Name: generation of heterogeneous drug gradients across cancer populations on a microfluidic evolution accelerator for real-time observation
Uploaded: 2019-09-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Heterogeneous Drug Gradients Across Cancer Populations on a Microfluidic Evolution Accelerator for Real-Time Observation at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי NSF PHY-1659940.

1. ייצור מכשיר מיקרופלואידיג
<ol><li>צור את דפוס המיקרופלואידיג הרצוי באמצעות תוכנת עיצוב פריסה (ראה חומרים משלימים).</li>
	<li>. הרכיבו את הפושאול לפרטים נוספים עיין ברשימת החומרים .<ol>
<li>ניצול כותב לייזר, לכתוב את התבנית על צלחת סודה ליים מצופה עם 100 ננומטר של Cr ו 500 nm של photoresist AZ15...

<ol>
	<li>Meacham, C. E., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+heterogeneity+and+cancer+cell+plasticity.">Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity.</a> Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).</li><li>Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+microenvironment+and+its+role+in+promoting+tumor+growth.">The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth.</a> Oncogene. 27 (45), 5904-5912 (2008).</li><li>Lambert, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analogy+between+the+evolution+of+drug+resistance+in+bacterial+communities+and+malignant+tissues.">An analogy between the evolution of drug resistance in bacterial communities and malignant tissues.</a> Nature Reviews Cancer. 11 (5), 375-382 (2011).</li><li>Tannock, I. F., Lee, C. M., Tunggal, J. K., Cowan, D. S., Egorin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limited+penetration+of+anticancer+drugs+through+tumor+tissue:+a+potential+cause+of+resistance+of+solid+tumors+to+chemotherapy.">Limited penetration of anticancer drugs through tumor tissue: a potential cause of resistance of solid tumors to chemotherapy.</a> Clinical Cancer Research. 8 (3), 878-884 (2002).</li><li>Grantab, R. H., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Penetration+of+anticancer+drugs+through+tumour+tissue+as+a+function+of+cellular+packing+density+and+interstitial+fluid+pressure+and+its+modification+by+bortezomib.">Penetration of anticancer drugs through tumour tissue as a function of cellular packing density and interstitial fluid pressure and its modification by bortezomib.</a> BMC Cancer. 12, 214 (2012).</li><li>Fu, F., Nowak, M. A., Bonhoeffer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+Heterogeneity+in+Drug+Concentrations+Can+Facilitate+the+Emergence+of+Resistance+to+Cancer+Therapy.">Spatial Heterogeneity in Drug Concentrations Can Facilitate the Emergence of Resistance to Cancer Therapy.</a> PLoS Computational Biology. 11 (3), e1004142 (2015).</li><li>Bogorad, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+microvessel+models.">In vitro microvessel models.</a> Lab on a Chip. 15 (22), 4242-4255 (2015).</li><li>Caballero, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-on-chip+models+of+cancer+metastasis+for+future+personalized+medicine:+From+chip+to+the+patient.">Organ-on-chip models of cancer metastasis for future personalized medicine: From chip to the patient.</a> Biomaterials. 149, 98-115 (2017).</li><li>Caballero, D., Blackburn, S. M., De Pablo, M., Samitier, J., Albertazzi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-vessel-on-a-chip+models+for+drug+delivery.">Tumour-vessel-on-a-chip models for drug delivery.</a> Lab on a Chip. 17 (22), 3760-3771 (2017).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acceleration+of+emergence+of+bacterial+antibiotic+resistance+in+connected+microenvironments.">Acceleration of emergence of bacterial antibiotic resistance in connected microenvironments.</a> Science. 333 (6050), 1764-1767 (2011).</li><li>Wu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ancient+hot+and+cold+genes+and+chemotherapy+resistance+emergence.">Ancient hot and cold genes and chemotherapy resistance emergence.</a> Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10467-10472 (2015).</li><li>Lin, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+and+mesenchymal+prostate+cancer+cell+population+dynamics+on+a+complex+drug+landscape.">Epithelial and mesenchymal prostate cancer cell population dynamics on a complex drug landscape.</a> Convergent Science Physical Oncology. 3 (4), 045001 (2017).</li><li>Lin, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+heterogeneous+environment+and+docetaxel+gradient+in+the+emergence+of+polyploid,+mesenchymal+and+resistant+prostate+cancer+cells.">The role of heterogeneous environment and docetaxel gradient in the emergence of polyploid, mesenchymal and resistant prostate cancer cells.</a> Clinical &amp; Experimental Metastasis. 36 (2), 97-108 (2019).</li><li>Roca, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factors+OVOL1+and+OVOL2+induce+the+mesenchymal+to+epithelial+transition+in+human+cancer.">Transcription factors OVOL1 and OVOL2 induce the mesenchymal to epithelial transition in human cancer.</a> PloS One. 8 (10), e76773 (2013).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Tinevez, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trackmate:+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking.">Trackmate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li><li>Caballero, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-on-chip+models+of+cancer+metastasis+for+future+personalized+medicine:+From+chip+to+the+patient.">Organ-on-chip models of cancer metastasis for future personalized medicine: From chip to the patient.</a> Biomaterials. 149, 98-115 (2017).</li><li>Akhtar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+flaws+and+human+harms+of+animal+experimentation.">The flaws and human harms of animal experimentation.</a> Cambridge Quarterly of Healthcare Ethics. 24 (4), 407-419 (2015).</li><li>Sontheimer-Phelps, A., Hassell, B. A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+cancer+in+microfluidic+human+organs-on-chips.">Modelling cancer in microfluidic human organs-on-chips.</a> Nature Reviews Cancer. 19 (2), 65-81 (2019).</li><li>Bogorad, M. I., DeStefano, J., Karlsson, J., Wong, A. D., Gerecht, S., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+in+vitro+microvessel+models.">Review: in vitro microvessel models.</a> Lab on a Chip. 15, 4242-4255 (2015).</li><li>Za&#241;udo, J. G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+control+of+cellular+decision-making+networks+in+the+epithelial-to-mesenchymal+transition.">Towards control of cellular decision-making networks in the epithelial-to-mesenchymal transition.</a> Physical Biology. 16 (3), 031002 (2019).</li><li>Morris, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+population+solitary+waves+can+defeat+rings+of+funnels.">Bacterial population solitary waves can defeat rings of funnels.</a> New Journal of Physics. 19 (3), 035002 (2017).</li></ol>

