Name: generation of heterogeneous drug gradients across cancer populations on a microfluidic evolution accelerator for real-time observation
Uploaded: 2019-09-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Heterogeneous Drug Gradients Across Cancer Populations on a Microfluidic Evolution Accelerator for Real-Time Observation at JoVE.com

وقد تم دعم هذا العمل من قبل NSF PHY-1659940.

1. تصنيع جهاز ميكروفلويديك
<ol><li>توليد نمط microfluidic المطلوب باستخدام برنامج تصميم تخطيط (انظر المواد التكميلية).</li>
	<li>تلفيق قناع الصور. انظر جدول المواد للحصول على مزيد من التفاصيل.<ol>
<li>باستخدام كاتب الليزر، وكتابة نمط على لوحة الزجاج الصودا الجير المغلفة مع 100 نانومتر من C...

<ol>
	<li>Meacham, C. E., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+heterogeneity+and+cancer+cell+plasticity.">Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity.</a> Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).</li><li>Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+microenvironment+and+its+role+in+promoting+tumor+growth.">The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth.</a> Oncogene. 27 (45), 5904-5912 (2008).</li><li>Lambert, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analogy+between+the+evolution+of+drug+resistance+in+bacterial+communities+and+malignant+tissues.">An analogy between the evolution of drug resistance in bacterial communities and malignant tissues.</a> Nature Reviews Cancer. 11 (5), 375-382 (2011).</li><li>Tannock, I. F., Lee, C. M., Tunggal, J. K., Cowan, D. S., Egorin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limited+penetration+of+anticancer+drugs+through+tumor+tissue:+a+potential+cause+of+resistance+of+solid+tumors+to+chemotherapy.">Limited penetration of anticancer drugs through tumor tissue: a potential cause of resistance of solid tumors to chemotherapy.</a> Clinical Cancer Research. 8 (3), 878-884 (2002).</li><li>Grantab, R. H., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Penetration+of+anticancer+drugs+through+tumour+tissue+as+a+function+of+cellular+packing+density+and+interstitial+fluid+pressure+and+its+modification+by+bortezomib.">Penetration of anticancer drugs through tumour tissue as a function of cellular packing density and interstitial fluid pressure and its modification by bortezomib.</a> BMC Cancer. 12, 214 (2012).</li><li>Fu, F., Nowak, M. A., Bonhoeffer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+Heterogeneity+in+Drug+Concentrations+Can+Facilitate+the+Emergence+of+Resistance+to+Cancer+Therapy.">Spatial Heterogeneity in Drug Concentrations Can Facilitate the Emergence of Resistance to Cancer Therapy.</a> PLoS Computational Biology. 11 (3), e1004142 (2015).</li><li>Bogorad, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+microvessel+models.">In vitro microvessel models.</a> Lab on a Chip. 15 (22), 4242-4255 (2015).</li><li>Caballero, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-on-chip+models+of+cancer+metastasis+for+future+personalized+medicine:+From+chip+to+the+patient.">Organ-on-chip models of cancer metastasis for future personalized medicine: From chip to the patient.</a> Biomaterials. 149, 98-115 (2017).</li><li>Caballero, D., Blackburn, S. M., De Pablo, M., Samitier, J., Albertazzi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-vessel-on-a-chip+models+for+drug+delivery.">Tumour-vessel-on-a-chip models for drug delivery.</a> Lab on a Chip. 17 (22), 3760-3771 (2017).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acceleration+of+emergence+of+bacterial+antibiotic+resistance+in+connected+microenvironments.">Acceleration of emergence of bacterial antibiotic resistance in connected microenvironments.</a> Science. 333 (6050), 1764-1767 (2011).</li><li>Wu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ancient+hot+and+cold+genes+and+chemotherapy+resistance+emergence.">Ancient hot and cold genes and chemotherapy resistance emergence.</a> Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10467-10472 (2015).</li><li>Lin, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+and+mesenchymal+prostate+cancer+cell+population+dynamics+on+a+complex+drug+landscape.">Epithelial and mesenchymal prostate cancer cell population dynamics on a complex drug landscape.</a> Convergent Science Physical Oncology. 3 (4), 045001 (2017).</li><li>Lin, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+heterogeneous+environment+and+docetaxel+gradient+in+the+emergence+of+polyploid,+mesenchymal+and+resistant+prostate+cancer+cells.">The role of heterogeneous environment and docetaxel gradient in the emergence of polyploid, mesenchymal and resistant prostate cancer cells.</a> Clinical &amp; Experimental Metastasis. 36 (2), 97-108 (2019).</li><li>Roca, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factors+OVOL1+and+OVOL2+induce+the+mesenchymal+to+epithelial+transition+in+human+cancer.">Transcription factors OVOL1 and OVOL2 induce the mesenchymal to epithelial transition in human cancer.</a> PloS One. 8 (10), e76773 (2013).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Tinevez, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trackmate:+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking.">Trackmate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li><li>Caballero, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-on-chip+models+of+cancer+metastasis+for+future+personalized+medicine:+From+chip+to+the+patient.">Organ-on-chip models of cancer metastasis for future personalized medicine: From chip to the patient.</a> Biomaterials. 149, 98-115 (2017).</li><li>Akhtar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+flaws+and+human+harms+of+animal+experimentation.">The flaws and human harms of animal experimentation.</a> Cambridge Quarterly of Healthcare Ethics. 24 (4), 407-419 (2015).</li><li>Sontheimer-Phelps, A., Hassell, B. A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+cancer+in+microfluidic+human+organs-on-chips.">Modelling cancer in microfluidic human organs-on-chips.</a> Nature Reviews Cancer. 19 (2), 65-81 (2019).</li><li>Bogorad, M. I., DeStefano, J., Karlsson, J., Wong, A. D., Gerecht, S., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+in+vitro+microvessel+models.">Review: in vitro microvessel models.</a> Lab on a Chip. 15, 4242-4255 (2015).</li><li>Za&#241;udo, J. G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+control+of+cellular+decision-making+networks+in+the+epithelial-to-mesenchymal+transition.">Towards control of cellular decision-making networks in the epithelial-to-mesenchymal transition.</a> Physical Biology. 16 (3), 031002 (2019).</li><li>Morris, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+population+solitary+waves+can+defeat+rings+of+funnels.">Bacterial population solitary waves can defeat rings of funnels.</a> New Journal of Physics. 19 (3), 035002 (2017).</li></ol>

