Name: generation of heterogeneous drug gradients across cancer populations on a microfluidic evolution accelerator for real-time observation
Uploaded: 2019-09-19T15:00:00
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1. マイクロ流体装置の製造
<ol><li>レイアウト設計ソフトウェアを使用して、目的のマイクロ流体パターンを生成します (補足資料を参照)。</li>
	<li>フォトマスクを製作します。詳細については、材料の表を参照してください。<ol>
<li>レーザーライターを利用して、100nmのCrと500nmのフォトレジストAZ1518でコーティングされたソーダライムガラスプレートにパターンを?...

<ol>
	<li>Meacham, C. E., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+heterogeneity+and+cancer+cell+plasticity.">Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity.</a> Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).</li><li>Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+microenvironment+and+its+role+in+promoting+tumor+growth.">The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth.</a> Oncogene. 27 (45), 5904-5912 (2008).</li><li>Lambert, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analogy+between+the+evolution+of+drug+resistance+in+bacterial+communities+and+malignant+tissues.">An analogy between the evolution of drug resistance in bacterial communities and malignant tissues.</a> Nature Reviews Cancer. 11 (5), 375-382 (2011).</li><li>Tannock, I. F., Lee, C. M., Tunggal, J. K., Cowan, D. S., Egorin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limited+penetration+of+anticancer+drugs+through+tumor+tissue:+a+potential+cause+of+resistance+of+solid+tumors+to+chemotherapy.">Limited penetration of anticancer drugs through tumor tissue: a potential cause of resistance of solid tumors to chemotherapy.</a> Clinical Cancer Research. 8 (3), 878-884 (2002).</li><li>Grantab, R. H., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Penetration+of+anticancer+drugs+through+tumour+tissue+as+a+function+of+cellular+packing+density+and+interstitial+fluid+pressure+and+its+modification+by+bortezomib.">Penetration of anticancer drugs through tumour tissue as a function of cellular packing density and interstitial fluid pressure and its modification by bortezomib.</a> BMC Cancer. 12, 214 (2012).</li><li>Fu, F., Nowak, M. A., Bonhoeffer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+Heterogeneity+in+Drug+Concentrations+Can+Facilitate+the+Emergence+of+Resistance+to+Cancer+Therapy.">Spatial Heterogeneity in Drug Concentrations Can Facilitate the Emergence of Resistance to Cancer Therapy.</a> PLoS Computational Biology. 11 (3), e1004142 (2015).</li><li>Bogorad, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+microvessel+models.">In vitro microvessel models.</a> Lab on a Chip. 15 (22), 4242-4255 (2015).</li><li>Caballero, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-on-chip+models+of+cancer+metastasis+for+future+personalized+medicine:+From+chip+to+the+patient.">Organ-on-chip models of cancer metastasis for future personalized medicine: From chip to the patient.</a> Biomaterials. 149, 98-115 (2017).</li><li>Caballero, D., Blackburn, S. M., De Pablo, M., Samitier, J., Albertazzi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-vessel-on-a-chip+models+for+drug+delivery.">Tumour-vessel-on-a-chip models for drug delivery.</a> Lab on a Chip. 17 (22), 3760-3771 (2017).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acceleration+of+emergence+of+bacterial+antibiotic+resistance+in+connected+microenvironments.">Acceleration of emergence of bacterial antibiotic resistance in connected microenvironments.