תרבות התא קונבנציונאלי פותחה כמעט לפני מאה שנה והוא נשאר המודל הנפוץ ביותר טרום קלינית במחקר ביו, למרות היכולת המוגבלת שלה מוכחת לחזות תוצאות קליניות סרטן17. דגמי בעלי חיים מציעים את הרלוונטיות הפיזיולוגית הגבוהה ביותר והדמיון הגנטי הסביר לבני האדם, אך זמן רב הכירו במגבלות מש...

סרטן כבר הוכר יותר ויותר כמערכת אקולוגית מורכבת, כי תלוי לא רק על המשך בלתי מתמשך של אוכלוסיות תאים מוטציה אלא גם על אינטראקציות חיוניות בין תאים סרטניים לבין מיקרואקולוגיה המארחת. במובן זה, הסרטן מתפתח על נוף אדפטיבית המתבטא על ידי שילוב של גורמים, כולל מיקרוסביבה גידול הטרוגנית והוצלב עם מגוון של תאים מארחים, כולם לתרום לחצים סלקטיבית עבור גנטי נוסף או . שינויים אפיגנטיים1,2,3 בהקשר של גידולים מוצקים, התפלגות אחידה של chemotherapeutics ומעברי צבע אחרים התורמים לטרוגניות המולקולריים שלהם ועשויים לשחק תפקיד בפיתוח התנגדות לסמים, הגדילה אנגיוגנזה לגידול מסוים אוכלוסיות משנה, ואפילו גרורות4,5,6. קונבנציונאלי בלימודי תרבות תא 2D, תוך שליטה בקנה מידה גדול, היכולת ניסיוני נוח, מספק שדה ממוצע, אחיד, וקבוע התנאים, לעתים קרובות חסר בקרת הסביבה המרחבית מדויק הזמני הדרושים באמת לחקות הדינמיקה הגידול vivo. כך, יש צורך יותר מודלים לשעבר vivo ex לשכפל את מיקרוסביבה הגידול לפני מודלים בעלי חיים בצינור פיתוח התרופה כדי חיזוי טוב יותר של התקדמות הסרטן, כמו גם תגובות סמים בתוך מתח דינמיות נופים. מיקרופלואידיקה הוצעו לגשר על הפער בין לימודי תרבות תא 2d ומורכבות יותר במחקרים בעלי חיים vivo שייתכן שלא יוכלו לתמוך במחקרים כמותיים שניתן לשליטה7,8,9.
אידיאלי במערכת מבחנה כדי לאפיין את הדינמיקה תאים סרטניים צריך להחזיק את היכולת ליצור מיקרוסביבה הטרוגנית כדי לחקות את התגובות הסלולר אדפטיבית שעשוי להתרחש בגידול, כמו גם לאפשר התבוננות של הדינמיקה הזאת ב רזולוציה של תא בודד. במאמר זה, אנו מתארים פלטפורמת מיקרופלואידיג תא התרבות, מכשיר מבוסס PDMS שנקרא "מאיץ האבולוציה" (EA), המאפשר מקבילים במחקרים מחוץ לגופית של דינמיקה תא סרטן ברזולוציה התאית עם רכישת נתונים בזמן אמת על משך שבועות, בעוד שמירה על מעברי מדרגות של מתח ברחבי הנוף התרבותי. העיצוב של פלטפורמה זו מתבסס על עבודתנו הקודמת, שבה ניתן להאיץ את הדינמיקה ההתפתחותית של אורגניזמים במטא-מטאפיסיה10,11. באופן ספציפי, בקבוצה של אוכלוסיות מופרדות הדדית האינטראקציה ברמה מסוימת, כאשר נחשפים לנוף הטרוגנית הלחץ, המינים המתאימים ביותר יכול להשתלט על האוכלוסייה המקומית מהר יותר לעומת זאת של אוכלוסיה גדולה אחידה. לאחר מכן, המינים הכדניים עוברים לבתי גידול שכנים בחיפוש אחר משאבים ומרחב, ובסופו של דבר שולטים באוכלוסיה כולה. כפי שמוצג באיור 1, התבנית של שבב EA microflu, מורכב (i) זוג של ערוצי הסרפנטיין המספקים מחזור מדיה טרי ולבנות תנאי גבול קבוע לדיפוזיה כימית, ו (ii) האזור תרבות התא משושה אשר מורכב 109 משושה המחוברים ו 24 חדרי חצי משושה במרכז, דמוי המבנה חלת דבש. השבב הוא 100 יקרומטר לעומק. ערוצי מדיה ואזור תרבות התא מקושרים עם חריצים קטנים (כ-15 יקרומטר רחב), אשר מונעים זרימת מדיה ישירה ומתח ההטיה כתוצאה מעבר לאזור התרבות של התא, ועדיין מאפשרים לכימיקלים לפזר באמצעות חריצים קטנים וחומרים מזינים של החליפין, פסולת מטבולית, וכו '. הדור של מעברי צבע כימיים מוצג באיור 1B, שבו ערוץ מדיה אחד מכיל 0.1 מ"מ של fluorescein בעוד הערוץ השני הוא חינם של fluorescein. תאים הם מתורבתים על ממברנה חדיר גז, כאשר כחלחל על ידי המיקרו מבנים דרך לחץ האחורי חיובי על הקרום נגד השבב. מרכיבי בעל ההתקן מומחשים באיור 2, והכיוונון הנסיוני מומחש באיור 3, כאשר התרבות נשמרת על מיקרוסקופ הפוך ב-37 ° c, עם מעל 85% לחות יחסית, וממוזג תחת הרכב גז נורמוסקסיה.
מערכת זו מספקת תצפית מפורטת של אינטראקציות הסלולר המותאמות לשפות אחרות באמצעות שדות פלורסנט ומאפשר העברה של הזרם החוצה, כגון immunofluorescence, אבן חשופה מערבית או ספקטרומטר מסה. הדגמנו בעבר כהוכחה של העיקרון של סרטן זה microflu, מודל על שבב של המודל על שיתוף לטווח ארוך של האפיתל ואת mesenchymal PC3 סרטן הערמונית תאים12 , כמו גם הופעתה של ענק סמים התנגדות פוליפואיד ענקית תאים סרטניים באמצעות האפיתל PC3 תא קו13. בעוד אנו מציגים את היישום של הפלטפורמה הזאת כדי להבין את הדינמיקה הטמפורלית של האפיתל PC3 ו mesenchymal סרטן הערמונית תאים תחת הדרגתי לחץ של doceel, מערכת microfluidic ניתן להחיל בקלות על כל שילוב של קווי התא ומשאבים (כלומר, תרופות, מזינים, חמצן) מעברי צבע.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL BD Luer-Lok tip syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>14-823-16E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5955</td>
			<td>1x anti-anti</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 300 MIF</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>18441123163</td>
			<td>Photoresist developer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ1518</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>AZ1518</td>
			<td>Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ4330</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>AZ4330</td>
			<td>Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cr Chromium Etchant</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>651826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Life Technologies Corporation</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heidelberg DWL 66+ laserwriter</td>
			<td>Heidelberg Instruments</td>
			<td>DWL66+</td>
			<td>Writing photomask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethyldisilazane (HMDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>379212</td>
			<td>For photoresist adhesion enhancement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hollow steel pins</td>
			<td>New England Small Tube</td>
			<td>NE-1300-01</td>
			<td>&#160;.025 OD .017 ID x .500 long / type 304 WD fullhard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ibidi Heating System, Multi-Well Plates, K-Frame</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10929</td>
			<td>On-stage incubator&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok 23 G dispensing needle</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>75165A684</td>
			<td>To connect syringes and tubings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lumox dish 35</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>94.6077.331</td>
			<td>Gas-permeable cell culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microposit Remover 1165</td>
			<td>Dow Electronic Materials</td>
			<td>Microposit Remover 1165</td>
			<td>Photoresist stripper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microseal B Adhesive Sealer</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>MSB1001</td>
			<td>Adhesive sealer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-Ring (for Lumox plate sealing)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>9452K114</td>
			<td>Dash No. 27; 1-5/16&#34; ID x 1-7/16&#34; OD; Duro 70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-Ring (for bottom glass window sealing)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>9452K74</td>
			<td>Dash No. 20; 7/8&#34; ID x 1&#34; OD; Duro 70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma-Preen Plasma Cleaning/Etching System</td>
			<td>Plasmatic Systems, Inc</td>
			<td>Plasma-Preen</td>
			<td>Oxygen plasma system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Life Technologies Corporation</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Samco RIE800iPB DRIE</td>
			<td>Samco</td>
			<td>RIE800iPB</td>
			<td>Deep reactive-ion etching system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suss MA6 mask aligner</td>
			<td>SUSS MicroTec</td>
			<td>MA6</td>
			<td>Mask aligner&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone Elastomer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9285739</td>
			<td>PDMS elastomer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TePla M4L plasma etcher</td>
			<td>PVA TePla</td>
			<td>M4L</td>
			<td>Plasma etcher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloro-1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl-silane (PFOTS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>448931</td>
			<td>For silicon wafer silanization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon microbore tube (0.020&#34; x 0.060&#34;OD)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-06419-01</td>
			<td>Tubings for media delivery</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of heterogeneous drug gradients across cancer populations on a microfluidic evolution accelerator for real-time observation