وقد وضعت ثقافة الخلايا التقليدية منذ ما يقرب من قرن من الزمان، ولا تزال النموذج ما قبل السريرية الأكثر استخداما في البحوث الطبية الحيوية، على الرغم من قدرتها المحدودة ثبت للتنبؤ النتائج السريرية في السرطان17. النماذج الحيوانية توفر أعلى الأهمية الفسيولوجية والتشابه الوراثي ...

وقد أصبح من المسلم به على نحو متزايد أن السرطان نظام إيكولوجي معقد لا يعتمد فقط على استمرار خلل تنظيم مجموعات الخلايا المتحولة، بل أيضا على التفاعلات الحيوية بين الخلايا السرطانية والبيئة الصغرى المضيفة. وبهذا المعنى، يتطور السرطان على مشهد متكيف يتجلى في مجموعة من العوامل، بما في ذلك البيئة الدقيقة للورم غير المتجانس والتقاطع مع مجموعة متنوعة من الخلايا المضيفة، وكلها تساهم في ضغوط انتقائية لمزيد من الجينات أو التغيرات الجينيّة1،2،3. في سياق الأورام الصلبة، والتوزيع غير المتكافئ للعلاج الكيميائي وغيرها من التدرجات الموارد يساهم في عدم تجانسها الجزيئي، ويمكن أن تلعب دورا في تطوير مقاومة المخدرات، وزيادة تكوين الأوعية الدموية إلى ورم معين التجمعات السكانية الفرعية، وحتى الانبثاث4،5،6. التقليدية في المختبر 2D دراسات زراعة الخلايا، في حين تمتلك واسعة النطاق، والقدرة التجريبية مريحة، ويوفر متوسط الميدان، موحدة، وظروف ثابتة، وغالبا ما تفتقر إلى الرقابة البيئية المكانية والزمنية الدقيقة اللازمة حقا محاكاة في ديناميات الورم في الجسم الحي. وبالتالي، هناك حاجة إلى نماذج أكثر تمثيلا من الجسم الحي من أجل إعادة إنتاج البيئة الدقيقة الورم قبل النماذج الحيوانية في خط أنابيب تطوير المخدرات من أجل التنبؤ بشكل أفضل من تطور السرطان، فضلا عن الاستجابات للأدوية ضمن الإجهاد الديناميكي المناظر الطبيعيه. وقد تم اقتراح Microfluidics لسد الفجوة بين دراسات زراعة الخلايا 2D وأكثر تعقيدا في الدراسات الحيوانية الحية التي قد لا تكون قادرة على دعم الدراسات الكمية التي يمكن السيطرة عليها7،8،9.
يجب أن يمتلك النظام المثالي في المختبر لتوصيف ديناميات الخلايا السرطانية القدرة على توليد بيئة دقيقة غير متجانسة لمحاكاة الاستجابات الخلوية التكيفية التي قد تحدث في الورم، وكذلك السماح بمراقبة هذه الديناميات في دقة خلية واحدة. في هذه المقالة، ونحن نصف منصة ثقافة الخلية microfluidic، جهاز يستند إلى PDMS يسمى "مسرع التطور" (EA)، الذي يسمح للدراسات الموازية في المختبر من ديناميات الخلايا السرطانية في القرار الخلوي مع الحصول على البيانات في الوقت الحقيقي على مدى على مدى أسابيع، مع الحفاظ على التدرجات من الإجهاد في جميع أنحاء المشهد الثقافي. ويستند تصميم هذه المنصة على عملنا السابق، الذي يمكن تسريع الديناميات التطورية للكائنات الحية في ميتاالسكان10،11. وعلى وجه التحديد، في مجموعة من المجموعات السكانية المنفصلة مكانيا التي تتفاعل على مستوى ما، عندما تتعرض لمشهد إجهاد غير متجانس، يمكن للأنواع الأكثر ملاءمة أن تهيمن على السكان المحليين بشكل أسرع مقارنة بسكان موحدين. ثم تهاجر الأنواع المفيدة إلى الموائل الصغرى المجاورة بحثاً عن الموارد والفضاء، وتهيمن في نهاية المطاف على جميع السكان. كما هو مبين في الشكل 1،يتكون نمط رقاقة EA microfluidic من (1) زوج من القنوات السربنتين التي توفر تداول وسائل الإعلام الجديدة وبناء ظروف حدود ثابتة لنشر المواد الكيميائية، و '2' منطقة زراعة الخلايا سداسية الذي يتكون من 109 غرف سداسية مترابطة و 24 غرف نصف سداسية في المركز، تشبه بنية قرص العسل. الرقاقة هي 100 ميكرومتر في العمق. ترتبط القنوات الإعلامية ومنطقة زراعة الخلايا بالشقوق الصغيرة (حوالي 15 ميكرومتر)، والتي تمنع التدفق المباشر لوسائل الإعلام وما ينتج عنذلك من إجهاد القص عبر منطقة زراعة الخلايا، ومع ذلك لا تزال تسمح للمواد الكيميائية بالانتشار من خلال الشقوق الصغيرة وتبادل المواد الغذائية، النفايات الأيضية، الخ. ويبين الشكل 1باءتوليد التدرجات الكيميائية، حيث تحتوي إحدى القنوات الإعلامية على 0.1 مليون متر من الفلورسين بينما تكون القناة الأخرى خالية من الفلورسين. يتم زراعة الخلايا على غشاء نفاذية الغاز، مغلفة من قبل الهياكل الدقيقة من خلال الضغط الخلفي الإيجابي على الغشاء ضد رقاقة. يتم توضيح مكونات حامل الجهاز في الشكل 2،ويتم توضيح الإعداد التجريبي في الشكل 3،حيث يتم الحفاظ على الثقافة على المجهر المقلوب عند 37 درجة مئوية، مع الرطوبة النسبية فوق 85٪، ومكيفة تحت تكوين غاز نورموكسيا.
يوفر هذا النظام مراقبة تفصيلية للتفاعلات الخلوية المترجمة عبر قنوات برايتفيلد والفلورسنت ويسمح باختبارات المصب التي تم حلها مكانياً مثل الفلورة المناعية أو البقعة الغربية أو قياس الطيف الكتلي. لقد أثبتنا سابقا كدليل على المبدأ من هذا النموذج سرطان microfluidic على رقاقة على الثقافة المشتركة على المدى الطويل من الظهارية وmesenchymal PC3 خلايا سرطان البروستاتا12، فضلا عن ظهور المخدرات المقاومة للعملاق متعدد البلويد الخلايا السرطانية باستخدام خط الخلية PC3 الظهارية13. في حين أننا نقدم تطبيق هذه المنصة لفهم ديناميات spatiotime من PC3 الظهارية وخلايا سرطان البروستاتا mesenchymal تحت تدرج الإجهاد من docetaxel، يمكن تطبيق نظام microfluidic بسهولة على أي مزيج من خطوط الخلايا والموارد (أي المخدرات والمغذيات والأكسجين) التدرجات.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL BD Luer-Lok tip syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>14-823-16E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5955</td>
