Name: generation of heterogeneous drug gradients across cancer populations on a microfluidic evolution accelerator for real-time observation
Uploaded: 2019-09-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Heterogeneous Drug Gradients Across Cancer Populations on a Microfluidic Evolution Accelerator for Real-Time Observation at JoVE.com

Bu çalışma NSF PHY-1659940 tarafından desteklenmiştir.

1. Mikroakışkan cihazın imalatı
<ol><li>Bir düzen tasarım yazılımı kullanarak istenilen mikroakışkan deseni oluşturun (Bkz. Ek Malzemeler).</li>
	<li>Fotomaskeyi üret. Daha fazla bilgi için Malzeme Tablosu'na bakın.<ol>
<li>Bir lazer yazar kullanarak, cr 100 nm ve photoresist AZ1518 500 nm ile kaplı bir soda-kireç cam plaka üzerinde desen yazın.</li>
		<li>60 s için geliştirici AZ300MIF ile photoresist geliştirin.</li>
		<li>Cr-7 Krom Etchant kullanarak fotodiren?...

<ol>
	<li>Meacham, C. E., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+heterogeneity+and+cancer+cell+plasticity.">Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity.</a> Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).</li><li>Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+microenvironment+and+its+role+in+promoting+tumor+growth.">The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth.</a> Oncogene. 27 (45), 5904-5912 (2008).</li><li>Lambert, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analogy+between+the+evolution+of+drug+resistance+in+bacterial+communities+and+malignant+tissues.">An analogy between the evolution of drug resistance in bacterial communities and malignant tissues.</a> Nature Reviews Cancer. 11 (5), 375-382 (2011).</li><li>Tannock, I. F., Lee, C. M., Tunggal, J. K., Cowan, D. S., Egorin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limited+penetration+of+anticancer+drugs+through+tumor+tissue:+a+potential+cause+of+resistance+of+solid+tumors+to+chemotherapy.">Limited penetration of anticancer drugs through tumor tissue: a potential cause of resistance of solid tumors to chemotherapy.</a> Clinical Cancer Research. 8 (3), 878-884 (2002).</li><li>Grantab, R. H., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Penetration+of+anticancer+drugs+through+tumour+tissue+as+a+function+of+cellular+packing+density+and+interstitial+fluid+pressure+and+its+modification+by+bortezomib.">Penetration of anticancer drugs through tumour tissue as a function of cellular packing density and interstitial fluid pressure and its modification by bortezomib.</a> BMC Cancer. 12, 214 (2012).</li><li>Fu, F., Nowak, M. A., Bonhoeffer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+Heterogeneity+in+Drug+Concentrations+Can+Facilitate+the+Emergence+of+Resistance+to+Cancer+Therapy.">Spatial Heterogeneity in Drug Concentrations Can Facilitate the Emergence of Resistance to Cancer Therapy.</a> PLoS Computational Biology. 11 (3), e1004142 (2015).</li><li>Bogorad, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+microvessel+models.">In vitro microvessel models.</a> Lab on a Chip. 15 (22), 4242-4255 (2015).</li><li>Caballero, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-on-chip+models+of+cancer+metastasis+for+future+personalized+medicine:+From+chip+to+the+patient.">Organ-on-chip models of cancer metastasis for future personalized medicine: From chip to the patient.</a> Biomaterials. 149, 98-115 (2017).</li><li>Caballero, D., Blackburn, S. M., De Pablo, M., Samitier, J., Albertazzi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-vessel-on-a-chip+models+for+drug+delivery.">Tumour-vessel-on-a-chip models for drug delivery.</a> Lab on a Chip. 17 (22), 3760-3771 (2017).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acceleration+of+emergence+of+bacterial+antibiotic+resistance+in+connected+microenvironments.">Acceleration of emergence of bacterial antibiotic resistance in connected microenvironments.</a> Science. 333 (6050), 1764-1767 (2011).</li><li>Wu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ancient+hot+and+cold+genes+and+chemotherapy+resistance+emergence.">Ancient hot and cold genes and chemotherapy resistance emergence.</a> Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10467-10472 (2015).</li><li>Lin, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+and+mesenchymal+prostate+cancer+cell+population+dynamics+on+a+complex+drug+landscape.">Epithelial and mesenchymal prostate cancer cell population dynamics on a complex drug landscape.</a> Convergent Science Physical Oncology. 3 (4), 045001 (2017).</li><li>Lin, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+heterogeneous+environment+and+docetaxel+gradient+in+the+emergence+of+polyploid,+mesenchymal+and+resistant+prostate+cancer+cells.">The role of heterogeneous environment and docetaxel gradient in the emergence of polyploid, mesenchymal and resistant prostate cancer cells.</a> Clinical &amp; Experimental Metastasis. 36 (2), 97-108 (2019).</li><li>Roca, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factors+OVOL1+and+OVOL2+induce+the+mesenchymal+to+epithelial+transition+in+human+cancer.">Transcription factors OVOL1 and OVOL2 induce the mesenchymal to epithelial transition in human cancer.</a> PloS One. 8 (10), e76773 (2013).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Tinevez, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trackmate:+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking.">Trackmate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li><li>Caballero, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-on-chip+models+of+cancer+metastasis+for+future+personalized+medicine:+From+chip+to+the+patient.">Organ-on-chip models of cancer metastasis for future personalized medicine: From chip to the patient.</a> Biomaterials. 149, 98-115 (2017).</li><li>Akhtar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+flaws+and+human+harms+of+animal+experimentation.">The flaws and human harms of animal experimentation.</a> Cambridge Quarterly of Healthcare Ethics. 24 (4), 407-419 (2015).</li><li>Sontheimer-Phelps, A., Hassell, B. A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+cancer+in+microfluidic+human+organs-on-chips.">Modelling cancer in microfluidic human organs-on-chips.</a> Nature Reviews Cancer. 19 (2), 65-81 (2019).</li><li>Bogorad, M. I., DeStefano, J., Karlsson, J., Wong, A. D., Gerecht, S., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+in+vitro+microvessel+models.">Review: in vitro microvessel models.</a> Lab on a Chip. 15, 4242-4255 (2015).</li><li>Za&#241;udo, J. G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+control+of+cellular+decision-making+networks+in+the+epithelial-to-mesenchymal+transition.">Towards control of cellular decision-making networks in the epithelial-to-mesenchymal transition.</a> Physical Biology. 16 (3), 031002 (2019).</li><li>Morris, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+population+solitary+waves+can+defeat+rings+of+funnels.">Bacterial population solitary waves can defeat rings of funnels.</a> New Journal of Physics. 19 (3), 035002 (2017).</li></ol>