תרבות התא קונבנציונאלי נשאר מודל טרום קליני בשימוש תכוף, למרות היכולת המוגבלת שלה מוכחת לחזות תוצאות קליניות בסרטן. סרטן מיקרופלואידיג-על שבב מודלים כבר הציעו לגשר על הפער בין תרבויות 2D קונבנציונאלי מסובכים יותר מודלים בעלי חיים מורכבים יותר, אשר יש יכולת מוגבלת לייצר תוצאות כמותיים אמין ומחורץ. כאן, אנו מציגים מודל מיקרופלואידיג סרטן על שבב שמתרבה רכיבים מרכזיים של מיקרוסביבה מורכבת הגידול באופן מקיף, עדיין הוא פשוט מספיק כדי לספק תיאורים כמותיים חזקים של הדינמיקה של סרטן. זה סרטן מיקרופלואידיג מודל על שבב, "המאיץ האבולוציה," מפרק את האוכלוסייה הגדולה של תאים סרטניים לתוך מערך מחובר של מיקרוסביבות הגידול תוך יצירת מתחים הטרוגנית כימותרפיה. ההתקדמות ואת הדינמיקה האבולוציונית של סרטן בתגובה מעבר הצבע התרופה יכול להיות מנוטר במשך שבועות בזמן אמת, וניסויים רבים במורד הזרם ניתן לבצע משלים את התמונות בזמן הקפיצה שנלקחו במהלך הניסויים.