			<td>1x anti-anti</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 300 MIF</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>18441123163</td>
			<td>Photoresist developer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ1518</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>AZ1518</td>
			<td>Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ4330</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>AZ4330</td>
			<td>Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cr Chromium Etchant</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>651826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Life Technologies Corporation</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heidelberg DWL 66+ laserwriter</td>
			<td>Heidelberg Instruments</td>
			<td>DWL66+</td>
			<td>Writing photomask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethyldisilazane (HMDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>379212</td>
			<td>For photoresist adhesion enhancement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hollow steel pins</td>
			<td>New England Small Tube</td>
			<td>NE-1300-01</td>
			<td>&#160;.025 OD .017 ID x .500 long / type 304 WD fullhard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ibidi Heating System, Multi-Well Plates, K-Frame</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10929</td>
			<td>On-stage incubator&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok 23 G dispensing needle</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>75165A684</td>
			<td>To connect syringes and tubings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lumox dish 35</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>94.6077.331</td>
			<td>Gas-permeable cell culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microposit Remover 1165</td>
			<td>Dow Electronic Materials</td>
			<td>Microposit Remover 1165</td>
			<td>Photoresist stripper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microseal B Adhesive Sealer</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>MSB1001</td>
			<td>Adhesive sealer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-Ring (for Lumox plate sealing)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>9452K114</td>
			<td>Dash No. 27; 1-5/16&#34; ID x 1-7/16&#34; OD; Duro 70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-Ring (for bottom glass window sealing)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>9452K74</td>
			<td>Dash No. 20; 7/8&#34; ID x 1&#34; OD; Duro 70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma-Preen Plasma Cleaning/Etching System</td>
			<td>Plasmatic Systems, Inc</td>
			<td>Plasma-Preen</td>
			<td>Oxygen plasma system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Life Technologies Corporation</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Samco RIE800iPB DRIE</td>
			<td>Samco</td>
			<td>RIE800iPB</td>
			<td>Deep reactive-ion etching system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suss MA6 mask aligner</td>
			<td>SUSS MicroTec</td>
			<td>MA6</td>
			<td>Mask aligner&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone Elastomer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9285739</td>
			<td>PDMS elastomer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TePla M4L plasma etcher</td>
			<td>PVA TePla</td>
			<td>M4L</td>
			<td>Plasma etcher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloro-1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl-silane (PFOTS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>448931</td>
			<td>For silicon wafer silanization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon microbore tube (0.020&#34; x 0.060&#34;OD)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-06419-01</td>
			<td>Tubings for media delivery</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of heterogeneous drug gradients across cancer populations on a microfluidic evolution accelerator for real-time observation

