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA).</a> Drug Development and Industrial Pharmacy. 41 (7), 1066-1072 (2015).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OECD+TG+492+-+Reconstructed+human+Cornea-like+Epithelium+(RhCE)+test+method+for+identifying+chemicals+not+requiring+classification+and+labelling+for+eye+irritation+or+serious+eye+damage.">OECD TG 492 - Reconstructed human Cornea-like Epithelium (RhCE) test method for identifying chemicals not requiring classification and labelling for eye irritation or serious eye damage.</a> OECD. 35, (2018).</li><li>OECD, O. E. C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OECD+TG+431+-+In+vitro+skin+corrosion:+reconstructed+human+epidermis+(RHE)+test+method.">OECD TG 431 - In vitro skin corrosion: reconstructed human epidermis (RHE) test method.</a> OECD. 8, (2016).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OECD+TG+439+-+In+vitro+Skin+Irritation:+Reconstructed+Human+Epidermis+Test+Method.">OECD TG 439 - In vitro Skin Irritation: Reconstructed Human Epidermis Test Method.</a> OECD. 21, (2015).</li><li>Marin, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetaminophen+absorption+and+metabolism+in+an+intestine/liver+microphysiological+system.">Acetaminophen absorption and metabolism in an intestine/liver microphysiological system.</a> Chemico-Biological Interactions. 299, 59-76 (2019).</li><li>Maass, C., Stokes, C. L., Griffith, L. G., Cirit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-functional+scaling+methodology+for+translational+pharmacokinetic+and+pharmacodynamic+applications+using+integrated+microphysiological+systems+(MPS).">Multi-functional scaling methodology for translational pharmacokinetic and pharmacodynamic applications using integrated microphysiological systems (MPS).</a> Integrative Biology (United Kingdom). 9 (4), 290-302 (2017).</li><li>Sung, J. H., Wang, Y., Shuler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+using+mathematical+modeling+approaches+to+design+and+interpret+multi-organ+microphysiological+systems+(MPS).">Strategies for using mathematical modeling approaches to design and interpret multi-organ microphysiological systems (MPS).</a> APL Bioengineering. 3 (2), 021501 (2019).</li></ol>

La evaluación precisa y fiable de las propiedades farmacológicas de los nuevos fármacos de investigación es fundamental para reducir el riesgo en los siguientes pasos de desarrollo. El MPS es una tecnología relativamente nueva, que tiene como objetivo mejorar el poder predictivo y reducir los costos y el tiempo invertido con las pruebas preclínicas. Nuestro grupo está avanzando en la evaluación de las propiedades farmacocinéticas y toxicológicas que se necesitan principalmente para la optimización del plomo. T...