אימות של צמיחת תאים אופטימליים בשבב המטרה העיקרית של פלטפורמת הניסוי היא לשכפל רכיבים מרכזיים ואינטראקציות בסביבה מורכבת של גידולים מורכבים באופן מקיף, אך פשוט מספיק כדי לספק נתונים כמותיים, אמינים ומתכלים. מטרה זו יכולה להיות מושגת רק אם יש לנו שליטה מלאה על ...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Heterogeneous Drug Gradients Across Cancer Populations on a Microfluidic Evolution Accelerator for Real-Time Observation at JoVE.com

Generation of Heterogeneous Drug Gradients Across Cancer Populations on a Microfluidic Evolution Accelerator for Real-Time Observation

אנו מציגים מודל סרטן על שבב מיקרופלואידים, הטכנולוגיה "מאיץ האבולוציה", אשר מספק פלטפורמה לשליטה לטווח ארוך בזמן אמת מחקרים כמותיים של הדינמיקה של סרטן בתנאים סביבתיים המוגדרים היטב בתא יחיד רמת. טכנולוגיה זו צפויה לעבוד כמודל מבחנה עבור מחקר בסיסי או פיתוח תרופות טרום-קליני.

הדור של מעברי מדרגות של סמים הטרוגנית ברחבי אוכלוסיות סרטן על מאיץ האבולוציה Microfluidic להתבוננות בזמן אמת

Conventional cell culture remains the most frequently used preclinical model, despite its proven limited ability to predict clinical results in cancer. ...

