Name: generation of heterogeneous drug gradients across cancer populations on a microfluidic evolution accelerator for real-time observation
Uploaded: 2019-09-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Heterogeneous Drug Gradients Across Cancer Populations on a Microfluidic Evolution Accelerator for Real-Time Observation at JoVE.com

이 작품은 NSF PHY-1659940에 의해 지원되었다.

1. 미세 유체 장치의 제조
<ol><li>레이아웃 설계 소프트웨어를 사용하여 원하는 미세 유체 패턴을 생성합니다(보충 재료참조).</li>
	<li>포토 마스크를 제작합니다. 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.<ol>
<li>레이저 라이터를 활용하여 100 nm의 Cr과 500 nm의 포토 레지스트 AZ1518로 코팅 된 소다 라임 유리 판에 패턴을 작성합니다.</li>
		<li>60s에 대한 개발자 AZ300MIF와 포토 레...

<ol>
	<li>Meacham, C. E., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+heterogeneity+and+cancer+cell+plasticity.">Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity.</a> Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).</li><li>Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+microenvironment+and+its+role+in+promoting+tumor+growth.">The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth.</a> Oncogene. 27 (45), 5904-5912 (2008).</li><li>Lambert, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analogy+between+the+evolution+of+drug+resistance+in+bacterial+communities+and+malignant+tissues.">An analogy between the evolution of drug resistance in bacterial communities and malignant tissues.</a> Nature Reviews Cancer. 11 (5), 375-382 (2011).</li><li>Tannock, I. F., Lee, C. M., Tunggal, J. K., Cowan, D. S., Egorin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limited+penetration+of+anticancer+drugs+through+tumor+tissue:+a+potential+cause+of+resistance+of+solid+tumors+to+chemotherapy.">Limited penetration of anticancer drugs through tumor tissue: a potential cause of resistance of solid tumors to chemotherapy.</a> Clinical Cancer Research. 8 (3), 878-884 (2002).</li><li>Grantab, R. H., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Penetration+of+anticancer+drugs+through+tumour+tissue+as+a+function+of+cellular+packing+density+and+interstitial+fluid+pressure+and+its+modification+by+bortezomib.">Penetration of anticancer drugs through tumour tissue as a function of cellular packing density and interstitial fluid pressure and its modification by bortezomib.</a> BMC Cancer. 12, 214 (2012).</li><li>Fu, F., Nowak, M. A., Bonhoeffer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+Heterogeneity+in+Drug+Concentrations+Can+Facilitate+the+Emergence+of+Resistance+to+Cancer+Therapy.">Spatial Heterogeneity in Drug Concentrations Can Facilitate the Emergence of Resistance to Cancer Therapy.</a> PLoS Computational Biology. 11 (3), e1004142 (2015).</li><li>Bogorad, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+microvessel+models.">In vitro microvessel models.</a> Lab on a Chip. 15 (22), 4242-4255 (2015).</li><li>Caballero, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-on-chip+models+of+cancer+metastasis+for+future+personalized+medicine:+From+chip+to+the+patient.">Organ-on-chip models of cancer metastasis for future personalized medicine: From chip to the patient.</a> Biomaterials. 149, 98-115 (2017).</li><li>Caballero, D., Blackburn, S. M., De Pablo, M., Samitier, J., Albertazzi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-vessel-on-a-chip+models+for+drug+delivery.">Tumour-vessel-on-a-chip models for drug delivery.</a> Lab on a Chip. 17 (22), 3760-3771 (2017).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acceleration+of+emergence+of+bacterial+antibiotic+resistance+in+connected+microenvironments.">Acceleration of emergence of bacterial antibiotic resistance in connected microenvironments.</a> Science. 333 (6050), 1764-1767 (2011).</li><li>Wu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ancient+hot+and+cold+genes+and+chemotherapy+resistance+emergence.">Ancient hot and cold genes and chemotherapy resistance emergence.</a> Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10467-10472 (2015).</li><li>Lin, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+and+mesenchymal+prostate+cancer+cell+population+dynamics+on+a+complex+drug+landscape.">Epithelial and mesenchymal prostate cancer cell population dynamics on a complex drug landscape.</a> Convergent Science Physical Oncology. 3 (4), 045001 (2017).</li><li>Lin, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+heterogeneous+environment+and+docetaxel+gradient+in+the+emergence+of+polyploid,+mesenchymal+and+resistant+prostate+cancer+cells.">The role of heterogeneous environment and docetaxel gradient in the emergence of polyploid, mesenchymal and resistant prostate cancer cells.</a> Clinical &amp; Experimental Metastasis. 36 (2), 97-108 (2019).</li><li>Roca, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factors+OVOL1+and+OVOL2+induce+the+mesenchymal+to+epithelial+transition+in+human+cancer.">Transcription factors OVOL1 and OVOL2 induce the mesenchymal to epithelial transition in human cancer.</a> PloS One. 8 (10), e76773 (2013).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Tinevez, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trackmate:+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking.">Trackmate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li><li>Caballero, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-on-chip+models+of+cancer+metastasis+for+future+personalized+medicine:+From+chip+to+the+patient.">Organ-on-chip models of cancer metastasis for future personalized medicine: From chip to the patient.</a> Biomaterials. 149, 98-115 (2017).</li><li>Akhtar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+flaws+and+human+harms+of+animal+experimentation.">The flaws and human harms of animal experimentation.</a> Cambridge Quarterly of Healthcare Ethics. 24 (4), 407-419 (2015).</li><li>Sontheimer-Phelps, A., Hassell, B. A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+cancer+in+microfluidic+human+organs-on-chips.">Modelling cancer in microfluidic human organs-on-chips.</a> Nature Reviews Cancer. 19 (2), 65-81 (2019).</li><li>Bogorad, M. I., DeStefano, J., Karlsson, J., Wong, A. D., Gerecht, S., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+in+vitro+microvessel+models.">Review: in vitro microvessel models.</a> Lab on a Chip. 15, 4242-4255 (2015).</li><li>Za&#241;udo, J. G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+control+of+cellular+decision-making+networks+in+the+epithelial-to-mesenchymal+transition.">Towards control of cellular decision-making networks in the epithelial-to-mesenchymal transition.</a> Physical Biology. 16 (3), 031002 (2019).</li><li>Morris, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+population+solitary+waves+can+defeat+rings+of+funnels.">Bacterial population solitary waves can defeat rings of funnels.</a> New Journal of Physics. 19 (3), 035002 (2017).</li></ol>

