Name: generation of heterogeneous drug gradients across cancer populations on a microfluidic evolution accelerator for real-time observation
Uploaded: 2019-09-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Heterogeneous Drug Gradients Across Cancer Populations on a Microfluidic Evolution Accelerator for Real-Time Observation at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af NSF PHY-1659940.

1. fabrikation af mikrofluidisk-enhed
<ol><li>Generer det ønskede mikrofluidisk mønster ved hjælp af et layout design software (Se supplerende materialer).</li>
	<li>Fabrikere photomask. Se tabel over materialer for flere detaljer.<ol>
<li>Ved hjælp af en laser forfatter, skrive mønsteret på en sodavand glasplade belagt med 100 nm af CR og 500 nm af fotoresist AZ1518.</li>
		<li>Udvikle fotoresist med Developer AZ300MIF for 60 s.</li>
		<li>Etch væk chrom uden beskyttelse fra fo...

<ol>
	<li>Meacham, C. E., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+heterogeneity+and+cancer+cell+plasticity.">Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity.</a> Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).</li><li>Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+microenvironment+and+its+role+in+promoting+tumor+growth.">The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth.</a> Oncogene. 27 (45), 5904-5912 (2008).</li><li>Lambert, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analogy+between+the+evolution+of+drug+resistance+in+bacterial+communities+and+malignant+tissues.">An analogy between the evolution of drug resistance in bacterial communities and malignant tissues.</a> Nature Reviews Cancer. 11 (5), 375-382 (2011).</li><li>Tannock, I. F., Lee, C. M., Tunggal, J. K., Cowan, D. S., Egorin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limited+penetration+of+anticancer+drugs+through+tumor+tissue:+a+potential+cause+of+resistance+of+solid+tumors+to+chemotherapy.">Limited penetration of anticancer drugs through tumor tissue: a potential cause of resistance of solid tumors to chemotherapy.</a> Clinical Cancer Research. 8 (3), 878-884 (2002).</li><li>Grantab, R. H., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Penetration+of+anticancer+drugs+through+tumour+tissue+as+a+function+of+cellular+packing+density+and+interstitial+fluid+pressure+and+its+modification+by+bortezomib.">Penetration of anticancer drugs through tumour tissue as a function of cellular packing density and interstitial fluid pressure and its modification by bortezomib.</a> BMC Cancer. 12, 214 (2012).</li><li>Fu, F., Nowak, M. A., Bonhoeffer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+Heterogeneity+in+Drug+Concentrations+Can+Facilitate+the+Emergence+of+Resistance+to+Cancer+Therapy.">Spatial Heterogeneity in Drug Concentrations Can Facilitate the Emergence of Resistance to Cancer Therapy.</a> PLoS Computational Biology. 11 (3), e1004142 (2015).</li><li>Bogorad, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+microvessel+models.">In vitro microvessel models.</a> Lab on a Chip. 15 (22), 4242-4255 (2015).</li><li>Caballero, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-on-chip+models+of+cancer+metastasis+for+future+personalized+medicine:+From+chip+to+the+patient.">Organ-on-chip models of cancer metastasis for future personalized medicine: From chip to the patient.</a> Biomaterials. 149, 98-115 (2017).</li><li>Caballero, D., Blackburn, S. M., De Pablo, M., Samitier, J., Albertazzi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-vessel-on-a-chip+models+for+drug+delivery.">Tumour-vessel-on-a-chip models for drug delivery.</a> Lab on a Chip. 17 (22), 3760-3771 (2017).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acceleration+of+emergence+of+bacterial+antibiotic+resistance+in+connected+microenvironments.">Acceleration of emergence of bacterial antibiotic resistance in connected microenvironments.</a> Science. 333 (6050), 1764-1767 (2011).</li><li>Wu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ancient+hot+and+cold+genes+and+chemotherapy+resistance+emergence.">Ancient hot and cold genes and chemotherapy resistance emergence.</a> Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10467-10472 (2015).</li><li>Lin, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+and+mesenchymal+prostate+cancer+cell+population+dynamics+on+a+complex+drug+landscape.">Epithelial and mesenchymal prostate cancer cell population dynamics on a complex drug landscape.</a> Convergent Science Physical Oncology. 3 (4), 045001 (2017).</li><li>Lin, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+heterogeneous+environment+and+docetaxel+gradient+in+the+emergence+of+polyploid,+mesenchymal+and+resistant+prostate+cancer+cells.">The role of heterogeneous environment and docetaxel gradient in the emergence of polyploid, mesenchymal and resistant prostate cancer cells.</a> Clinical &amp; Experimental Metastasis. 36 (2), 97-108 (2019).</li><li>Roca, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factors+OVOL1+and+OVOL2+induce+the+mesenchymal+to+epithelial+transition+in+human+cancer.">Transcription factors OVOL1 and OVOL2 induce the mesenchymal to epithelial transition in human cancer.</a> PloS One. 8 (10), e76773 (2013).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Tinevez, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trackmate:+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking.">Trackmate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li><li>Caballero, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-on-chip+models+of+cancer+metastasis+for+future+personalized+medicine:+From+chip+to+the+patient.">Organ-on-chip models of cancer metastasis for future personalized medicine: From chip to the patient.</a> Biomaterials. 149, 98-115 (2017).</li><li>Akhtar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+flaws+and+human+harms+of+animal+experimentation.">The flaws and human harms of animal experimentation.</a> Cambridge Quarterly of Healthcare Ethics. 24 (4), 407-419 (2015).</li><li>Sontheimer-Phelps, A., Hassell, B. A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+cancer+in+microfluidic+human+organs-on-chips.">Modelling cancer in microfluidic human organs-on-chips.</a> Nature Reviews Cancer. 19 (2), 65-81 (2019).</li><li>Bogorad, M. I., DeStefano, J., Karlsson, J., Wong, A. D., Gerecht, S., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+in+vitro+microvessel+models.">Review: in vitro microvessel models.</a> Lab on a Chip. 15, 4242-4255 (2015).</li><li>Za&#241;udo, J. G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+control+of+cellular+decision-making+networks+in+the+epithelial-to-mesenchymal+transition.">Towards control of cellular decision-making networks in the epithelial-to-mesenchymal transition.</a> Physical Biology. 16 (3), 031002 (2019).</li><li>Morris, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+population+solitary+waves+can+defeat+rings+of+funnels.">Bacterial population solitary waves can defeat rings of funnels.</a> New Journal of Physics. 19 (3), 035002 (2017).</li></ol>