Konvansiyonel hücre kültürü neredeyse bir yüzyıl önce geliştirilen ve biyomedikal araştırmalarda en sık kullanılan preklinik modeli kalır, kanser klinik sonuçları tahmin etmek için kanıtlanmış sınırlı yeteneğine rağmen17. Hayvan modelleri en yüksek fizyolojik alaka ve insanlar için makul genetik benzerlik sunuyoruz, ama uzun insan sonuçları tahmin önemli sınırlamalar olduğu kabul edilmiştir18. Tüm mevcut preklinik modeller arasında, mikroa...

Kanser giderek mutasyona uğramış hücre popülasyonlarının sürekli disregülasyon değil, aynı zamanda kanser hücreleri ve konak mikroçevre arasındaki hayati etkileşimlere bağlıdır karmaşık bir ekosistem olarak kabul edilmiştir. Bu anlamda, kanser, heterojen bir tümör mikroçevre ve konak hücrelerin çeşitli ile crosstalk da dahil olmak üzere faktörlerin bir kombinasyonu ile tezahür adaptif bir manzara üzerinde gelişir, tüm bunlar daha fazla genetik veya daha fazla seçici baskılar katkıda epigenetik değişiklikler1,2,3. Solid tümörler bağlamında, kefireutics ve diğer kaynak gradyanlarının düzensiz dağılımı moleküler heterojenitelerine katkıda bulunur ve ilaç direncigelişiminde rol oynayabilir, belirli tümöre anjiyogenez artmış alt popülasyonlar ve hatta metastaz4,5,6. Konvansiyonel in vitro 2D hücre kültürü çalışmaları, büyük ölçekli, uygun deneysel kapasiteye sahip iken, ortalama alan sağlar, üniforma, ve sabit koşullar, genellikle gerçekten gerekli hassas mekansal ve zamansal çevresel kontrol yoksun in vivo tümör dinamikleri taklit. Bu nedenle, kanser insidansının daha iyi tahmin edilebilmesi ve dinamik stres içindeki ilaçlara verilen tepkilerin daha iyi tahmin edilebilmesi için, ilaç geliştirme boru hattındaki hayvan modellerinden önce tümör mikroçevresini yeniden üretmek için daha fazla temsili ex vivo modeline ihtiyaç vardır. Manzara. Mikroakışkanlar 2D hücre kültürü çalışmaları ve kontrol edilebilir kantitatif çalışmaları desteklemek mümkün olmayabilir vivo hayvan çalışmaları daha karmaşık arasındaki boşluğu köprü önerilmiştir7,8,9.
Kanser hücre dinamiklerini karakterize etmek için ideal bir in vitro sistem, bir tümörde meydana gelen adaptif hücresel yanıtları taklit etmek için heterojen bir mikroortam oluşturma yeteneğine sahip olmalıdır, hem de bu dinamiklerin gözlem için izin tek hücreli çözünürlük. Bu makalede, bir mikroakışkan hücre kültür platformu, bir PDMS tabanlı cihaz "Evrim Hızlandırıcı" (EA), hücresel çözünürlükte kanser hücre dinamikleri paralel in vitro çalışmalar için izin veren bir gerçek zamanlı veri toplama üzerinde hafta ders, stably kültür manzara genelinde stres degradeleri korurken. Bu platformun tasarımı, metapopülasyondaki organizmaların evrimsel dinamiklerinin10,11hızlandırılabildiği önceki çalışmamıza dayanmaktadır. Özellikle, bir düzeyde etkileşim mekansal olarak ayrılmış popülasyonlar bir grup, heterojen bir stres manzara maruz kaldığında, en uygun türler daha hızlı büyük bir tektip nüfus ile karşılaştırıldığında yerel bir popülasyonhakim olabilir. Avantajlı türler daha sonra kaynak ve uzay arayışı içinde komşu mikrohabitatlara göç eder ve sonunda tüm popülasyona hükmeder. Şekil 1'degösterildiği gibi, mikroakışkan EA yongasının deseni (i) taze ortam sirkülasyonu sağlayan ve kimyasal difüzyon için sabit sınır koşulları oluşturan bir çift serpantin kanaldan ve (ii) altıgen hücre kültür bölgesinden oluşur. merkezde 109 birbirine bağlı altıgen ve 24 yarı altıgen odaktan oluşan petek yapısına benzer. Çip 100 μm derinliğindedir. Medya kanalları ve hücre kültürü bölgesi, doğrudan medya akışını ve hücre kültürü alanında ortaya çıkan kesme stresini önleyen küçük kilerek (yaklaşık 15 μm genişliğinde) bağlanır, ancak yine de kimyasalların küçük kerektonlar aracılığıyla dağılmasına ve besin alışverişine izin verir, metabolik atık, vb. Kimyasal degradelerin üretimi Şekil 1B'degösterilmiştir, bir medya kanalı 0.1 mM floresan içerirken diğer kanalfloresan içermez. Hücreler, mikroyapılar tarafından çipe karşı membran üzerindeki pozitif geri basınç yoluyla kapsüllenen, geçirilebilir bir gaz membranı üzerinde kültürlenir. Cihaz tutucunun bileşenleri Şekil 2'degösterilmiştir ve deneysel kurulum Şekil 3'tegösterilmiştir , burada kültür 37 °C'de ters bir mikroskop üzerinde korunur, %85'in üzerinde bağıl nem ile ve normoksia gaz bileşimi.
Bu sistem, brightfield ve floresan kanallar aracılığıyla lokalize hücresel etkileşimlerin ayrıntılı gözlemini sağlar ve immünoffloresan, Batı lekeleri veya kütle spektrometresi gibi mekansal olarak çözülmüş downstream tahlillerine olanak sağlar. Daha önce epitel ve mezenkimal PC3 prostat kanseri hücrelerinin uzun vadeli ortak kültür bu mikroakışkan kanser-on-chip modelinin bir kanıtı olarak göstermiştir12 yanı sıra ilaca dirençli poliploid dev ortaya çıkması epitel PC3 hücre hattı13kullanarak kanser hücreleri . Biz docetaxel bir stres gradyanı altında epitelyal PC3 ve mezenkimal prostat kanseri hücrelerinin spatiotemporal dinamikleri anlamak için bu platformun uygulama sunarken, mikroakışkan sistem kolayca hücre hatlarının herhangi bir kombinasyonu uygulanabilir ve kaynak (yani, ilaç, besin, oksijen) degradeler.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL BD Luer-Lok tip syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>14-823-16E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5955</td>
			<td>1x anti-anti</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 300 MIF</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>18441123163</td>
			<td>Photoresist developer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ1518</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>AZ1518</td>
			<td>Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ4330</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>AZ4330</td>
			<td>Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cr Chromium Etchant</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>651826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Life Technologies Corporation</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heidelberg DWL 66+ laserwriter</td>
			<td>Heidelberg Instruments</td>
			<td>DWL66+</td>
			<td>Writing photomask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethyldisilazane (HMDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>379212</td>
			<td>For photoresist adhesion enhancement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hollow steel pins</td>
			<td>New England Small Tube</td>
			<td>NE-1300-01</td>
			<td>&#160;.025 OD .017 ID x .500 long / type 304 WD fullhard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ibidi Heating System, Multi-Well Plates, K-Frame</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10929</td>
			<td>On-stage incubator&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok 23 G dispensing needle</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>75165A684</td>
			<td>To connect syringes and tubings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lumox dish 35</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>94.6077.331</td>
			<td>Gas-permeable cell culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microposit Remover 1165</td>
			<td>Dow Electronic Materials</td>
			<td>Microposit Remover 1165</td>
			<td>Photoresist stripper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microseal B Adhesive Sealer</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>MSB1001</td>
			<td>Adhesive sealer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-Ring (for Lumox plate sealing)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>9452K114</td>
			<td>Dash No. 27; 1-5/16&#34; ID x 1-7/16&#34; OD; Duro 70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-Ring (for bottom glass window sealing)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>9452K74</td>
			<td>Dash No. 20; 7/8&#34; ID x 1&#34; OD; Duro 70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma-Preen Plasma Cleaning/Etching System</td>
			<td>Plasmatic Systems, Inc</td>
			<td>Plasma-Preen</td>
			<td>Oxygen plasma system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Life Technologies Corporation</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Samco RIE800iPB DRIE</td>
			<td>Samco</td>
			<td>RIE800iPB</td>
			<td>Deep reactive-ion etching system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suss MA6 mask aligner</td>
			<td>SUSS MicroTec</td>
			<td>MA6</td>
			<td>Mask aligner&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone Elastomer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9285739</td>
			<td>PDMS elastomer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TePla M4L plasma etcher</td>
			<td>PVA TePla</td>
			<td>M4L</td>
			<td>Plasma etcher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloro-1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl-silane (PFOTS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>448931</td>
			<td>For silicon wafer silanization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon microbore tube (0.020&#34; x 0.060&#34;OD)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-06419-01</td>
			<td>Tubings for media delivery</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of heterogeneous drug gradients across cancer populations on a microfluidic evolution accelerator for real-time observation