종래의 세포 배양은 거의 100년 전에 개발되었으며, 암17에서임상 결과를 예측하는 능력이 제한적이라는 입증된 능력에도 불구하고 생물의학 연구에서 가장 자주 사용되는 전임상 모델로 남아 있다. 동물 모델은 인간에게 가장 높은 생리학적 관련성 및 합리적인 유전적 유사성을 제공하지만, 인간의 결과를 예측하는 데 상당한 한계가 있다고 오랫동안 인정되어 왔다<sup class="xref"...

암은 돌연변이 된 세포 집단의 지속적인 dysregulation뿐만 아니라 암세포와 숙주 미세 환경 사이의 중요한 상호 작용에 의존하는 복잡한 생태계로 점점 인식되고 있습니다. 이러한 의미에서, 암은 다양한 숙주 세포와의 이기종 종양 미세 환경 및 누화를 포함한 요인의 조합에 의해 나타나는 적응형 풍경에서 진화하며, 이 모두는 추가 유전적 또는 또는 후성 유전학 변경1,2,3. 고형 종양의 맥락에서, 화학요법 및 그밖 자원 구배의 고르지 않은 분포는 그들의 분자 이질성에 기여하고 약 저항의 발달에 있는 역할을 할 수 있습니다, 특정 종양에 증가한 혈관 신생 하위 인구, 심지어 전이4,5,6. 기존의 시험관 내 2D 세포 배양 연구는 대규모의 편리한 실험 능력을 유지하면서 평균 필드, 균일 및 고정 조건을 제공하며, 종종 진정으로 필요한 정확한 공간 및 시간적 환경 제어가 부족합니다. 생체 내 종양 역학에 에뮬레이트합니다. 따라서, 역학 적 스트레스 내에서 약물에 대한 반응뿐만 아니라 암 진행의 더 나은 예측을 위해 약물 개발 파이프 라인에서 동물 모델 이전에 종양 미세 환경을 재현하는 보다 대표적인 ex vivo 모델에 대한 필요성이 있다. 풍경. 미세유체학은 제어 가능한 정량적연구를지원하지 못할 수 있는 2D 세포 배양 연구와 보다 복잡한 생체내 동물 연구 사이의 격차를 해소하기 위해7,8,9로제안되었다.
암 세포 역학을 특성화하는 이상적인 시험관 내 시스템은 종양에서 일어날 수 있는 적응형 세포 반응을 모방하는 이기종 미세 환경을 생성할 수 있을 뿐만 아니라 이러한 역학의 관찰을 허용해야 합니다. 단일 셀 해상도. 이 기사에서는, 우리는 미세 유체 세포 배양 플랫폼, "진화 가속기"라는 PDMS 기반 장치를 설명 (EA), 즉 세포 해상도에서 암 세포 역학의 병렬 체외 연구를 허용 하는 실시간 데이터 수집 몇 주 동안, 문화 풍경에 걸쳐 스트레스의 그라데이션을 안정적으로 유지하면서. 이 플랫폼의 디자인은 메타 인구에서 유기체의 진화 역학을10,11가속화 할 수있는 우리의 이전 작업을 기반으로합니다. 특히, 공간적으로 분리된 집단의 그룹에서 어느 정도 상호작용하는 이질적인 응력 풍경에 노출될 때, 가장 적합한 종은 큰 균일한 집단에 비해 지역 집단에서 더 빨리 지배할 수 있다. 유리한 종은 자원과 공간을 찾기 위해 이웃 의 미생물 서식지로 이동하고, 결국 전체 인구를 지배. 도 1에도시된 바와 같이, 미세유체 EA 칩의 패턴은 (i) 한 쌍의 서펜타인 채널로 구성되어 신선한 배지 순환을 제공하고 화학적 확산을 위한 고정 경계 조건을 구성하고, (ii) 육각형 세포 배양 영역을 구성한다. 109 개의 상호 연결된 육각형 과 24 개의 반 육각 형 챔버가 중앙에 들어 있으며 벌집 구조를 닮았습니다. 칩의 깊이는 100 μm입니다. 미디어 채널 및 세포 배양 영역은 작은 슬릿 (약 15 μm 폭)과 연결되어 직접 적인 배지 흐름과 세포 배양 영역 전반에 걸친 전단 응을 방지하면서도 화학 물질이 작은 슬릿을 통해 확산되고 영양소를 교환 할 수 있습니다. 신진 대사 폐기물 등 화학 그라데이션의 생성은 한 매체 채널이 플루오레세인의 0.1 mM을 포함하고 다른 채널에는 불소가 없는 경우 그림 1B에서입증됩니다. 세포는 가스 투과성 멤브레인상에서 배양되고, 칩에 대한 멤브레인에 대한 양압을 통해 미세 구조에 의해 캡슐화된다. 장치 홀더의 구성 요소는 그림 2에도시되어 있으며, 실험 설정은 도 3에도시되어 있으며, 여기서 배양은 37 °C의 반전된 현미경상에서 유지되고, 상대 습도가 85% 이상이며, 아래 조건부로 조절됩니다. 노르목시아 가스 조성.
이 시스템은 브라이트필드 및 형광 채널을 통해 국부적인 세포 상호 작용에 대한 상세한 관찰을 제공하며 면역 형광, 웨스턴 블롯 또는 질량 분석과 같은 공간적으로 해결된 하류 분석법을 허용합니다. 우리는 이전에 상피 및 중간엽 PC3 전립선 암 세포(12)의 장기 공동 배양뿐만 아니라 약물 내성 폴리 플로이드 거인의 출현에 대한 이 미세 유체 암 온 칩 모델의 원리 증명으로 입증되었습니다. 상피 PC3세포주(13)를이용한 암세포. 우리는 도세탁셀의 스트레스 구배하에서 상피 PC3 및 중간엽 전립선 암 세포의 시공간 역학을 이해하기 위해이 플랫폼의 응용 프로그램을 제시하는 동안, 미세 유체 시스템은 세포주 조합의 모든 조합에 쉽게 적용 될 수있다 및 자원 (즉, 약물, 영양소, 산소) 그라데이션.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL BD Luer-Lok tip syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>14-823-16E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5955</td>
			<td>1x anti-anti</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 300 MIF</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>18441123163</td>
			<td>Photoresist developer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ1518</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>AZ1518</td>
			<td>Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ4330</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>AZ4330</td>
			<td>Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cr Chromium Etchant</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>651826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Life Technologies Corporation</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heidelberg DWL 66+ laserwriter</td>
			<td>Heidelberg Instruments</td>
			<td>DWL66+</td>
			<td>Writing photomask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethyldisilazane (HMDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>379212</td>
			<td>For photoresist adhesion enhancement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hollow steel pins</td>
			<td>New England Small Tube</td>
			<td>NE-1300-01</td>
			<td>&#160;.025 OD .017 ID x .500 long / type 304 WD fullhard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ibidi Heating System, Multi-Well Plates, K-Frame</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10929</td>
			<td>On-stage incubator&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok 23 G dispensing needle</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>75165A684</td>
			<td>To connect syringes and tubings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lumox dish 35</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>94.6077.331</td>
			<td>Gas-permeable cell culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microposit Remover 1165</td>
			<td>Dow Electronic Materials</td>
			<td>Microposit Remover 1165</td>
			<td>Photoresist stripper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microseal B Adhesive Sealer</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>MSB1001</td>
			<td>Adhesive sealer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-Ring (for Lumox plate sealing)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>9452K114</td>
			<td>Dash No. 27; 1-5/16&#34; ID x 1-7/16&#34; OD; Duro 70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-Ring (for bottom glass window sealing)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>9452K74</td>
			<td>Dash No. 20; 7/8&#34; ID x 1&#34; OD; Duro 70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma-Preen Plasma Cleaning/Etching System</td>
			<td>Plasmatic Systems, Inc</td>
			<td>Plasma-Preen</td>
			<td>Oxygen plasma system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Life Technologies Corporation</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Samco RIE800iPB DRIE</td>
			<td>Samco</td>
			<td>RIE800iPB</td>
			<td>Deep reactive-ion etching system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suss MA6 mask aligner</td>
			<td>SUSS MicroTec</td>
			<td>MA6</td>
			<td>Mask aligner&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone Elastomer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9285739</td>
			<td>PDMS elastomer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TePla M4L plasma etcher</td>
			<td>PVA TePla</td>
			<td>M4L</td>
			<td>Plasma etcher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloro-1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl-silane (PFOTS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>448931</td>
			<td>For silicon wafer silanization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon microbore tube (0.020&#34; x 0.060&#34;OD)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-06419-01</td>
			<td>Tubings for media delivery</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of heterogeneous drug gradients across cancer populations on a microfluidic evolution accelerator for real-time observation