Debido a las diferencias genómicas y proteómicas, los modelos animales tienen un valor predictivo limitado para varios resultados humanos. Además, son lentos, caros y éticamente cuestionables1. MPS es una tecnología relativamente nueva que tiene como objetivo mejorar el poder predictivo y reducir los costos y el tiempo invertido con las pruebas preclínicas. Son dispositivos microfluídicos que cultivan organoides (unidades funcionales de órganos miméticos artificiales) bajo un flujo de medios que promueve la comunicación organoide-organoides. Los organoides hechos de células humanas aumentan larelevanciatraslacional 2,3,4. Se espera que el MPS funcione mejor que las pruebas en animales porque son genéticamente humanos y recapitulan la interacción entre los tejidos. Cuando es completamente funcional, el MPS proporcionará resultados más significativos, a mayor velocidad y menores costos y riesgos4. Muchos grupos están desarrollando MPS para varios propósitos, especialmente modelos de enfermedades para probar la eficacia de los medicamentos.
El nivel de exposición es uno de los parámetros más críticos para evaluar la eficacia y toxicidad de los medicamentos5,6,7,8,9,10,11,12. MPS permite la integración organoidea que emula la exposición sistémica y se espera que funcione mejor que el cultivo tradicional de tejido humano 2D. Esta tecnología puede mejorar significativamente la predicción de la absorción intestinal compuesta y el metabolismo hepático4.
Un MPS que integra el modelo humano equivalente del intestino y el hígado es un buen punto de partida, teniendo en cuenta el papel central de estos dos órganos en la biodisponibilidad de fármacos y la exposición sistémica13,14,15. APAP es un fármaco atractivo para el estudio de un MPS sin un equivalente renal porque su metabolización se realiza principalmente por el hígado16,17.
El 2-OC es un dispositivo microfluídico de dos cámaras adecuado para el cultivo de dos tejidos/organoides equivalentes humanos diferentes interconectados por microcanales16. Con el fin de emular una administración oral/intravenosa humana in vitro de un medicamento y evaluar los efectos de la conversación cruzada entre los equivalentes del intestino y del hígado en la farmacocinética APAP, además de la funcionalidad y viabilidad de los organoides, se realizaron tres conjuntos MPS diferentes: (1) un "Empentí 2-OC MPS" compuesto por un equivalente intestinal basado en un inserto de cultivo que contiene una cocultura de células Caco-2 + HT-29, integrada en el dispositivo 2-OC; (2) un "Liver 2-OC MPS" compuesto por esferoides hepáticos hechos de HepaRG + HHSteC (Células Estelares Hepáticas Humanas) integrados en el dispositivo 2-OC; y (3) un "Empo del Hígado 2-OC MPS" compuesto por el equivalente del intestino en un compartimiento del dispositivo que se comunica con el equivalente hepático en el otro por el flujo de medios a través de los canales microfluídicos.
Todos los ensayos se realizaron en condiciones estáticas (sin flujo) y dinámicas (con flujo) debido al impacto de los estímulos mecánicos (compresión, estiramiento y cizallamiento) en la viabilidad y funcionalidades de la célula18,19,20. El presente artículo describe el protocolo para la emulación de administración oral/intravenosa APAP y los respectivos análisis de absorción/metabolismo y toxicológicos en el MPS 2-OC que contiene modelos equivalentes de intestino humano y hígado.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x DPBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190235</td>
			<td>No calcium, no magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-OC</td>
			<td>TissUse GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Two-organ chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well Spheroid Microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3830</td>
			<td>Black/Clear, Round Bottom, Ultra-Low Attachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Use to fix cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetaminophen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7085</td>
			<td>Use to MPS assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Tedia</td>
			<td></td>
			<td>Used to perform HPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>confocal experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Used to perform HPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caco-2 cells</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>86010202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cacodylate buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12800017</td>
			<td>Add supplements: 10% fetal bovine serum, 100 units per mL penicillin, 100 &#181;g/mL streptomycin, and 1% non-essential amino acids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4540</td>
			<td>Add 2% to HepaRG media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Synth</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12657029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing medium OCT</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td></td>
			<td>Tissue-Tek&#174; O.C.T.&#8482; Compound is a formulation of watersoluble glycols and resins, providing a convenient specimen matrix for cryostat sectioning at temperatures of -10&#176;C and below.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin &#38; Eosin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepaRG cells</td>
			<td>Biopredic International</td>
			<td>HPR101</td>
			<td>Undifferentiated cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HHSTeC</td>
			<td>ScienCell Research Laboratories</td>
			<td>5300</td>
			<td>Cells and all culture supplements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>HCA experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT-29 cells</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>85061109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Insulin</td>
			<td>Invitrogen - Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12585014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H0888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>278475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Karnovsky&#8217;s fixative</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2916801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna C18 guard column SS</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td></td>
			<td>Used to perform HPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell 0.4 &#181;m pore size inserts</td>
			<td>Merck</td>
			<td>PIHP01250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell ERS-2 meter</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MERS00002</td>
			<td>Used to TEER measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker Deep Red</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>HCA experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>M6494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MX3000P system</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Counting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operetta High Content Imaging System</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td>Used to perform HCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P450-Glo CYP3A4 Assay with Luciferin-IPA</td>
			<td>Promega</td>
			<td>Cat.# V9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15070063</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF Syringe filter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.22 &#956;m pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reversed-phase Luna C18 column</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td></td>
			<td>Used to perform HPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker (IKA VXR Basic Vibrax)</td>
			<td>IKA Works GmbH &#38; Co</td>
			<td>2819000</td>
			<td>Used for spheroids to improve MTT assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stellate Cell Media (STeC CM)</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>5301</td>
			<td>Add STeC CM supplements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScriptIITM Reverse Transcriptase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green PCR Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRizol TM reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Trizol is a monophasic solution of phenol and guanidine isothiocyanate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R001100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low-attachment plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3471-24EA</td>
			<td>6 wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield plus DAPI mounting media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Opaque 96-well Microplate</td>
			<td>PerkinHelmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide-bore tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Williams E</td>
			<td>Pan Biotech</td>
			<td>P04-29510</td>
			<td>Add supplements: 10% fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine, 100 units per ml penicillin, 100 &#181;g/mL streptomycin and 5 &#181;g/mL human insulin</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an intestine/liver microphysiological system for drug pharmacokinetic and toxicological assessment