Konvansiyonel hücre kültürü en sık kullanılan preklinik model olmaya devam etmektedir, kanserklinik sonuçları tahmin etmek için kanıtlanmış sınırlı yeteneğine rağmen. Mikroakışkan kanser-on-chip modelleri, güvenilir ve tekrarlanabilir kantitatif sonuçlar üretmek için sınırlı yeteneği olan aşırı basitleştirilmiş konvansiyonel 2D kültürler ve daha karmaşık hayvan modelleri arasındaki boşluğu köprü önerilmiştir. Burada, karmaşık bir tümör mikroortamının temel bileşenlerini kapsamlı bir şekilde üreten, ancak kanser dinamiklerinin sağlam kantitatif açıklamalarını sağlayacak kadar basit olan mikroakışkan kanser-on-chip modelini salıyoruz. Bu mikroakışkan kanser-on-çip modeli, "Evrim Hızlandırıcı," heterojen kemoterapötik stres manzara oluştururken tümör mikroortamların birbirine bağlı bir dizi içine kanser hücrelerinin büyük bir nüfus ayırır. İlerleme ve ilaç gradyan yanıt olarak kanser evrimsel dinamikleri gerçek zamanlı olarak haftalarca izlenebilir, ve çok sayıda downstream deneyler deneyleri boyunca alınan zaman atlamalı görüntüleri tamamlayıcı yapılabilir.