기존의 세포 배양은 암에서 임상 결과를 예측하는 입증된 제한된 능력에도 불구하고 가장 자주 사용되는 전임상 모델로 남아 있습니다. 미세 유체 암 온 칩 모델은 지나치게 단순화된 기존의 2D 배양과 보다 복잡한 동물 모델 사이의 격차를 해소하기 위해 제안되었으며, 이는 신뢰할 수 있고 재현 가능한 정량적 결과를 생성하는 능력이 제한적입니다. 여기에서, 우리는 포괄적인 방식으로 복잡한 종양 미세 환경의 중요한 분대를 재현하는 microfluidic 암 온 칩 모형을 제시하고, 그러나 암 역학의 강력한 양적 설명을 제공하기 위하여 충분히 간단합니다. 이 미세 유체 암 온 칩 모델, "진화 가속기," 이질적인 화학 요법 스트레스 풍경을 생성 하는 동안 종양 미세 환경의 상호 연결 된 배열으로 암 세포의 큰 인구를 분해. 약물 구배에 반응하는 암의 진행 및 진화 역학은 몇 주 동안 실시간으로 모니터링할 수 있으며, 수많은 다운스트림 실험은 실험 과정을 통해 촬영된 시간 경과 이미지에 상보적으로 수행될 수 있다.