لا تزال ثقافة الخلايا التقليدية النموذج ما قبل السريري الأكثر استخداما، على الرغم من قدرتها المحدودة ثبت للتنبؤ بالنتائج السريرية في السرطان. وقد اقترحت نماذج سرطان ميكروفلويديك على رقاقة لسد الفجوة بين الثقافات التقليدية المفرطة في الأبعاد التقليدية ونماذج الحيوانات أكثر تعقيدا، والتي لديها قدرة محدودة على تحقيق نتائج كمية موثوقة وقابلة للاستنساخ. هنا، نقدم نموذج سرطان ميكروفلويديك على رقاقة التي تستنسخ المكونات الرئيسية للبيئة الدقيقة الورم معقدة بطريقة شاملة، ولكن بسيطة بما فيه الكفاية لتوفير أوصاف كمية قوية لديناميات السرطان. هذا النموذج microfluidic السرطان على رقاقة، "مسرع التطور"، ينهار مجموعة كبيرة من الخلايا السرطانية في مجموعة مترابطة من البيئات الدقيقة الورم في حين توليد المناظر الطبيعية الإجهاد العلاج الكيميائي غير متجانسة. ويمكن رصد تطور السرطان ودينامياته التطورية استجابة لتدرج المخدرات لأسابيع في الوقت الحقيقي، ويمكن إجراء العديد من التجارب النهائية المكملة للصور الفاصلة زمنيا التي التقطت خلال التجارب.