Çipte optimum hücre büyümesinin doğrulanması Deney platformunun temel amacı, karmaşık bir tümör mikroortamında ki temel bileşenleri ve etkileşimleri kapsamlı bir şekilde yeniden üretmektir, ancak nicel, güvenilir ve tekrarlanabilir veriler sağlayacak kadar basittir. Bu amaca ancak fiziksel ve biyokimyasal çevresel faktörlerin tam kontrolü ne olursa olsun ulaşılabiliyor. İstenmeyen faktörleri dışlamalı veya popülasyon davranışlarını do?...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Heterogeneous Drug Gradients Across Cancer Populations on a Microfluidic Evolution Accelerator for Real-Time Observation at JoVE.com

Generation of Heterogeneous Drug Gradients Across Cancer Populations on a Microfluidic Evolution Accelerator for Real-Time Observation

Tek hücreli de iyi tanımlanmış çevre koşulları içinde kanser dinamikleri uzun vadeli gerçek zamanlı kantitatif çalışmalar için kontrol edilebilir bir platform sağlayan bir mikroakışkan kanser-on-çip modeli, "Evrim Hızlandırıcı" teknolojisi saiyoruz Düzey. Bu teknolojinin temel araştırma veya klinik öncesi ilaç geliştirme için bir in vitro model olarak çalışması beklenmektedir.

Gerçek Zamanlı Gözlem için Mikroakışkan Evrim Hızlandırıcı kanser popülasyonları arasında Heterojen İlaç Gradyanların Üretimi

Conventional cell culture remains the most frequently used preclinical model, despite its proven limited ability to predict clinical results in cancer. ...