Konventionel cellekultur blev udviklet for næsten et århundrede siden og er fortsat den hyppigst anvendte prækliniske model i biomedicinsk forskning, på trods af dens dokumenterede begrænsede evne til at forudsige kliniske resultater i Cancer17. Dyremodeller tilbyder den højeste fysiologiske relevans og rimelige genetiske lighed for mennesker, men har længe været anerkendt for at have betydelige begrænsninger i forudsigelse af menneskelige resultater18. Blandt alle...

Kræft er i stigende grad blevet anerkendt som et komplekst økosystem, der ikke kun afhænger af den fortsatte dysregulering af muterede cellepopulationer, men også af vitale interaktioner mellem kræftceller og værts mikromiljøet. I denne forstand udvikler kræften sig på et adaptivt landskab, der manifesteres ved en kombination af faktorer, herunder et heterogent tumor mikromiljø og kryds stilk med en række værtsceller, som alle bidrager med selektivt pres for yderligere genetiske eller Epigenetiske ændringer1,2,3. I forbindelse med solide tumorer, ulige fordeling af kemoterapeutika og andre ressource gradienter bidrager til deres molekylære heterogenitet og kan spille en rolle i udviklingen af resistens over for lægemidler, øget angiogenese til særlige tumor subpopulationer, og endda metastase4,5,6. Konventionelle in vitro 2D cellekultur undersøgelser, mens besidder storstilet, praktisk eksperimentel kapacitet, giver middel-felt, ensartede, og faste betingelser, ofte mangler den præcise rumlige og tidsmæssige miljøkontrol nødvendig for virkelig emulere in vivo tumor dynamik. Der er således behov for mere repræsentative ex vivo-modeller til reproduktion af tumor mikromiljøet forud for dyremodeller i narkotika udviklings rørledningen for at opnå en bedre forudsigelse af kræft progression samt reaktioner på lægemidler inden for dynamisk stress Landskaber. Mikrofluidics er blevet foreslået for at bygge bro over kløften mellem 2D cellekultur studier og mere komplekse in vivo dyreforsøg, der muligvis ikke kan understøtte kontrollerbar kvantitativ undersøgelse7,8,9.
En ideel in vitro-system til at karakterisere kræft celle dynamik bør besidde evnen til at generere en heterogen mikromiljø til at efterligne adaptive cellulære reaktioner, der kan finde sted i en tumor, samt give mulighed for observation af disse dynamikker på en enkelt celle opløsning. I denne artikel beskriver vi en mikrofluidic cellekultur platform, en PDMS-baseret enhed kaldet "Evolution Accelerator" (EA), der giver mulighed for parallelle in vitro-undersøgelser af cancer celle dynamik ved cellulær opløsning med realtidsdata indsamling over løbet af uger, mens stabilt fastholde gradienter af stress på tværs af kulturlandskab. Udformningen af denne platform er baseret på vores tidligere arbejde, hvor den evolutionære dynamik af organismer i en Tjurer kan accelereres10,11. Specifikt i en gruppe af rumligt adskilte populationer, der interagerer på et eller andet niveau, når de udsættes for et heterogene stress landskab, de mest fit arter kan dominere i en lokalbefolkning hurtigere sammenlignet med en stor ensartet population. De fordelagtige arter derefter migrere til tilstødende mikrohabitater i søgen efter ressourcer og plads, og i sidste ende dominere hele befolkningen. Som vist i figur 1består mønsteret af den mikrofluidiske EA-chip af (i) et par Serpentine kanaler, der giver frisk medie cirkulation og konstruerer fast Grænsebetingelser for kemisk diffusion, og II) det sekskantede celle dyrkningsområde som består 109 indbyrdes forbundne sekskantede og 24 halvt-sekskantede kamre i midten, der ligner en honeycomb struktur. Chippen er 100 μm i dybden. Mediekanaler og cellekultur region er forbundet med små slidser (ca. 15 μm bred), som forhindrer direkte medieflow og den resulterende forskydningsbelastning på tværs af cellekultur området, men stadig tillader kemikalier at diffus gennem små slidser og udveksle næringsstoffer, metabolisk affald osv. Genereringen af kemiske gradienter er påvist i figur 1B, hvor en mediekanal indeholder 0,1 mm fluorescein, mens den anden kanal er fri for fluorescein. Celler dyrkes på en gasgennemtrængelig membran, indkapslet af mikrostrukturerne gennem det positive tilbage tryk på membranen mod chippen. Komponenterne i anordningen er illustreret i figur 2, og den eksperimentelle opsætning er illustreret i figur 3, hvor kulturen holdes på et inverteret mikroskop ved 37 °c, med over 85% relativ luftfugtighed, og konditioneret under normoxia gas sammensætning.