칩에서 최적의 세포 성장 검증 실험 플랫폼의 주요 목표는 복잡한 종양 미세 환경에서 중요한 구성 요소 와 상호 작용을 포괄적으로 재현하면서도 정량적이고 신뢰할 수 있고 재현 가능한 데이터를 제공하기에 충분합니다. 이 목표는 우리가 물리적 및 생화학적 환경 요인을 완전히 통제할 수 있는 경우에만 달성할 수 있습니다. 우리는 원하지 않는 요인을 ?...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Heterogeneous Drug Gradients Across Cancer Populations on a Microfluidic Evolution Accelerator for Real-Time Observation at JoVE.com

Generation of Heterogeneous Drug Gradients Across Cancer Populations on a Microfluidic Evolution Accelerator for Real-Time Observation

우리는 단일 세포에서 잘 정의 된 환경 조건 내에서 암 역학의 장기 실시간 정량 적 연구를위한 제어 가능한 플랫폼을 제공하는 미세 유체 암 온 칩 모델인 "Evolution Accelerator" 기술을 제시합니다. 수준. 이 기술은 근본적인 연구 또는 전임상 신약 개발을 위한 시험관 내 모델로 작동할 것으로 예상됩니다.

실시간 관찰을 위한 미세 유체 진화 가속기에 암 인구에 걸쳐 이기종 약물 그라데이션의 생성

Conventional cell culture remains the most frequently used preclinical model, despite its proven limited ability to predict clinical results in cancer. ...