التحقق من نمو الخلايا الأمثل على رقاقة يتمثل أحد الأهداف الرئيسية لمنصة التجربة في إعادة إنتاج المكونات والتفاعلات الرئيسية في بيئة جزئية معقدة للورم بطريقة شاملة، ولكنها بسيطة بما يكفي لتوفير بيانات كمية وموثوقة ويمكن استنساخها. ولا يمكن تحقيق هذا الهدف إل?...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Heterogeneous Drug Gradients Across Cancer Populations on a Microfluidic Evolution Accelerator for Real-Time Observation at JoVE.com

Generation of Heterogeneous Drug Gradients Across Cancer Populations on a Microfluidic Evolution Accelerator for Real-Time Observation

نقدم نموذج السرطان على رقاقة microfluidic، تكنولوجيا "مسرّع التطور"، والتي توفر منصة يمكن التحكم فيها للدراسات الكمية في الوقت الحقيقي على المدى الطويل لديناميات السرطان ضمن ظروف بيئية محددة جيدا في الخلية الواحدة مستوي. ومن المتوقع أن تعمل هذه التكنولوجيا كنموذج في المختبر للبحوث الأساسية أو تطوير الأدوية قبل السريرية.

توليد التدرجات المخدرات غير متجانسة عبر السكان السرطان على مسرّع تطور Microfluidic للمراقبة في الوقت الحقيقي

Conventional cell culture remains the most frequently used preclinical model, despite its proven limited ability to predict clinical results in cancer. ...