</a> Science. 333 (6050), 1764-1767 (2011).</li><li>Wu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ancient+hot+and+cold+genes+and+chemotherapy+resistance+emergence.">Ancient hot and cold genes and chemotherapy resistance emergence.</a> Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10467-10472 (2015).</li><li>Lin, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+and+mesenchymal+prostate+cancer+cell+population+dynamics+on+a+complex+drug+landscape.">Epithelial and mesenchymal prostate cancer cell population dynamics on a complex drug landscape.</a> Convergent Science Physical Oncology. 3 (4), 045001 (2017).</li><li>Lin, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+heterogeneous+environment+and+docetaxel+gradient+in+the+emergence+of+polyploid,+mesenchymal+and+resistant+prostate+cancer+cells.">The role of heterogeneous environment and docetaxel gradient in the emergence of polyploid, mesenchymal and resistant prostate cancer cells.</a> Clinical &amp; Experimental Metastasis. 36 (2), 97-108 (2019).</li><li>Roca, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factors+OVOL1+and+OVOL2+induce+the+mesenchymal+to+epithelial+transition+in+human+cancer.">Transcription factors OVOL1 and OVOL2 induce the mesenchymal to epithelial transition in human cancer.</a> PloS One. 8 (10), e76773 (2013).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Tinevez, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trackmate:+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking.">Trackmate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li><li>Caballero, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-on-chip+models+of+cancer+metastasis+for+future+personalized+medicine:+From+chip+to+the+patient.">Organ-on-chip models of cancer metastasis for future personalized medicine: From chip to the patient.</a> Biomaterials. 149, 98-115 (2017).</li><li>Akhtar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+flaws+and+human+harms+of+animal+experimentation.">The flaws and human harms of animal experimentation.</a> Cambridge Quarterly of Healthcare Ethics. 24 (4), 407-419 (2015).</li><li>Sontheimer-Phelps, A., Hassell, B. A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+cancer+in+microfluidic+human+organs-on-chips.">Modelling cancer in microfluidic human organs-on-chips.</a> Nature Reviews Cancer. 19 (2), 65-81 (2019).</li><li>Bogorad, M. I., DeStefano, J., Karlsson, J., Wong, A. D., Gerecht, S., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+in+vitro+microvessel+models.">Review: in vitro microvessel models.</a> Lab on a Chip. 15, 4242-4255 (2015).</li><li>Za&#241;udo, J. G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+control+of+cellular+decision-making+networks+in+the+epithelial-to-mesenchymal+transition.">Towards control of cellular decision-making networks in the epithelial-to-mesenchymal transition.</a> Physical Biology. 16 (3), 031002 (2019).</li><li>Morris, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+population+solitary+waves+can+defeat+rings+of+funnels.">Bacterial population solitary waves can defeat rings of funnels.</a> New Journal of Physics. 19 (3), 035002 (2017).</li></ol>

従来の細胞培養はほぼ1世紀前に開発され、がん17の臨床結果を予測する実証済みの限られた能力にもかかわらず、生物医学研究で最も頻繁に使用される前臨床モデルのままである。動物モデルは、ヒトに対して最も高い生理学的関連性と合理的な遺伝的類似性を提供するが、ヒトの結果を予測する上で重要な限界があることを長い間認められてきた18。す?...