Dette system giver detaljeret observation af lokaliserede cellulære interaktioner via lysfelt og fluorescerende kanaler og giver mulighed for rumligt løste downstream-assays såsom immunofluorescence, Western blot, eller massespektrometri. Vi har tidligere demonstreret som en proof-of-princip af denne mikrofluidisk Cancer-on-chip model på lang sigt Co-kultur af epitelial og mesenchymal PC3 prostatacancer celler12 samt fremkomsten af Drug-resistens polyploide gigant kræftceller ved hjælp af epitelial PC3 cellelinje13. Mens vi præsenterer anvendelsen af denne platform til at forstå den rumlige dynamik af epitelial PC3 og mesenchymal prostatacancer celler under en stress gradient af Docetaxel, kan det mikrofluidisk system let anvendes til enhver kombination af cellelinjer og ressource (dvs. stoffer, næringsstoffer, ilt) gradienter.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL BD Luer-Lok tip syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>14-823-16E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5955</td>
			<td>1x anti-anti</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 300 MIF</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>18441123163</td>
			<td>Photoresist developer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ1518</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>AZ1518</td>
			<td>Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ4330</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>AZ4330</td>
			<td>Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cr Chromium Etchant</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>651826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Life Technologies Corporation</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heidelberg DWL 66+ laserwriter</td>
			<td>Heidelberg Instruments</td>
			<td>DWL66+</td>
			<td>Writing photomask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethyldisilazane (HMDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>379212</td>
			<td>For photoresist adhesion enhancement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hollow steel pins</td>
			<td>New England Small Tube</td>
			<td>NE-1300-01</td>
			<td>&#160;.025 OD .017 ID x .500 long / type 304 WD fullhard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ibidi Heating System, Multi-Well Plates, K-Frame</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10929</td>
			<td>On-stage incubator&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok 23 G dispensing needle</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>75165A684</td>
			<td>To connect syringes and tubings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lumox dish 35</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>94.6077.331</td>
			<td>Gas-permeable cell culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microposit Remover 1165</td>
			<td>Dow Electronic Materials</td>
			<td>Microposit Remover 1165</td>
			<td>Photoresist stripper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microseal B Adhesive Sealer</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>MSB1001</td>
			<td>Adhesive sealer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-Ring (for Lumox plate sealing)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>9452K114</td>
			<td>Dash No. 27; 1-5/16&#34; ID x 1-7/16&#34; OD; Duro 70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-Ring (for bottom glass window sealing)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>9452K74</td>
			<td>Dash No. 20; 7/8&#34; ID x 1&#34; OD; Duro 70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma-Preen Plasma Cleaning/Etching System</td>
			<td>Plasmatic Systems, Inc</td>
			<td>Plasma-Preen</td>
			<td>Oxygen plasma system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Life Technologies Corporation</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Samco RIE800iPB DRIE</td>
			<td>Samco</td>
			<td>RIE800iPB</td>
			<td>Deep reactive-ion etching system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suss MA6 mask aligner</td>
			<td>SUSS MicroTec</td>
			<td>MA6</td>
			<td>Mask aligner&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone Elastomer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9285739</td>
			<td>PDMS elastomer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TePla M4L plasma etcher</td>
			<td>PVA TePla</td>
			<td>M4L</td>
			<td>Plasma etcher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloro-1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl-silane (PFOTS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>448931</td>
			<td>For silicon wafer silanization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon microbore tube (0.020&#34; x 0.060&#34;OD)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-06419-01</td>
			<td>Tubings for media delivery</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of heterogeneous drug gradients across cancer populations on a microfluidic evolution accelerator for real-time observation