Se espera que los sistemas microfisiológicos (MPS) que cultivan organoides humanos recientemente introducidos funcionen mejor que los animales en la fase de pruebas preclínicas del proceso de desarrollo de fármacos porque son genéticamente humanos y recapitulan la interacción entre los tejidos. En este estudio, la barrera intestinal humana (emulada por un co-cultivo de células Caco-2 y HT-29) y el equivalente hepático (emulado por esferoides hechos de células HepaRG diferenciadas y células estelares hepáticas humanas) se integraron en un dispositivo microfluídico chip de dos órganos (2-OC) para evaluar algunas propiedades farmacocinéticas (PK) y toxicológicas de paracetamol (APAP). El MPS tenía tres conjuntos: Intestina sólo 2-OC, Hígado sólo 2-OC, e Intestino/Hígado 2-OC con el mismo medio perfundiendo ambos organoides. Para las evaluaciones PK, dosificamos el APAP en los medios en los puntos de tiempo preestablecidos después de administrarlo ya sea sobre la barrera intestinal (emulando la vía oral) o en el medio (emulando la vía intravenosa), a 12 m y 2 M respectivamente. Las muestras de medios se analizaron mediante cromatografía líquida de alta presión (HPLC) en fase inversa. Los organoides se analizaron para la expresión génica, para los valores TEER, para la expresión y la actividad de las proteínas, y luego se recogieron, fijaron y sometieron a un conjunto de evaluaciones morfológicas. La técnica de MTT tuvo un buen desempeño en la evaluación de la viabilidad organoides, pero los análisis de alto contenido (HCA) fueron capaces de detectar eventos tóxicos muy tempranos en respuesta al tratamiento APAP. Verificamos que el flujo de medios no afecta significativamente la absorción APAP mientras que mejora significativamente la funcionalidad equivalente del hígado. La absorción intestinal humana APAP y el metabolismo hepático podrían emularse en el MPS. La asociación entre los datos MPS y el modelado en silicio tiene un gran potencial para mejorar la previsibilidad de los métodos in vitro y proporcionar una mayor precisión que los modelos animales en estudios farmacocinéticos y toxicológicos.

Para realizar las pruebas PK APAP en el MPS 2-OC, el primer paso es fabricar el intestino humano y equivalentes hepáticos (organoides). Se integran en el dispositivo microfluídico 2-OC (Figura 1A) 24 h antes de iniciar el ensayo PK APAP. Al día siguiente, el medio se cambia, y el modelo se expone a APAP. La Figura 1 ilustra los equivalentes del intestino y del hígado colocados dentro del dispositivo 2-OC (Figura 1B) y el curso d...

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An Intestine/Liver Microphysiological System for Drug Pharmacokinetic and Toxicological Assessment

Hemos expuesto un sistema microfisiológico (MPS) con organoides intestinales y hepáticos al paracetamol (APAP). Este artículo describe los métodos para la producción de organoides y las evaluaciones de propiedades farmacocinéticas y toxicológicas APAP en el MPS. También describe los análisis de funcionalidad tisular necesarios para validar los resultados.

Un sistema microfisiológico intestinal/hepático para la evaluación farmacocinética y toxicológica de fármacos

The recently introduced microphysiological systems (MPS) cultivating human organoids are expected to perform better than animals in the preclinical tests ...