がんは、変異細胞集団の継続的な調節不全だけでなく、癌細胞と宿主の微小環境との間の重要な相互作用にも依存する複雑な生態系としてますます認識されています。この意味で、癌は、異種腫瘍微小環境および様々な宿主細胞とのクロストークを含む要因の組み合わせによって現れる適応的な風景に進化し、そのすべてがさらなる遺伝的またはエピジェネティックな変化1,2,3.固形腫瘍の文脈では、化学療法および他の資源勾配の不均一な分布は、その分子不均一性に寄与し、薬剤耐性の開発に役割を果たし、特定の腫瘍に対する血管新生の増加を果たすかもしれない亜集団、さらには転移4、5、6.従来のインビトロ2D細胞培養研究は、大規模で便利な実験能力を有する一方で、平均分野、均一、固定条件を提供し、多くの場合、真に必要な正確な空間的および時間的な環境制御を欠いている。生体内腫瘍ダイナミクスをエミュレートします。したがって、がんの進行をより良く予測し、動的ストレス内の薬物に対する応答を改善するために、薬剤開発パイプラインにおける動物モデルの前に腫瘍微小環境を再現するために、より代表的なex vivoモデルが必要とされています。風景。マイクロ流体学は、制御可能な定量的研究7、8、9をサポートすることができないかもしれない生体内動物研究における2D細胞培養研究とより複雑な間のギャップを埋めるために提案されている。
がん細胞のダイナミクスを特徴付ける理想的なインビトロシステムは、腫瘍で起こり得る適応細胞応答を模倣する不均一な微小環境を生成する能力を有し、また、単一セル解像度。本稿では、細胞分解能におけるがん細胞ダイナミクスのインビトロ研究を可能にするPDMSベースのデバイスであるマイクロ流体細胞培養プラットフォームについて、リアルタイムのデータ取得を用いて細胞分解能を用いて説明する。文化景観全体のストレスの勾配を安定的に維持しながら、数週間のコース。このプラットフォームの設計は、メタ集団における生物の進化的ダイナミクスを加速することができる我々の前の研究に基づいています10,11.具体的には、あるレベルで相互作用する空間的に分離された集団のグループでは、異種ストレス景観にさらされると、最も適合する種は、大規模な均一集団のそれと比較して、より速く地元の集団で支配することができます。有利な種は、資源と空間を求めて近隣の微生物生息地に移動し、最終的には全人口を支配する。図1に示すように、マイクロ流体EAチップのパターンは、(i)新鮮な媒体循環を提供し、化学拡散のための固定境界条件を構築する一対の蛇行チャネル、および(ii)六角形細胞培養領域で構成される。これは、ハニカム構造に似て、中央に109の相互接続された六角形と24の半六角形の部屋で構成されています。チップの深さは100μmです。培地チャネルと細胞培養領域は、小さなスリット(幅約15μm)と接続されており、直接の培地の流れを防ぎ、細胞培養領域全体で生じるせん断応力を防ぎますが、それでも化学物質が小さなスリットを通して拡散し、栄養素を交換することができます。代謝廃棄物等化学勾配の生成は図1Bで示され、一方のメディアチャネルには0.1 mMのフルオレセインが含まれ、もう一方のチャネルにはフルオレセインが含まれな場合があります。細胞はガス透過性膜上で培養され、チップに対する膜上の正の背圧を介して微細構造によって封入される。デバイスホルダーの構成要素を図2に示し、実験セットアップを図3に示し、培養は37°Cの反転顕微鏡で維持され、85%以上の相対湿度で、条件付けされています。ノルモキシアガス組成物。
このシステムは、ブライトフィールドおよび蛍光チャネルを介して局所的な細胞相互作用の詳細な観察を提供し、免疫蛍光、ウェスタンブロット、質量分析などの空間的に分解された下流アッセイを可能にします。我々は、上皮および間葉系PC3前立腺癌細胞12の長期共培養および薬剤耐性ポリプロイド巨人の出現に関するこのマイクロ流体癌オンチップモデルの原理の証明として以前に実証した。上皮PC3細胞株13を用いて癌細胞。このプラットフォームの応用は、上皮PC3とドセタキセルのストレス勾配下での間葉前立腺癌細胞の時空間的ダイナミクスを理解するために提示するが、マイクロ流体系は細胞株の任意の組み合わせに容易に適用することができる。およびリソース(すなわち、薬物、栄養素、酸素)勾配。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL BD Luer-Lok tip syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>14-823-16E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5955</td>
			<td>1x anti-anti</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 300 MIF</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>18441123163</td>
			<td>Photoresist developer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ1518</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>AZ1518</td>
			<td>Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ4330</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>AZ4330</td>
			<td>Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cr Chromium Etchant</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>651826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Life Technologies Corporation</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heidelberg DWL 66+ laserwriter</td>
			<td>Heidelberg Instruments</td>
			<td>DWL66+</td>
			<td>Writing photomask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethyldisilazane (HMDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>379212</td>
			<td>For photoresist adhesion enhancement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hollow steel pins</td>
			<td>New England Small Tube</td>
			<td>NE-1300-01</td>
			<td>&#160;.025 OD .017 ID x .500 long / type 304 WD fullhard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ibidi Heating System, Multi-Well Plates, K-Frame</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10929</td>