هذا microfluidic نموذج على رقاقة السرطان الذي نسميه معجل التطور، ويوفر منصة يمكن السيطرة عليها على المدى الطويل، في الوقت الحقيقي الدراسات الكمية من ديناميات السرطان ضمن الظروف البيئية المحددة جيدا على مستوى خلية واحدة. التكنولوجيا تسمح لنا للتحقيق في ديناميات التطور من السرطان تحت المشهد الإجهاد مثل الورم. توفير المعلومات بما في ذلك مورفولوجيا، والسكان، والحركة، والهجرة مع مرور الوقت على المستوى الخلوي.مع القدرة على السيطرة على ورصد سلوك مجموعات الأورام المختلطة تحت التدرجات الإجهاد تسيطر عليها جيدا قد تقدم التكنولوجيا لدينا نموذج أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية لتطوير المخدرات قبل الظهر. ويمكن أيضاً تنفيذ طريقة تغليف الختم الضغطي المعروضة في نظم أخرى من نظم الميكروفويدية التي تتطلب تعديلًا متطورًا في تركيب الغاز المحيط وكذلك قدرة التجربة في المصب. مفاتيح لتنفيذ تجربة طويلة الأجل بنجاح هو تأمين بيئة مستقرة جسديا وبيوكيميائيا.وينبغي رصد العوامل بما في ذلك درجة الحرارة والرطوبة وتكوين الغاز في جميع الأوقات. للبدء، تلفيق حامل لوحة كافية لعقد أطباق ثقافة الغاز نفاذية في وقت واحد على آلة الطباعة 3D. فك مكونات لوحة عينة ثلاثة مخصصة جيدا مع سائق المسمار.تطهير المكونات عن طريق التعرض للأشعة فوق البنفسجية لمدة ساعة واحدة على الأقل وترك في بيئة معقمة. لبدء زرع خط الخلية إضافة خمسة ملليلتر من التربسين في كل ثقافة الخلية PC3-Epi أو PC3-EMT في طبق ثقافة 10 سنتيمترا وتشغيل التربسينية لمدة خمس دقائق في حاضنة في 37 درجة مئوية. نقل الخلايا من أطباق الثقافة إلى أنابيب 15 ملليلتر الطرد المركزي ثم الطرد المركزي في 150 مرات ز لمدة ثلاث دقائق.تجاهل المُندفع. إعادة تعليق كل من الكريات الخلية في أنابيب أجهزة الطرد المركزي 15 ملليلتر وعد خلايا كل PC3-MP أو PC3-EMT باستخدام جهاز قياس الهيموسيت. عزل إجمالي 2.5 مرات 10 إلى أربعة من كل نوع خلية.اخلط نوعي الخلايا المعزولة ثم أضف في ميليلترين من وسائط الثقافة. بذور مليلترين من ثقافة الخلية في كل من ثلاثة أطباق ثقافة نفاذية الغاز. اترك الغاز قابلًا للنفاذ في الحاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية خلال الليل حتى تعلق الخلايا.تطهير أجهزة PDMS عن طريق التعرض للأشعة فوق البنفسجية لمدة ساعة واحدة على الأقل وترك في بيئة معقمة. الآن قم بإعداد نظام إمدادات الغاز الذي يتكون من وحدات التحكم في ثاني أكسيد الكربون والأكسجين، ومضخة غاز، وغرفة خلط الغاز، ومرطب أو فقاعة، وثلاث مجموعات منفصلة من صمامات الغاز، ومقاييس الضغط. بدلا من ذلك استخدام نظام إمدادات الغاز الذي يوفر شرط normoxia.تأكد من زيادة الرطوبة النسبية في غرفة الخلط إلى أعلى من 85٪ إعداد وحدة التحكم الحراري الحضانة على خشبة المسرح في 37 درجة مئوية مع وحدات التدفئة الفرعية منفصلة للغطاء والصحن السفلي. في اليوم التالي تأخذ بها الغاز نفاذية أطباق الثقافة من الحاضنة وتحديد أن المكونات التفصيلية هي في النظام، كل بئر تمتلك حامل صحن ثقافة نفاذية الغاز، حامل رقاقة PDMS، حامل نافذة زجاجية، وزوج من 35 ملليلتر نوافذ زجاجية واسعة. استخدام مسامير المجهزة لتجميع هذه المكونات ومشابك طبق ثقافة نفاذية الغاز.ثم نقل متوسط الثقافة قبل الدافئة إلى غرفة فراغ إلى إزالة الغاز لمدة 20 دقيقة. علاج رقاقة PDMS في نظام بلازما الأكسجين لمدة 30 ثانية من أجل الحفاظ على الماء. المقبل تحميل اثنين من الحقن ببطء مع 10 ملليلتر من وسائل الإعلام نمو الغاز وغيرها من الحقن مع 10 ملليلتر من كاشف الغاز المطلوب من الفائدة.على سبيل المثال وسائل الإعلام ووسائل الإعلام مع المخدرات. قم بتوصيل كل حقنة فردية إلى أنابيب 50 سنتيمتر بواسطة إبرة صرف 23 مقياسًا في دبوس فولاذي أجوف واحد. أدخل دبوسًا من الصلب المجوف في الطرف الآخر من الأنبوب.