Konventionel cellekultur er fortsat den hyppigst anvendte prækliniske model, på trods af dens påviste begrænsede evne til at forudsige kliniske resultater i cancer. Microfluidic Cancer-on-chip-modeller er blevet foreslået for at bygge bro mellem de overforenklede konventionelle 2D-kulturer og mere komplicerede dyremodeller, som har begrænset evne til at producere pålidelige og reproducerbare kvantitative resultater. Her præsenterer vi en mikrofluidisk Cancer-on-chip model, der gengiver centrale komponenter i en kompleks tumor mikromiljø på en omfattende måde, men er enkel nok til at give robuste kvantitative beskrivelser af kræft dynamik. Denne mikrofluidisk Cancer-on-chip model, "Evolution Accelerator," nedbryder en stor population af kræftceller i en sammenkoblet vifte af tumor mikromiljøer samtidig generere en heterogene kemoterapeutiske stress landskab. Progression og evolutionære dynamik kræft som reaktion på narkotika gradient kan overvåges i ugevis i realtid, og talrige downstream eksperimenter kan udføres supplerer de tidsforskudt billeder taget gennemløbet af eksperimenter.

Validering af optimal cellevækst på chip Et vigtigt mål for eksperimentet platform er at gengive centrale komponenter og interaktioner i en kompleks tumor mikromiljø på en omfattende måde, men simpelt nok til at give kvantitative, pålidelige og reproducerbare data. Dette mål kan kun nås, hvis vi har fuld kontrol over de fysiske og biokemiske miljøfaktorer. Vi skal enten udelukke de uønskede faktorer eller finde ud af en måde at indarbejde de ukontrollerbare...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Heterogeneous Drug Gradients Across Cancer Populations on a Microfluidic Evolution Accelerator for Real-Time Observation at JoVE.com

Generation of Heterogeneous Drug Gradients Across Cancer Populations on a Microfluidic Evolution Accelerator for Real-Time Observation

Vi præsenterer en mikrofluidisk Cancer-on-chip model, "Evolution Accelerator" teknologi, som giver en kontrollerbar platform for langsigtede real-time kvantitative undersøgelser af Cancer dynamik inden for veldefinerede miljømæssige forhold på enkelt-celle Niveau. Denne teknologi forventes at fungere som en in vitro-model for grundforskning eller præklinisk lægemiddeludvikling.

Generering af heterogene stof gradienter på tværs af Cancer populationer på en Microfluidic Evolution Accelerator for real-time observation

Conventional cell culture remains the most frequently used preclinical model, despite its proven limited ability to predict clinical results in cancer. ...