Evrim hızlandırıcı dediğimiz bu mikroakışkan on-chip modeli, tek bir hücre düzeyinde iyi tanımlanmış çevre koşulları içinde kanser dinamiklerinin uzun vadeli, gerçek zamanlı kantitatif çalışmalar için kontrol edilebilir bir platform sağlar. Bu teknoloji, kanserin evrimsel dinamiklerini tümör benzeri bir stres ortamında araştırmamızı sağlıyor. Morfoloji, popülasyon, hareketlilik ve hücresel düzeyde zaman içinde göç gibi bilgileri sağlar.İyi kontrollü stres gradyanları altında karışık tümör popülasyonlarının davranışlarını kontrol etme ve izleme becerisi ile teknolojimiz klinik öncesi ilaç gelişimi için fizyolojik olarak daha uygun bir model sunabilir. Sunulan basınçlı sızdırmazlık paketleme yöntemi, ortam gazı bileşiminin ve aşağı akım deney kapasitesinin sofistike ayarını gerektiren diğer mikroakışkan sistemlerde de uygulanabilir. Uzun süreli bir deneyi başarıyla gerçekleştirmenin anahtarları, fiziksel ve biyokimyasal olarak istikrarlı bir ortamı güvence altına almaktır.Sıcaklık, nem ve gaz bileşimi gibi faktörler her zaman izlenmelidir. Başlamak için, bir 3D baskı makinesi üzerinde eşzamanlı gaz geçirilebilir kültür yemekleri tutmak için yeterli bir plaka tutucu imal. Vidalı sürücü ile özelleştirilmiş üç iyi örnek plaka bileşenleri sökün.Bileşenleri UV ışınlarıile en az bir saat dezenfekte edin ve steril bir ortamda bırakın. Hücre hattı tohumlama başlatmak için 10 santimetre kültür çanak her PC3-Epi veya PC3-EMT hücre kültürüne trypsin beş mililitre ekleyin ve 37 santigrat derece bir kuvözde beş dakika tripsinizasyon çalıştırın. 15 mililitrelik santrifüj tüpler içine kültür yemekleri hücreleri aktarın ve daha sonra üç dakika boyunca 150 kez g santrifüj.Supernatant atın. 15 mililitrelik santrifüj tüplerinde hücre peletlerinin her birini yeniden askıya alın ve hemositometre kullanarak her PC3-MP veya PC3-EMT'nin hücrelerini sayın. Her hücre türünün dördüne toplam 2,5 kez 10 ayırın.İki yalıtılmış hücre türünü karıştırın ve iki mililitre kültür ortamı ekleyin. Üç gaz geçirbilebilir kültür yemeklerinin her birine hücre kültürünün iki mililitretohum. Hücrelerin bağlanması için gece boyunca 37 santigrat derecede kuvözde geçirilebilecek gazı bırakın.PDMS cihazlarını UV ışınları ile en az bir saat dezenfekte edin ve steril bir ortamda bırakın. Şimdi hem karbondioksit ve oksijen kontrol üniteleri, bir gaz pompası, bir gaz karıştırma odası, bir nemlendirici veya kabarcık, ve gaz vanaları üç ayrı setleri ve basınç göstergeleri oluşan bir gaz besleme sistemi kurmak. Alternatif olarak normoksia koşulu sağlayan bir gaz besleme sistemi kullanın.Karıştırma odasındaki bağıl nem oranının %85'in üzerine çıkarıldığından emin olun, kapak ve alt plaka için ayrı ısıtma alt üniteleri ile 37 derecede sahnede bir kuluçka termal kontrol ünitesi ayarlayın. Ertesi gün kuvözden gaz geçirgen kültür yemekleri çıkarmak ve ayrıntılı bileşenleri sırayla olduğunu belirlemek, Her iyi bir gaz geçirgen kültür çanak tutucu, bir PDMS yonga tutucu, bir cam pencere tutucu ve 35 mililitre genişliğinde cam pencereler bir çift sahiptir. Bu bileşenleri monte etmek ve gaz geçirbilebilir kültür çanak kelepçelemek için donatılmış vidakullanın.Daha sonra önceden ısıtılmış kültür ortamını bir vakum odasına aktarın ve 20 dakika gazdan arındırın. Hidrofililiği korumak için PDMS çipini oksijen plazma sisteminde 30 saniye tedavi edin. Sonraki yük iki şırınga yavaş yavaş 10 mililitre gazsız büyüme ortamı ve diğer iki şırınga ile 10 mililitre gazdan arındırılmış istenilen reaktif ile.