دفع وسائل الإعلام في الأنابيب إلى رئيس الأنابيب وإدراج دبوس الصلب في كل رقاقة PDMS من خلال طبقة تغطية. ملء طبقة الخزان والرطب طبقة نمط PDMS مع وسائل الإعلام. طبقة الخزان يعمل على رقاقة فقاعة فخ لمنع فقاعات الهواء من الدخول في نمط microfluidic.ثم تحميل حقنة ملليلتر واحد مع وسائل الإعلام الثقافة. توصيل الحقنة إلى أنابيب خمسة سنتيمترات بواسطة إبرة توزيع قياس 23 في دبوس فولاذي أجوف واحد. إدراج دبوس الصلب جوفاء في الطرف الآخر من الأنابيب ورئيس الأنابيب.أدخل دبوس الصلب المجوف في فتحة الوسط للرقاقة للحصول على وسائط زائدة يتم استخراجها لاحقًا. تحميل اثنين من الحقن 10 ملليلتر لكل رقاقة في سطح السفينة إلى الأمام ووضع الحقن الأخرى اثنين في سطح السفينة الانسحاب من نظام الحقن. من أجل تجنب محاصرة microbubbles في نمط microfluidic، الاستغناء عن ملليلتر واحد من وسائل الإعلام قبل الدافئة وفك الغاز في طبق ثقافة الغاز العميق 35 ملليلتر نفاذية.ضع الرقائق مباشرة فوق أغشية الثقافة القابلة للنفاذ للغاز، حيث تقترب الشريحة من السطح السائل بزاوية إمالة 15 درجة. المشبك رقاقة PDMS مع حامل رقاقة PDMS، ودفع جهاز PDMS إلى أسفل. الشريط ورقة من السدادة على رأس جهاز PDMS ومشابك مع حامل رقاقة PDMS، من أجل منع رقاقة من الجفاف.تعيين معدل تدفق الوسائط حول الصفيف إلى أن تكون 20 ميكرولترات في الساعة. ضع اللوحة بأكملها في حاضنة على خشبة المسرح على خشبة المسرح الآلية من المجهر المقلوب. ربط نظام إمدادات الغاز إلى قنوات الغاز من خلال أنابيب الغاز والحفاظ على ضغط قياس في 0.2 PSI.هذا يضغط على غشاء استزراع الغاز القابل للنفاذ ضد شريحة PDMS المثبتة لضمان ختم الجهاز. استخراج ببطء وسائل الإعلام المفرطة في رقاقة باستخدام حقنة ملليلتر واحد من ثقب المركز. مراقبة رقاقة تحت المجهر أثناء استخراج وسائل الإعلام ثم التوقف عن استخراج عندما يتم إغلاق الشريحة.ربط وحدة استشعار درجة الحرارة من الحاضنة على خشبة المسرح إلى لوحة ثلاثة بئر وتعيين إلى 37 درجة مئوية. في هذه الدراسة PC3 مثقف في مسرع تطور دون وجود الإجهاد الخارجي كان منحنيات النمو في حين محاذاة. مما يشير إلى تطابق ملف تعريف انتشار الخلايا كدالة على الموقع عبر الشريحة.ويكشف الميل الأولي للمنحنيات عن معدل الانتشار. الوقت مضاعفة للخلايا في الجهاز حوالي 24 ساعة. GFP التعبير عن PC3-EMT و mCherry التعبير عن PC3-Epi الخلية اصطف كانت تشارك في الثقافة في مسرع التطور.بدءا من التقاء 40٪ نمت تربية الأحياء 40٪ التقاء في غضون ثلاثة أيام. في حين أن منحنى النمو من التقاء مجموع هو في شكل نموذج النمو اللوجستية. استمر عدد سكان PC3-EMT في التوسع وتم قمع PC3-Epi في المرحلة غيرmptotic.كانت خلايا PC3-Epi وPC3-EMT جالسة بكثافة في وسط الجهاز وسمح لهما بالهجرة بحرية نحو المنطقة الفارغة. ويبين الرسم البياني تطبيع سرعة سرعة كلا النمطين الظاهريين سرعة PC3-EMT كانت أعلى بكثير من PC3-Epi بمعامل 1.8 مرات. من المهم جدا تجنب خلق microbubbles في جميع التكاليف في حين ينبغي أن تكون وسائل الإعلام الثقافة قبل الدافئة وفك الغاز.يجب أن يتم ترتل رقاقة PDMS بشكل صحيح ومعالجتها بلطف. نظرا لطبيعة لينة قابلة للختم لدينا طريقة ختم الضغط يمكن أن تكون preformed العديد من التجارب المصب. مثل استخراج السكان تحت كلينيكي، وتحليل المستقلب المحلي، والتحلل المكاني مناعي وتسلسل.إن تقنيتنا توضح طريقة لإعادة إنتاج المكونات الرئيسية والتفاعلات في بيئة فائقة الصغر معقدة بطريقة شاملة. ولكن بسيطة بما يكفي لتوفير بيانات كمية وموثوقة وقابلة للاستنساخ.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