우리가 진화 가속기를 호출이 미세 유체 암 온 칩 모델은 단일 세포 수준에서 잘 정의 된 환경 조건 내에서 암 역학의 장기, 실시간 정량적 연구를위한 제어 가능한 플랫폼을 제공합니다. 이 기술은 우리가 종양과 같은 스트레스 풍경 하에서 암의 진화역학을 탐구할 수 있게 합니다. 형태, 인구, 운동성 및 셀룰러 수준에서 시간이 지남에 따라 마이그레이션을 포함한 정보를 제공합니다.잘 통제된 응력 그라데이션 하에서 혼합 종양 집단의 행동을 통제하고 감시하는 기능을 통해 우리의 기술은 전임상 약물 개발을 위한 생리학적으로 관련된 모델을 제시할 수 있습니다. 제시된 압력 밀봉 포장 방법은 또한 주변 가스 조성및 다운스트림 실험 용량의 정교한 조정을 요구하는 다른 미세 유체 시스템에서 구현될 수 있다. 장기적인 실험을 성공적으로 수행하는 열쇠는 신체적, 생화학적으로 안정적인 환경을 확보하는 것입니다.온도, 습도 및 가스 구성을 포함한 요인을 항상 모니터링해야 합니다. 먼저 3D 프린팅 머신에서 동시 가스 투과성 배양 접시를 보관하기에 충분한 플레이트 홀더를 제작합니다. 스크류 드라이버로 사용자 정의 세 개의 잘 샘플 플레이트의 구성 요소를 풀수 있습니다.적어도 1 시간 동안 UV 노출을 통해 성분을 소독하고 멸균 환경에 둡니다. 셀주 파종을 시작하려면 10센티미터 배양 접시에 각 PC3-Epi 또는 PC3-EMT 세포 배양에 5밀리리터의 트립신을 추가하고 섭씨 37도에서 인큐베이터에서 5분 동안 트립시니화를 실행한다. 배양 접시에서 세포를 15 밀리리터 원심분리기 튜브로 옮긴 다음 원심분리기를 150배 g에서 3분간 전달합니다.상부체를 폐기합니다. 15 밀리리터 원심분리기 튜브에서 각 세포 펠릿을 다시 중단하고 혈전계를 사용하여 각 PC3-MP 또는 PC3-EMT의 세포를 계산합니다. 각 세포 유형의 4개에 총 2.5배 10배를 분리한다.두 개의 분리된 세포 유형을 혼합하고 배양 매체의 2밀리리터에 추가합니다. 세포 배양의 2밀리리터를 각각 3개의 가스 투과성 배양 접시에 넣습니다. 세포가 부착할 수 있도록 밤에 37도섭씨에서 인큐베이터에 투과성 가스를 남깁니다.적어도 1시간 동안 자외선 노출을 통해 PDMS 장치를 소독하고 멸균 환경에 둡니다. 이제 이산화탄소와 산소 제어 장치, 가스 펌프, 가스 혼합 챔버, 가습기 또는 버블러, 가스 밸브 3세트 및 압력 게이지로 구성된 가스 공급 시스템을 구축했습니다. 또는 노목시아 조건을 제공하는 가스 공급 시스템을 사용하십시오.혼합 챔버의 상대 습도가 85% 이상으로 증가하여 뚜껑과 하단 플레이트에 대해 별도의 가열 서브 유닛을 37도에 배치하십시오. 다음 날 인큐베이터에서 가스 투과성 배양 접시를 꺼내 상세한 구성 요소가 순서대로 되어 있음을 파악하고, 모든 우물은 가스 투과성 배양 접시 홀더, PDMS 칩 홀더, 유리 창 홀더 및 35 밀리리터 와이드 유리 창을 보유하고 있습니다. 장착 된 나사를 사용하여 이러한 구성 요소를 조립하고 가스 투과성 문화 접시를 고정하십시오.그런 다음 미리 따뜻워진 배양 매체를 진공 챔버로 이송하여 20분 동안 가스를 디가스로 옮김시합니다. 친성 유지를 위해 산소 플라즈마 시스템에서 PDMS 칩을 30초 동안 치료합니다. 다음 로드 두 주사기와 천천히 로드 2 주사기 10 탈 가스 성장 미디어의 밀리리터와 다른 두 주사기와 10 디가스 드 가스 원하는 관심의 시약.예를 들어 약물이 있는 미디어 및 미디어. 각 각 주사기를 50센티미터 튜브에 연결하여 23 게이지 디스펜싱 바늘을 하나의 중공 강철 핀에 넣습니다. 튜브의 다른 쪽 끝에 중공 강철 핀을 삽입합니다.