			<td>On-stage incubator&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok 23 G dispensing needle</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>75165A684</td>
			<td>To connect syringes and tubings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lumox dish 35</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>94.6077.331</td>
			<td>Gas-permeable cell culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microposit Remover 1165</td>
			<td>Dow Electronic Materials</td>
			<td>Microposit Remover 1165</td>
			<td>Photoresist stripper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microseal B Adhesive Sealer</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>MSB1001</td>
			<td>Adhesive sealer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-Ring (for Lumox plate sealing)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>9452K114</td>
			<td>Dash No. 27; 1-5/16&#34; ID x 1-7/16&#34; OD; Duro 70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-Ring (for bottom glass window sealing)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>9452K74</td>
			<td>Dash No. 20; 7/8&#34; ID x 1&#34; OD; Duro 70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma-Preen Plasma Cleaning/Etching System</td>
			<td>Plasmatic Systems, Inc</td>
			<td>Plasma-Preen</td>
			<td>Oxygen plasma system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Life Technologies Corporation</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Samco RIE800iPB DRIE</td>
			<td>Samco</td>
			<td>RIE800iPB</td>
			<td>Deep reactive-ion etching system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suss MA6 mask aligner</td>
			<td>SUSS MicroTec</td>
			<td>MA6</td>
			<td>Mask aligner&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone Elastomer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9285739</td>
			<td>PDMS elastomer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TePla M4L plasma etcher</td>
			<td>PVA TePla</td>
			<td>M4L</td>
			<td>Plasma etcher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloro-1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl-silane (PFOTS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>448931</td>
			<td>For silicon wafer silanization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon microbore tube (0.020&#34; x 0.060&#34;OD)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-06419-01</td>
			<td>Tubings for media delivery</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of heterogeneous drug gradients across cancer populations on a microfluidic evolution accelerator for real-time observation

従来の細胞培養は、がんの臨床結果を予測する能力が限られているにもかかわらず、最も頻繁に使用される前臨床モデルのままである。マイクロ流体がんオンチップモデルは、過度に単純化された従来の2D培養と、信頼性が高く再現可能な定量的結果を生み出す能力が限られている、より複雑な動物モデルとの間のギャップを埋めるために提案されている。ここでは、複雑な腫瘍微小環境の主要成分を包括的に再現するマイクロ流体がんオンチップモデルを紹介しますが、がんダイナミクスの堅牢な定量的記述を提供するのに十分簡単です。このマイクロ流体がんオンチップモデル「エボリューションアクセラレータ」は、がん細胞の大量を相互接続された腫瘍微小環境に分解し、異種化学療法ストレスランドスケープを生成します。薬物勾配に応答する癌の進行と進化的ダイナミクスは、リアルタイムで数週間監視することができ、多数の下流実験は、実験の過程で撮影されたタイムラプス画像を補完して行うことができます。

チップ上の最適な細胞増殖の検証 実験プラットフォームの主な目標は、複雑な腫瘍微小環境における主要なコンポーネントと相互作用を包括的な方法で再現することですが、定量的で信頼性が高く再現可能なデータを提供するのに十分なシンプルな方法です。この目標は、物理的および生化学的な環境要因を完全に制御できる場合にのみ達成できます?...