Örneğin uyuşturucu ile medya ve medya. Her bir şırıngayı, 23 gauge dağıtım iğnesi ile 50 santimetrelik bir boruya bağlayın. Tüpün diğer ucuna içi boş bir çelik pim takın.Boruyu astarlamak için ortamı boruya bastırın ve çelik pimi kapama katmanı ndan her PDMS yongasına takın. Rezervuar katmanını doldurun ve PDMS desen katmanını ortamla ıslayın. Rezervuar tabakası mikroakışkan desen içine girmesini hava kabarcıkları önlemek için çip kabarcık tuzak olarak çalışır.Sonra kültür medyası ile bir mililitreşşon yükleyin. Şırıngayı, 23 kalibrelik bir dağıtım iğnesi ile beş santimetrelik bir boruya bağlayın. Tüpün diğer ucuna içi boş bir çelik pim takın ve boruyu asal.Daha sonra çıkarılacak aşırı ortam için çipin orta deliğine içi boş çelik pimi yerleştirin. Ön güvertede çip başına iki 10 mililitreşli şırınga yükleyin ve diğer iki şırıngayı şırınga sisteminin geri çekilme güverteye yerleştirin. Mikrokabarcıkları mikroakışkan desene sokmamak için, önceden ısıtılmış ve gazsız ortamlardan bir mililitresini 35 mililitrelik derin gaz geçirilebilir kültür yemeğine dağıtın.Talaşları doğrudan gaz geçirgen kültür membranlarının üzerine yerleştirin, talaş sıvı yüzeye 15 derecelik eğim açısıyla yaklaşır. PDMS yongasını PDMS yonga tutucuyla sıkıştırarak PDMS aygıtını aşağı doğru itin. Çipin kurumasını önlemek için PDMS cihazının üzerine bir fırın ördeği bantlayın ve PDMS yonga tutucusuyla kenetleyin.Dizi nin etrafındaki ortam akış hızını saatte 20 mikrolitre olarak ayarlayın. Tüm plakayı sahnedeki inkübatöre yerleştirin ve ters bir mikroskobun motorlu aşamasına yerleştirin. Gaz besleme sistemini gaz borusu ile gaz kanallarına bağlayın ve gösterge basıncını 0,2 PSI'da koruyun.Bu, cihazın sızdırmazkalmasını sağlamak için gaz geçirilebilir kültür membranını yüklü PDMS yongasına karşı basınçlandırır. Yavaş yavaş orta delikten bir mililitre şırınga kullanarak çip aşırı medya ayıklayın. Ortamı ayıklarken mikroskop altında çipi gözlemleyin ve talaş mühürlendiğinde çıkarmayı bırakın.Sahnedeki inkübatörün sıcaklık algılama ünitesini üç kuyu plakasına bağlayın ve 37 dereceye ayarlayın. Bu çalışmada PC3 dış stres varlığı olmadan bir evrim hızlandırıcı kültürlü hizalanmış iken büyüme eğrileri vardı. Çip boyunca pozisyon fonksiyonu olarak hücre çoğalma profilinin özdeşliğini düşündüren.Eğrilerin ilk eğimi çoğalma oranını ortaya çıkarır. Cihazdaki hücreler için iki katına çıkarma süresi yaklaşık 24 saattir. Pc3-EMT ve mCherry ifade eden GFP pc3-Epi hücre astarlı evrim hızlandırıcı ortak kültürlü edildi.%40'tan başlayarak birliktelik üç gün içinde %40'lık bir büyüme gösterdi. Toplam birleşimin büyüme eğrisi lojistik büyüme modeli şeklinde iken. PC3-EMT nüfusu genişlemeye devam etti ve PC3-Epi asimptotik fazda bastırıldı.PC3-Epi ve PC3-EMT hücreleri yoğun cihazın merkezinde oturuyordu ve boş bölgeye serbestçe göç etmesine izin verildi. Her iki fenotiphızın normalleştirilmiş histogramı PC3-EMT hızının PC3-Epi'den 1.8 kat daha yüksek olduğunu göstermektedir. Kültür medyası önceden ısıtılmalı ve gazdan arındırılmalı.PDMS çipi düzgün bir şekilde ıslanmalıdır ve hafifçe işlenmelidir. Basınç sızdırmazlık yöntemimizin yumuşak yeniden sızdırmazlığı sayesinde birçok alt akım deneyi önceden oluşturulabilir. Subklinik popülasyon ekstraksiyonu, lokal metabolit analizi ve mekansal olarak çözülmüş immünfloresans ve sıralama gibi.Teknolojimiz, karmaşık bir süper mikro ortamda önemli bileşenleri ve etkileşimleri kapsamlı bir şekilde yeniden üretmenin bir yolunu göstermektedir. Ancak nicel, güvenilir ve tekrarlanabilir veriler sağlamak için yeterince basit.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