Denne microfluidic cancer on-chip model, som vi kalder evolution accelerator, giver en kontrollerbar platform for lang sigt, realtid kvantitative undersøgelser af kræft dynamik inden for veldefinerede miljøforhold på et enkelt celleniveau. Teknologien giver os mulighed for at sonde den evolutionære dynamik af kræft under en tumor-lignende stress landskab. Levere oplysninger, herunder morfologi, befolkning, motilitet og migration over tid på celleniveau.Med evnen til at kontrollere og overvåge adfærd blandede tumor populationer under velkontrollerede stress gradienter vores teknologi kan præsentere en mere fysiologisk relevant model for præklinisk udvikling af lægemidler. Den præsenterede trykforseglingsemballagemetode kan også implementeres i andre mikrofluidiske systemer, der kræver avanceret justering af den omgivende gassammensætning samt downstream-forsøgskapaciteten. Nøglen til at udføre et langsigtet eksperiment er at sikre et fysisk og biokemisk stabilt miljø.Faktorer, herunder temperatur, fugtighed og gassammensætning, bør overvåges til enhver tid. Til at begynde, fremstille en plade holder, der er tilstrækkelig til at holde samtidige gas gennemtrængelige kultur retter på en 3D-printmaskine. Skru komponenterne i den tilpassede tre godt prøveplade med skruetrækker.Desinficere komponenterne via UV-eksponering i mindst en time og efterlades i et sterilt miljø. For at starte celle linje såning tilføje fem milliliter trypsin i hver PC3-Epi eller PC3-EMT cellekultur i en 10 centimeter kultur parabol og køre trypsinization i fem minutter i en inkubator ved 37 grader celsius. Overfør cellerne fra kulturretterne i 15 milliliter centrifugerør og centrifugeres derefter ved 150 gange g i tre minutter.Kassér supernatanten. Re-suspendere hver af de celle pellets i 15 milliliter centrifuge rør og tælle cellerne i hver PC3-MP eller PC3-EMT ved hjælp af et hæmocytometer. Isoler i alt 2,5 gange 10 til de fire af hver celletype.Bland de to isolerede celletyper og tilføje i to milliliter af kultur medier. Frø to milliliter af cellekulturen i hver af de tre gaspermeable kulturretter. Lad gaspermeable i inkubatoren ved 37 grader celsius i løbet af natten for cellerne at fastgøre.Desinficere PDMS-enhederne via UV-eksponering i mindst en time og efterlades i et sterilt miljø. Nu oprette et gasforsyningssystem, der består af både kuldioxid og ilt kontrolenheder, en gaspumpe, en gas blanding kammer, en luftfugter eller bubbler, og tre separate sæt af gasventiler, og trykmålere. Alternativt kan du bruge et gasforsyningssystem, der giver normoxia tilstand.Sørg for, at den relative luftfugtighed i blandekammeret øges til over 85 %Opsætning af en termisk styreenhed på scenen ved 37 grader celsius med separate varmeunderenheder til låget og bundpladen. Den næste dag tage ud gas gennemtrængelige kultur retter fra rugemaskinen og identificere, at de detaljerede komponenter er i orden, Hvert godt besidder en gas gennemtrængelig kultur parabol holder, en PDMS chip indehaveren, et glas vindue indehaveren, og et par 35 milliliter brede glasvinduer. Brug de monterede skruer til at samle disse komponenter og klem gas gennemtrængelige kulturskål.Overfør derefter det forvardte kulturmedium til et vakuumkammer for at afgasse i 20 minutter. Pdms-chippen behandles i et iltplasmasystem i 30 sekunder for at opretholde hydrofilicitet. Næste belastning to sprøjter langsomt med 10 milliliter afgassede vækstmedier og de to andre sprøjter med 10 milliliter afgassede ønskede reagens af interesse.For eksempel medier og medier med narkotika. Tilslut hver enkelt sprøjte til en 50 centimeter slange med en 23 gauge dispensering nål i en hul stål pin. Sæt en hul stålstift ind i den anden ende af slangen.Skub mediet ind i slangen for at prime slangen og sæt stålstiften i hver PDMS-chip gennem capping-laget. Fyld reservoirlaget op, og våd PDMS-mønsterlaget med medier. Reservoiret lag fungerer som on-chip boble fælde for at forhindre luftbobler i at komme ind i mikrofluidic mønster.Læg derefter en 1 millilitersprøjte med kulturmedier. Tilslut sprøjten til en fem centimeter slange med en 23 gauge dispenseringsnål i en hul stålstift. Sæt en hul stålstift ind i den anden ende af slangen og prime slangen.Sæt den hule stålstift ind i chippens midterhul, så der senere kan ekstraheres for store medier. Der ilægges to 10 millilitersprøjter pr. chip i det forreste dæk, og de to andre sprøjter sættes i sprøjtesystemets udbetalingsdæk. For at undgå at indkapsle mikrobobler i det mikrofluidiske mønster skal en milliliter af de forvarmte og afgassede medier dispenseres i den 35 milliliter dybe gaspermeable kulturskål.Placer spånerne direkte oven på gas gennemtrængelige kulturmembraner, hvor spånen nærmer væskeoverfladen med en 15 graders hældningsvinkel. Fastspænd PDMS-chippen med PDMS-chipholderen, og skub PDMS-enheden nedad. Tape et ark af en sealer på toppen af PDMS enhed og klemme med PDMS chip indehaveren, for at forhindre chippen i at tørre ud.Indstil medieflowhastigheden omkring systemet til at være 20 mikroliter i timen. Placer hele pladen i inkubatoren på scenen på den motoriserede fase af et omvendt mikroskop. Gasforsyningssystemet tilsluttes gaskanalerne via gasslangen, og sporviddetrykket fastholdes ved 0,2 PSI.Dette tryk på gas gennemtrængelig kulturmembran mod den installerede PDMS-chip for at sikre forsegling af enheden. Ekstrakt langsomt for mange medier i chippen ved hjælp af den ene millilitersprøjte fra midterhullet. Overhold chippen under mikroskopet, mens du udvinder medier, og stop derefter udsugningen, når chippen er forseglet.Tilslut temperaturen sensing enhed på scenen inkubator til de tre godt plade og sat til 37 grader celsius. I denne undersøgelse pc3 dyrket i en evolution accelerator uden tilstedeværelsen af ekstern stress havde vækst kurver, mens justeret. Tyder på identiske af celleprolifererende profil som en funktion af position på tværs af chippen.Kurvernes oprindelige hældning afslører spredningsraten. Fordoblingstiden for celler i enheden er omkring 24 timer. GFP udtrykker PC3-EMT og mCherry udtrykke PC3-Epi celle foret var co-kulturperler i udviklingen accelerator.Fra 40% sammenløb coculture voksede 40%sammenløb inden for tre dage. Mens vækstkurven for det samlede sammenløb er i form af logistisk vækstmodel. Populationen af PC3-EMT fortsatte med at vokse, og PC3-Epi blev undertrykt i den asymptotiske fase.PC3-Epi og PC3-EMT celler var tæt siddende i midten af enheden og fik lov til frit at migrere mod den tomme region. Den normaliserede histogram af hastigheden af hastigheden af begge fænotyper viser hastigheden af PC3-EMT var betydeligt højere end PC3-Epi med en faktor på 1,8 gange. Det er meget vigtigt at undgå at skabe mikrobobler for enhver pris, mens kulturmedierne skal forstemtes og afgasses.PDMS-chippen skal være våd og håndteres forsigtigt. På grund af den bløde genlukkelige karakter af vores trykforseglingsmetode kan mange downstream-eksperimenter præforme. Såsom subklinisk populationsekstraktion, lokal metabolitanalyse og rumligt forsvundet immunfluorescens og sekventering.Vores teknologi viser en måde at reproducere nøglekomponenter og interaktioner på i et komplekst super-mikro miljø på en omfattende måde. Men enkel nok til at levere kvantitative, pålidelige og reproducerbare data.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