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Generation of Heterogeneous Drug Gradients Across Cancer Populations on a Microfluidic Evolution Accelerator for Real-Time Observation

マイクロ流体がんオンチップモデル「エボリューションアクセラレータ」技術を提示し、単一細胞における明確な環境条件下でがんダイナミクスを長期リアルタイムで定量的に研究するための制御可能なプラットフォームを提供します。レベル。この技術は、基礎研究や前臨床薬開発のためのインビトロモデルとしての働きが期待されます。

リアルタイム観察のためのマイクロ流体進化加速器上の癌集団全体にわたる異種薬物勾配の生成

Conventional cell culture remains the most frequently used preclinical model, despite its proven limited ability to predict clinical results in cancer. ...

進化促進剤と呼ぶこのマイクロ流体癌オンチップモデルは、単一細胞レベルで明確に定義された環境条件内の癌ダイナミクスの長期的でリアルタイムの定量的研究のための制御可能なプラットフォームを提供する。この技術は、腫瘍のようなストレスの風景の下で癌の進化ダイナミクスを探査することを可能にします。形態、集団、運動性、および時間経過に関する移動を含む情報を細胞レベルで提供する。十分に制御されたストレス勾配の下で混合腫瘍集団の行動を制御し、監視する能力を用いて、我々の技術は、前臨床薬物開発のためのより生理学的に関連するモデルを提示するかもしれない。提示された圧力シーリング包装方法は、周囲ガス組成の高度な調整と下流の実験能力を必要とする他のマイクロ流体システムでも実現できます。長期的な実験を成功させるための鍵は、物理的かつ生化学的に安定した環境を確保することです。温度、湿度、ガス組成などの要因は常に監視する必要があります。まず、3D印刷機に同時にガス透過性の培養皿を保持するのに十分なプレートホルダーを製造します。カスタマイズされた3つのウェルサンプルプレートのコンポーネントをスクリュードライバーで外します。少なくとも1時間紫外線露光を介してコンポーネントを消毒し、滅菌環境に放置します。細胞株播種を開始するには、10センチメートル培養皿の各PC3-EpiまたはPC3-EMT細胞培養物に5ミリリットルのトリプシンを加え、摂氏37度のインキュベーターで5分間トリプシンを実行します。培養皿から細胞を15ミリリットルの遠心分離チューブに移し、150倍gで遠心分離機を3分間移します。上清を捨てます。15ミリリットル遠心管内の各細胞ペレットを再中断し、ヘモサイトメーターを使用して各PC3-MPまたはPC3-EMTの細胞をカウントします。合計2.5倍の10を各セルタイプの4つを分離します。2つの単離された細胞タイプを混合し、培養培地の2ミリリットルを加える。3つのガス透過性培養皿のそれぞれに細胞培養の2ミリリットルを種分する。細胞が付着するために、一晩で摂氏37度でインキュベーターにガスを透過性のままにします。少なくとも1時間の紫外線暴露を介してPDMSデバイスを消毒し、無菌環境に残す。現在、二酸化炭素と酸素の両方の制御ユニット、ガスポンプ、ガス混合室、加湿器またはバブラー、3つの別々のガスバルブセット、および圧力計で構成されるガス供給システムを設定します。あるいはノルモキシア状態を提供するガス供給システムを使用する。混合チャンバーの相対湿度が85%以上に増加していることを確認蓋と底板のための別々の加熱サブユニットと37°Cでステージインキュベーション熱制御ユニットを設定します。翌日、インキュベーターからガス透過性の培養皿を取り出し、詳細なコンポーネントが整っていることを特定し、すべての井戸はガス透過性培養皿ホルダー、PDMSチップホルダー、ガラス窓ホルダー、および35ミリリットル幅のガラス窓のペアを所有しています。これらのコンポーネントを組み立て、ガス透過性培養皿をクランプするために、適合ねじを使用してください。その後、事前に温めた培養培地を真空チャンバーに移し、20分間脱気する。