מודל מיקרופלואידי זה של סרטן על שבב שאנו מכנים מאיץ האבולוציה, מספק פלטפורמה ניתנת לשליטה למחקרים כמותיים ארוכי טווח בזמן אמת של דינמיקת סרטן בתוך תנאים סביבתיים מוגדרים היטב ברמת תא יחיד. הטכנולוגיה מאפשרת לנו לחקור את הדינמיקה האבולוציונית של סרטן תחת נוף מתח דמוי גידול. מתן מידע כולל מורפולוגיה, אוכלוסייה, תנועתיות והגירה לאורך זמן ברמה התאית.עם היכולת לשלוט ולנטר את ההתנהגות של אוכלוסיות גידולים מעורבים תחת שיפוע מתח מבוקר היטב הטכנולוגיה שלנו עשויה להציג מודל רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית לפיתוח תרופות פרה-קליניות. ניתן ליישם את שיטת איטום הלחץ המוצגת גם במערכות מיקרופלואידיות אחרות הדורשות התאמה מתוחכמת של הרכב גז הסביבה, כמו גם את יכולת הניסוי במורד הזרם. המפתחות לביצוע ניסוי ארוך טווח בהצלחה הם להבטיח סביבה יציבה פיזית וביוכימית.יש ל לפקח על גורמים הכוללים טמפרטורה, לחות והרכב גז בכל עת. כדי להתחיל, לפברק מחזיק צלחת כי הוא מספיק כדי להחזיק מנות תרבות חדירות גז בו זמנית על מכונת הדפסה 3D. בטל את הברגת הרכיבים של לוחית הדגימה המותאמת אישית של שלושה בארות עם מנהל התקן בורג.יש לחטא את הרכיבים באמצעות חשיפה לקרינת UV למשך שעה אחת לפחות ולהשאיר בסביבה סטרילית. כדי להתחיל זריעת קו התא להוסיף חמישה מיליליטר של טריפסין לתוך כל PC3-Epi או PC3-EMT תא תרבות צלחת 10 ס"מ ולהפעיל את טריפסיניזציה במשך חמש דקות באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס. מעבירים את התאים ממנות התרבות לצינורות צנטריפוגה 15 מיליליטר ולאחר מכן צנטריפוגה ב 150 פעמים g במשך שלוש דקות.השלך את העל-טבעי. להשעות מחדש כל כדורי התא בצינורות צנטריפוגה 15 מיליליטר לספור את התאים של כל PC3-MP או PC3-EMT באמצעות hemocytometer. לבודד סך של 2.5 פעמים 10 לארבעה מכל סוג תא.ערבבו את שני סוגי התאים המבודדים והוסיפו שני מיליליטר של מדיית תרבות. זרע שני מיליליטר של תרבות התא לתוך כל אחד משלוש מנות התרבות חדיר גז. השאירו את הגז חדיר באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס במשך הלילה לתאים לצרף.יש לחטא את התקני ה-PDMS באמצעות חשיפה לקרינת UV למשך שעה אחת לפחות ולהשאירם בסביבה סטרילית. עכשיו להקים מערכת אספקת גז המורכבת הן פחמן דו חמצני ויחידות בקרת חמצן, משאבת גז, תא ערבוב גז, מכשיר אדים או בועה, ושלוש קבוצות נפרדות של שסתומי גז, ומדי לחץ. לחלופין, השתמש במערכת אספקת גז המספקת מצב נורמוקסיה.ודאו שהלחות היחסית בתא הערבוב גדלה אל מעל 85% הקימו יחידת בקרה תרמית של דגירה על הבמה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם תת-יחידות חימום נפרדות למכסה ולצלחת התחתונה. למחרת מוציאים את מנות התרבות חדירות הגז מהחממה ומזהים שהרכיבים המפורטים מסודרים, בכל באר יש מחזיק צלחת תרבות חדירה לגז, מחזיק שבב PDMS, מחזיק חלון זכוכית וזוג חלונות זכוכית ברוחב 35 מיליליטר. השתמש בברגים המותאמים להרכבת רכיבים אלה ולהדק את צלחת התרבות חדירה גז.לאחר מכן מעבירים את מדיום התרבות החם לתא ואקום כדי לבטל את הגז למשך 20 דקות. לטפל בשבב PDMS במערכת פלזמה חמצן במשך 30 שניות על מנת לשמור על הידרופיליות. העומס הבא שני מזרקים לאט עם 10 מיליליטר של תקשורת צמיחה de-gassed ושני מזרקים אחרים עם 10 מיליליטר של reagent הרצוי דה גז של עניין.לדוגמה תקשורת ומדיה עם סמים. חבר כל מזרק בודדים צינורות 50 ס"מ על ידי מחט מחלק מד 23 לתוך סיכת פלדה חלולה אחת. הכנס סיכת פלדה חלולה לקצה השני של הצינור.