Los sistemas microfisiológicos tienen la capacidad de emular la farmacocinética y la respuesta toxicológica del cuerpo humano a tratamientos específicos de intereses. Los sistemas microfisiológicos tienen el potencial de reemplazar las pruebas en animales, ya que su uso puede mejorar el poder predictivo de los métodos in vitro y reducir el costo y el tiempo de los estudios farmacocinéticos y toxicológicos. 24 horas antes de la administración de la sustancia de ensayo, dividió una alícuota de 800 microlitros del medio William ES entre los compartimentos más grandes y más pequeños del chip de dos órganos, y aspirar el medio basolateral y apical de cada equivalente de barrera intestinal en las placas de 24 pozos preparadas.Usando fórceps estériles, integre un circuito de chip de un inserto por dos órganos en el compartimiento más grande y agregue 200 microlitros de DMEMS al lado apical. Usando puntas de diámetro ancho, integre 20 equivalentes hepáticos por circuito en el compartimiento más pequeño de la viruta de dos órganos y conecte el sistema a la unidad de control. A continuación, conecte la unidad de control a un suministro de aire presurizado y ajuste la presión a aproximadamente más o menos 300 barras y una frecuencia de bombeo de 0,3 hercios.Al día siguiente diluir la solución de paracetamol a una concentración de 12 micromolares. Para reemplazar el medio en el sistema, aspirar el medio basolateral y apical del equivalente de barrera intestinal en el chip de dos órganos y añadir 500 microlitros de medio de cultivo fresco apropiado en el compartimento grande en el lado basolateral organoid y 300 microlitros al pequeño compartimiento. Después de comprobar si hay burbujas, emular la administración oral con la adición de 200 microlitros de una solución de paracetamol de 12 micromolares en el lado apical del cultivo intestinal inserta y conectar el sistema microfisiológico a la unidad de control.Recoger el volumen total de los lados apical y basolateral intestinal, así como del pequeño compartimento en triplicado en los puntos de tiempo indicados. Una vez recogidas todas las muestras, establezca todos los parámetros pertinentes para el análisis de HPLC como se indica en la tabla y filtre la fase móvil a través de un filtro de membrana de 0,4 micras al vacío. A continuación, filtre las muestras a través de un filtro de jeringa PVDF de 0,22 micras de tamaño de poro y guárdelos en un vial antes de iniciar la medición UV de HPLC.Para evaluar la viabilidad organoides, transfiera los 20 esferoides de cada uno se replican a pozos individuales de una placa de 96 pozos y transfiera los insertos de cultivo celular a pozos individuales de una placa de 24 pozos. Lave los equivalentes de tejido tres veces con DPBS fresco por lavado y agregue 300 microlitros de una solución de MTT de un miligramo por mililitro a cada pozo experimental. Después de una incubación de tres horas en la incubadora de cultivo celular, reemplace la solución de MTT con 200 microlitros de isopropanol por pozo para una incubación nocturna a cuatro grados centígrados para extraer el formazan MTT del intestino y equivalentes hepáticos.A la mañana siguiente, transfiera 200 microlitros de cada sobrenadante al pozo apropiado en la placa de 96 pozos y lea el formazan en un lector de placas a 570 nanómetros para permitir el cálculo de la capacidad relativa de las células para reducir el MTT utilizando la densidad óptica media de cada punto de tiempo en comparación con el control negativo. Para el análisis citoquímico e histológico de las muestras, primero fije los equivalentes del intestino y del hígado en 4%paraformaldehído en 0,1 PBS molar durante 25 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, lave los organoides cinco veces en PBS durante 10 minutos por lavado, antes de manchar los equivalentes intestinales e hepáticos con tetrametilrhodamine isothiocyanate phalloidin Alexa Fluor 647 phalloidin durante una hora a temperatura ambiente.Al final de la incubación, transfiera las muestras al medio de congelación durante unos minutos antes de congelar los tejidos en nitrógeno líquido. A continuación, utilice un criostato para adquirir criosecciones de esferoide hepático de 10 a 12 micras de espesor y monte las secciones de tejido en medio de montaje con DAPI para imágenes mediante microscopía de fluorescencia confocal. Para la tinción mitocondrial y nuclear, cubra completamente las muestras con solución de tinción mitocondrial para una incubación de 15 a 45 minutos a 37 grados celsius en una atmósfera humidificada con 5% de dióxido de carbono.Al final de la incubación, reemplace cuidadosamente la solución de tinción con 2 a 4%paraformaldehído en PBS durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de la fijación, enjuague suavemente las células dos veces con PBS fresco durante cinco minutos por lavado antes de etiquetar las muestras con solución de trabajo de tinción de ácido nucleico durante 10 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, lave las muestras con lavados de tres, cinco minutos en PBS protegidos de la luz, y utilice la mancha de ácido nucleico para facilitar la cuantificación del número de manchas mitocondriales que expresan las células en un microscopio fluorescente con los conjuntos de filtros apropiados.La integración de la barrera intestinal humana y un equivalente hepático en un dispositivo microfluídico con chip de dos órganos permite evaluar las propiedades farmacocinéticas y toxicológicas de los tratamientos de interés. Después del tratamiento, hpLC puede analizar las muestras de medios. Los organoides pueden ser analizados por su expresión génica, valores de resistencia eléctrica transepilativa, y expresión y actividad de proteínas, así como por sus características morfológicas.Se pueden realizar análisis de MTT para evaluar la viabilidad organoides, así como para detectar eventos tóxicos muy tempranos en respuesta al tratamiento con paracetamol. El flujo de medios no afecta significativamente la absorción de paracetamol, mientras que mejora significativamente la funcionalidad equivalente en el hígado, lo que indica que la absorción de paracetamol intestinal humano y el metabolismo hepático se pueden emular en este sistema microfisiológico. Los sistemas microfisiológicos tienen el potencial de reemplazar modelos animales en el desarrollo y descubrimiento de fármacos, ya que imitan mejor la fisiología humana y se pueden utilizar para promover el desarrollo de fármacos a mayor velocidad y menor costo de riesgo y complejidad.

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