Modeller og metoder til evaluering Transport af Drug Delivery Systems over cellulære Barrierer

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Cell Klemme som en robust, Mikrofluid Intracellulær Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Lipiddobbeltlaget Vesikel Generation Brug Mikrofluid højtryksspuler

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

Electrotaxis Studier af lungecancerceller ved hjælp af en Multichannel Dual-elektriske-felt Mikrofluid Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

Real Time Overvågning af intracellulære Bile Acid Dynamics Ved hjælp af en genetisk indkodede FRET-baserede Bile Acid Sensor

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations

Lagdelte alginat konstruktioner: En platform for Co-kultur af Heterogene Cell populationer

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential ...

Polydimethylsiloxane-polycarbonate Microfluidic Devices for Cell Migration Studies Under Perpendicular Chemical and Oxygen Gradients

Polydimethylsiloxan-polykarbonat mikrofluidenheder for Cell Migrationsstudier Under Perpendicular Kemiske og Oxygen farveforløb

This paper reports a microfluidic device made of polydimethylsiloxane (PDMS) with an embedded polycarbonate (PC) thin film to study cell migration under ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

Mikrofluidapparat Flow Afdeling Model for trombocytinfusion og Hæmostase Måler blodpladeaflejring og fibrindannelse i realtid

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

En protokol til Real-time 3D enkelt partikel Tracking

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Undertrykke gen transskription ved at omdirigere cellulære maskiner med kemiske epigenetiske modifikatorer

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...