דחוף את המדיה לתוך הצינור כדי להפוך את הצינורות ולהכניס את סיכת הפלדה לתוך כל שבב PDMS דרך שכבת המכסה. מלאו את שכבת המאגר והרטיבו את שכבת דוגמת המילוי של PDMS במדיה. שכבת המאגר פועלת כמלכודת בועות על השבב כדי למנוע מבועות אוויר להיכנס לתבנית המיקרופלואידית.ואז לטעון מזרק מיליליטר אחד עם מדיה תרבותית. חבר את המזרק צינורות חמישה סנטימטרים על ידי מחט חלוקת מד 23 לתוך סיכת פלדה חלולה אחת. הכנס סיכת פלדה חלולה לקצה השני של הצינור וראש הצינור.הכנס את סיכת הפלדה החלולה לתוך החור המרכזי של השבב כדי שמדיה מוגזמת תחולץ מאוחר יותר. לטעון שני מזרקים 10 מיליליטר לכל שבב בסיפון הקדמי ולמקום את שני המזרקים האחרים בסיפון הנסיגה של מערכת המזרק. על מנת למנוע מלכודת microbubbles בתבנית microfluidic, לחלק מיליליטר אחד של התקשורת מחומם מראש de-gassed לתוך צלחת תרבות חדיר גז עמוק 35 מיליליטר.מקם את השבבים ישירות על גבי קרום התרבות חדיר הגז, שבו השבב מתקרב למשטח הנוזלי עם זווית הטיה של 15 מעלות. מהדקים את שבב ה-PDMS עם מחזיק השבבים PDMS ודוחפים את התקן ה-PDMS כלפי מטה. קלטת גיליון של איטום על גבי התקן PDMS ומהדק עם מחזיק שבב PDMS, על מנת למנוע את השבב להתייבש.הגדר את קצב זרימת המדיה סביב המערך ל- 20 מיקרוליטר לשעה. מקם את הצלחת כולה באינקובטור על הבמה על הבמה המונעת של מיקרוסקופ הפוך. חבר את מערכת אספקת הגז לערוצי הגז באמצעות צינורות גז ושמור על לחץ המד ב 0.2 PSI.פעולה זו לוחצת על קרום התרבות חדיר גז נגד שבב PDMS מותקן כדי להבטיח איטום של המכשיר. לאט לחלץ מדיה מוגזמת בשבב באמצעות מזרק מיליליטר אחד מהחור המרכזי. שימו לב לשבב מתחת למיקרוסקופ תוך כדי חילוץ מדיה ולאחר מכן הפסיקו לחלץ כשהשבב אטום.חבר את יחידת חישת הטמפרטורה של החממה על הבמה לצלחת שלוש בארות ולהגדיר 37 מעלות צלזיוס. במחקר זה PC3 מתורבת במאיץ אבולוציה ללא נוכחות של מתח חיצוני היו עקומות צמיחה בעוד מיושר. מציע את הזהות של פרופיל התפשטות התא כפונקציה של מיקום על פני השבב.השיפוע הראשוני של העקומות חושף את שיעור ההתפשטות. זמן ההכפלה עבור תאים בהתקן הוא כ- 24 שעות. GFP המביעים PC3-EMT ו mCherry המביעים תא PC3-Epi מרופד היו מתורבתים במשותף במאיץ האבולוציה.החל מ-40% מהתרבות גדלה הקובולטורה ב-40% בתוך שלושה ימים. בעוד עקומת הצמיחה של ההתכנסות הכוללת היא בצורה של מודל צמיחה לוגיסטי. האוכלוסייה של PC3-EMT המשיכה להתרחב ו-PC3-Epi דוכא בשלב האסימפטוטי.תאי PC3-Epi ו-PC3-EMT ישבו בצפיפות במרכז המכשיר והורשו לנדוד בחופשיות לכיוון האזור הריק. ההיסטוגרמה מנורמל של המהירות של שני פנוטיפים מראה את המהירות של PC3-EMT היה גבוה באופן משמעותי מאשר PC3-Epi על ידי גורם של 1.8 פעמים. חשוב מאוד להימנע מיצירת microbubbles בכל מחיר בעוד התקשורת התרבותית צריכה להיות מחוממת מראש de-gassed.השבב PDMS צריך להיות רטוב כראוי ומטופל בעדינות. בשל האופי הרך שניתן לאטום מחדש של שיטת איטום הלחץ שלנו, ניסויים רבים במורד הזרם יכולים להיות מעוצבים מראש. כגון מיצוי אוכלוסייה תת-קליני, ניתוח מטבוליטים מקומי, ושפע חיסוני ותרשים שנפתרו באופן מרחבי.הטכנולוגיה שלנו מדגימה דרך לשכפל רכיבים ואינטראקציות מרכזיים בסביבת סופר מיקרו מורכבת באופן מקיף. עם זאת, פשוט מספיק כדי לספק נתונים כמותיים, אמינים ובלתי ניתנים לשחזור.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