Modelleri ve Hücresel Engeller Arasında İlaç Taşıyıcı Sistemlerin Transport Değerlendirmesinde Yöntemleri

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Sağlam, mikroakışkan Hücre içi Delivery Platform olarak hücre Sıkma

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Mikroakışkan jeti kullanarak çift katlı lipid Vesikül Üretimi

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

Bir Çok Kanallı Çift elektrik alan mikroakışkan Chip kullanarak Akciğer Kanseri Hücreleri Electrotaxis Çalışmaları

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

Genetik olarak kodlanmış FRET tabanlı Safra Asit Sensor Kullanımı Hücre içi Safra Asit Dynamics Gerçek Zamanlı İzleme

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations

Katmanlı Aljinat Yapıları: Heterojen hücre popülasyonlarının Co-kültür için bir platform

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential ...

Polydimethylsiloxane-polycarbonate Microfluidic Devices for Cell Migration Studies Under Perpendicular Chemical and Oxygen Gradients

Hücre Göç Çalışmaları altında Dik Kimya ve Oksijen Gradyanların için polidimetilsiloksan-polikarbonat mikroakışkan Cihazlar

This paper reports a microfluidic device made of polydimethylsiloxane (PDMS) with an embedded polycarbonate (PC) thin film to study cell migration under ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

Trombosit Transfüzyon ve Hemostaz için bir mikroakışkan Akış Odası Modeli Gerçek zamanlı Trombosit Birikimi ve Fibrin oluşumu Tedbirleri

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Gerçek zamanlı 3D tek parçacık izleme için bir iletişim kuralı

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Kimyasal epigenetik değiştiriciler ile hücresel makine yeniden yönlendirerek Gen transkripsiyonu bastırmak

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...