酸素プラズマシステム内のPDMSチップを30秒間処理し、親水性を維持します。次に、10ミリリットルの脱ガス成長培地でゆっくりと2つの注射器をロードし、残りの2つの注射器は10ミリリットルの脱ガス所望の試薬を含む。例えば、薬物を含むメディアやメディア。各個々のシリンジを23ゲージの分配針によって50センチメートルの管に1つの中空の鋼鉄ピンに接続する。中空のスチールピンをチューブの反対側に挿入します。チューブにメディアを押し込んでチューブを盛り付け、キャップレイヤを通して各PDMSチップにスチールピンを挿入します。貯留層を満たし、PDMSパターン層を媒体で濡らします。リザーバ層は、オンチップバブルトラップとして機能し、気泡がマイクロ流体パターンに入るのを防ぎます。その後、培養培地で1ミリリットルの注射器をロードします。23ゲージの分配針で5センチメートルのチューブに注射器を1つの中空のスチールピンに接続します。中空のスチールピンをチューブの反対側に挿入し、チューブを盛り付けます。後で過剰なメディアを抽出するために、チップの中心穴に中空のスチールピンを挿入します。フォワードデッキにチップあたり2つの10ミリリットルのシリンジをロードし、他の2つのシリンジをシリンジシステムの引き出しデッキに置きます。マイクロ流体パターンにマイクロバブルを包み込まないようにするために、あらかじめ温め、脱ガスした培地の1ミリリットルを35ミリリットルの深気透過培養皿に分配する。チップを気体透過培養膜の上に直接配置し、チップが15度の傾斜角で液体表面に近づきます。PDMSチップホルダーでPDMSチップをクランプし、PDMSデバイスを下に押します。PDMSデバイスの上にシーラーのシートをテープし、PDMSチップホルダーでクランプして、チップが乾燥するのを防ぎます。アレイ周辺のメディアの流量を1時間あたり20マイクロリットルに設定します。逆顕微鏡の電動ステージ上のステージインキュベーターにプレート全体を配置します。ガスチューブを通してガス供給システムをガスチャネルに接続し、ゲージ圧力を0.2 PSIに維持します。これは、装置のシールを確実にするために設置PDMSチップに対してガス透過性培養膜を加圧する。センターホールから1ミリリットルのシリンジを使用して、チップ内の過剰な媒体をゆっくりと抽出します。培地を抽出しながら顕微鏡でチップを観察し、チップが密封されたら抽出を停止します。ステージ上のインキュベーターの温度センシングユニットを3つのウェルプレートに接続し、摂氏37度に設定します。本研究では、外部応力の存在なしに進化促進器で培養されたPC3は、整列しながら成長曲線を持っていた。チップ全体の位置の関数としての細胞増殖プロファイルの同一性を示唆する。曲線の初期傾斜は、増殖速度を明らかにします。デバイス内の細胞の倍時間は約24時間です。PC3-EMTとPC3-Epi細胞を発現するmCherryを発現するGFPは、進化促進剤において共培養した。40%の合流から始めて、コカルチャーは3日以内に40%コンフルエントに成長した。一方、全合流の成長曲線は、ロジスティック成長モデルの形で。PC3-EMTの人口は拡大を続け、PC3-Epiは漸近期で抑制された。PC3-EpiおよびPC3-EMT細胞は、装置の中央に密着し、空の領域に向かって自由に移動させられた。両方の形型の速度の正規化されたヒストグラムは、PC3-EMTの速度がPC3-Epiより1.8倍有意に高かったことを示す。培養培地を事前に温め、ガスを脱熱する必要がある一方で、マイクロバブルを何としても作らないようにすることは非常に重要です。PDMSチップは適切に濡れ、穏やかに取り扱う必要があります。当社の圧力シール方法のソフト再シールの性質により、多くの下流実験が前もって形成することができます。非臨床集団抽出、局所代謝産物分析、空間的に解決された免疫蛍光およびシーケンシングなど。当社の技術は、複雑なスーパーマイクロ環境で主要なコンポーネントと相互作用を包括的に再現する方法を実証しています。定量的で信頼性が高く、再現性の高いデータを提供できるシンプルさ。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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