מודלים ושיטות להערכת תחבורה של ליפידיות פני מחסומים נייד

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

לוחץ תא כחזק, Microfluidic תאית פלטפורמה להצגה

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

השומנים bilayer שלפוחיות דור שימוש Microfluidic jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

Electrotaxis מחקרים של תאי סרטן ריאות באמצעות רב-ערוצי דו-חשמלי-שדה שבב microfluidic

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

ניטור בזמן אמת של תאיים חומצות מרה Dynamics שימוש חומצות מרה חיישן מבוסס סריג גנטי מקודד

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations

בונה אלגינט Layered: פלטפורמה עבור Co-תרבות של אוכלוסיות תאים הטרוגניות

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential ...

Polydimethylsiloxane-polycarbonate Microfluidic Devices for Cell Migration Studies Under Perpendicular Chemical and Oxygen Gradients

Polydimethylsiloxane-פוליקרבונט התקני microfluidic הכימי בניצב תחת מחקרי נדידת תאים והדרגות חמצן

This paper reports a microfluidic device made of polydimethylsiloxane (PDMS) with an embedded polycarbonate (PC) thin film to study cell migration under ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

מודל לשכת תזרים Microfluidic עבור עירוי טסיות המוסטאסיס מודד הפקדת טסיות והיווצרות הפיברין בזמן אמת

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

פרוטוקול לצורך מעקב בזמן אמת 3D חלקיק יחיד

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

הדחקת שעתוק גנים על ידי ניתוב מחדש מכונות הסלולר עם המגבילים Epigenetic כימי

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...