نماذج وأساليب لتقييم نقل المخدرات نظم التسليم عبر الحواجز الخلوية

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

الضغط خلية باعتبارها قوية، ميكروفلويديك بين الخلايا توصيل منصة

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

الدهون طبقة ثنائية الحويصلة انشاء طريق ميكروفلويديك النفث

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

الدراسات انجذاب كهربي من الرئة خلايا سرطان باستخدام القنوات المتعددة ثنائي الكهربائية الميدان ميكروفلويديك رقاقة

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

رصد في الوقت الحقيقي من بين الخلايا الصفراء حمض حيوية باستخدام حمض الصفراء الاستشعار القائمة على الحنق ترميز وراثيا

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations

الطبقات الجيني التركيبات: منصة لالمشارك ثقافة بالسكان خلية غير المتجانسة

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential ...

Polydimethylsiloxane-polycarbonate Microfluidic Devices for Cell Migration Studies Under Perpendicular Chemical and Oxygen Gradients

ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان البولي أجهزة ميكروفلويديك لخلية دراسات الهجرة تحت عمودي الكيميائية والتدرجات الأوكسجين

This paper reports a microfluidic device made of polydimethylsiloxane (PDMS) with an embedded polycarbonate (PC) thin film to study cell migration under ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

للدائرة نموذج ميكروفلويديك تدفق لصفائح الدم نقل والإرقاء يقيس ترسب الصفائح الدموية والليفين تشكيل في الوقت الحقيقي

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

بروتوكول لتتبع في الوقت الحقيقي 3D الجسيمات مفردة

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

قمع النسخ الجيني قبل إعادة توجيه الأجهزة الخلوية مع المعدلات جينية الكيميائية

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...