튜브에 미디어를 밀어 튜브를 프라임하 고 캡핑 층을 통해 각 PDMS 칩에 강철 핀을 삽입합니다. 저장소 레이어를 채우고 PDMS 패턴 레이어를 미디어로 적시습니다. 저수지 층은 기포가 미세 유체 패턴으로 유입되는 것을 방지하기 위해 온 칩 버블 트랩으로 작동합니다.그런 다음 문화 매체와 함께 밀리리터 주사기를 1개로드합니다. 주사기를 5센티미터 튜브에 연결하여 23 게이지 디스펜싱 바늘을 하나의 중공 강철 핀에 넣습니다. 튜브의 다른 쪽 끝에 중공 강철 핀을 삽입하고 튜브를 프라임합니다.칩의 중앙 구멍에 중공 스틸 핀을 삽입하여 나중에 과도한 매체를 추출합니다. 전방 데크에 칩 당 2개의 10 밀리리터 주사기를 로드하고 다른 두 주사기를 주사기 시스템의 인출 덱에 놓습니다. 미세 유체 패턴에 마이크로 버블을 포획하지 않도록하기 위해, 35 밀리리터 심층 가스 투과성 배양 접시에 사전 따뜻하게 및 탈가스 매체의 1 밀리리터를 분배합니다.칩이 15도 기울기 각도로 액체 표면에 접근하는 가스 투과성 배양 멤브레인 위에 칩을 직접 배치합니다. PDMS 칩 홀더로 PDMS 칩을 고정하여 PDMS 장치를 아래로 밀어 붙입니다. 칩이 건조되는 것을 방지하기 위해 PDMS 장치 위에 실러 시트를 테이프로 고정하고 PDMS 칩 홀더로 클램프합니다.어레이 주위의 미디어 유량은 시간당 20마이크로리터로 설정합니다. 반전 된 현미경의 전동 단계에 무대 인큐베이터에 전체 플레이트를 배치합니다. 가스 튜브를 통해 가스 공급 시스템을 가스 채널에 연결하고 게이지 압력을 0.2 PSI로 유지합니다.이를 통해 설치된 PDMS 칩에 대한 가스 투과성 배양 멤브레인을 가압하여 장치의 밀봉을 보장합니다. 중앙 구멍에서 밀리리터 주사기를 사용하여 칩에 과도한 미디어를 천천히 추출합니다. 미디어를 추출하는 동안 현미경 아래칩을 관찰한 다음 칩이 밀봉될 때 추출을 중지합니다.무대 위 인큐베이터의 온도 감지 장치를 세 개의 웰 플레이트에 연결하고 섭씨 37도로 설정합니다. 이 연구에서 PC3는 외부 스트레스의 존재없이 진화 가속기에서 배양하면서 성장 곡선을 했다. 칩 을 가로 질러 위치의 함수로 세포 증식 프로파일의 동일성을 제안.곡선의 초기 경사는 확산 속도를 보여줍니다. 장치의 셀에 대한 두 배의 시간은 약 24 시간입니다. PC3-EMT및 mCherry발현PC3-EMT 및 mCherry 발현 PC3-에피 세포 줄 지어 진화 가속기에서 공동 배양되었다.40%의 합류부터 3일 만에 40%의 컨할수 있는 성장률을 기록했다. 총 합류의 성장 곡선은 물류 성장 모델의 형태입니다. PC3-EMT의 인구는 계속 확장되었고 PC3-Epi는 점막 단계에서 억제되었습니다.PC3-Epi 및 PC3-EMT 셀은 장치의 중앙에 조밀하게 앉아 빈 영역으로 자유롭게 이동할 수 있었습니다. 두 표현형의 속도의 정규화된 히스토그램은 PC3-EMT의 속도가 1.8배 인 PC3-Epi보다 현저히 높았다는 것을 보여준다. 문화 매체를 미리 데우고 가스를 해제해야 하는 동안 모든 비용으로 마이크로 버블을 만드는 것을 피하는 것이 매우 중요합니다.PDMS 칩을 제대로 적시고 부드럽게 처리해야합니다. 우리의 압력 밀봉 방법의 부드러운 재 밀봉 특성으로 인해 많은 다운 스트림 실험을 미리 형성 할 수 있습니다. 전임상 인구 추출, 국소 대사산물 분석, 공간적으로 해결된 면역형광 및 시퀀싱과 같은.당사의 기술은 복잡한 초마이크로 환경에서 포괄적인 방식으로 주요 구성 요소와 상호 작용을 재현하는 방법을 보여줍니다. 그러나 정량적이고 신뢰할 수 있으며 재현 가능한 데이터를 제공할 수 있을 만큼 간단합니다.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

모델 및 세포 장벽에 걸쳐 약물 전달 시스템의 전송을 평가하는 방법

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

연구

생체공학

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

강력한, 미세 유체 세포 내 전달 플랫폼으로 휴대 뒤쪽에서

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

미세 유체 제트를 사용하여 지질 이중층 소포 세대

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

멀티 채널 듀얼 전기장 미세 유체 칩을 이용하여 폐암 세포의 Electrotaxis 연구

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

유전자 인코딩 FRET 기반 담즙 산성 센서를 사용하여 세포 내 담즙 산성 역학의 실시간 모니터링

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations

계층화 된 알긴산를 구축 : 이기종 세포 인구의 공동 문화를위한 플랫폼

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential ...

Polydimethylsiloxane-polycarbonate Microfluidic Devices for Cell Migration Studies Under Perpendicular Chemical and Oxygen Gradients

셀 마이그레이션 연구에서 수직 화학 산소 그라디언트에 대한 폴리 디메틸 실록산 - 폴리 카보네이트 미세 유체 장치

This paper reports a microfluidic device made of polydimethylsiloxane (PDMS) with an embedded polycarbonate (PC) thin film to study cell migration under ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

혈소판 수혈 및 지혈을위한 미세 유체 유량 용기 모델은 실시간으로 혈소판 증착 및 섬유소 형성을 측정합니다

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

실시간 3D 단일 입자 추적에 대 한 프로토콜

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

세포질 기계 화학 Epigenetic 한정자를 리디렉션하여 억압 유전자 전사

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...