Name: resolving water, proteins, and lipids from in vivo confocal raman spectra of stratum corneum through a chemometric approach
Uploaded: 2019-09-26T15:00:00
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Die Autoren würdigen die finanzielle Unterstützung durch die Corporate Function Analytical and Personal Cleansing Care Abteilung sehr. Wir möchten uns bei den analytischen Beisitzerinnen Frau Jasmine Wang und Dr. Robb Gardner für ihre Beratung und Unterstützung und Frau Li Yang für ihre Hilfe bei der Datenerhebung bedanken.

Diese Studie wurde vom institutionellen Überprüfungsausschuss des Pekinger Kinderkrankenhauses in Übereinstimmung mit den ethischen Leitlinien der Erklärung von Helsinki von 1975 genehmigt. Es wurde nach DEN ICH-Richtlinien für Gute Klinische Praxis durchgeführt. Die Studie fand von Mai bis Juli 2015 statt.
1. Sammlung von konfokalen Raman-Spektren in vivo von menschlichen Probanden mit atopischer Dermatitis
<ol><li>Beziehen Sie Themen ein, die den folgenden Kriterien entsprechen.<ol>
...

<ol>
	<li>Caspers, P., Lucassen, G., Bruining, H., Puppels, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+depth+-+scanning+confocal+Raman+microspectrometer+for+rapid+in+vivo+determination+of+water+concentration+profiles+in+human+skin.">Automated depth - scanning confocal Raman microspectrometer for rapid in vivo determination of water concentration profiles in human skin.</a> Journal of Raman Spectroscopy. 31 (8-9), 813-818 (2000).</li><li>Crowther, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+effects+of+topical+moisturizers+on+changes+in+stratum+corneum+thickness,+water+gradients+and+hydration+in+vivo.">Measuring the effects of topical moisturizers on changes in stratum corneum thickness, water gradients and hydration in vivo.</a> British Journal of Dermatology. 159 (3), 567-577 (2008).</li><li>Egawa, M., Tagami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+depth+profiles+of+water+and+water-binding+substances+in+the+stratum+corneum+determined+in+vivo+by+Raman+spectroscopy+between+the+cheek+and+volar+forearm+skin:+effects+of+age,+seasonal+changes+and+artificial+forced+hydration.">Comparison of the depth profiles of water and water-binding substances in the stratum corneum determined in vivo by Raman spectroscopy between the cheek and volar forearm skin: effects of age, seasonal changes and artificial forced hydration.</a> British Journal of Dermatology. 158 (2), 251-260 (2008).</li><li>Crowther, J. M., Matts, P. J., Kaczvinsky, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Changes in Stratum Corneum Thickness, Water Gradients and Hydration by Moisturizers. , (2012).</li><li>Pudney, P. D., M&#233;lot, M., Caspers, P. J., Van, D. P. A., Puppels, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+confocal+Raman+study+of+the+delivery+of+trans+retinol+to+the+skin.">An in vivo confocal Raman study of the delivery of trans retinol to the skin.</a> Applied Spectroscopy. 61 (8), 804 (2007).</li><li>Mohammed, D., Matts, P., Hadgraft, J., Lane, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro-in+vivo+correlation+in+skin+permeation.">In vitro-in vivo correlation in skin permeation.</a> Pharmaceutical Research. 31 (2), 394-400 (2014).</li><li>Hanlon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospects+for+in+vivo+Raman+spectroscopy.">Prospects for in vivo Raman spectroscopy.</a> Physics in Medicine and Biology. 45 (2), 1 (2000).</li><li>Mohammed, D., Crowther, J. M., Matts, P. J., Hadgraft, J., Lane, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+niacinamide+containing+formulations+on+the+molecular+and+biophysical+properties+of+the+stratum+corneum.">Influence of niacinamide containing formulations on the molecular and biophysical properties of the stratum corneum.</a> International Journal of Pharmaceutics. 441 (1-2), 192-201 (2013).</li><li>Boireau-Adamezyk, E., Baillet-Guffroy, A., Stamatas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+changes+in+stratum+corneum+barrier+function.">Age-dependent changes in stratum corneum barrier function.</a> Skin Research and Technology. 20 (4), 409-415 (2014).</li><li>Pezzotti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+spectroscopy+of+human+skin:+looking+for+a+quantitative+algorithm+to+reliably+estimate+human+age.">Raman spectroscopy of human skin: looking for a quantitative algorithm to reliably estimate human age.</a> Journal of Biomedical Optics. 20 (6), 065008 (2015).</li><li>Mlitz, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+filaggrin+mutations+on+Raman+spectra+and+biophysical+properties+of+the+stratum+corneum+in+mild+to+moderate+atopic+dermatitis.">Impact of filaggrin mutations on Raman spectra and biophysical properties of the stratum corneum in mild to moderate atopic dermatitis.</a> Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology. 26 (8), 983-990 (2012).</li><li>Janssens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+to+protein+ratio+plays+an+important+role+in+the+skin+barrier+function+in+patients+with+atopic+eczema.">Lipid to protein ratio plays an important role in the skin barrier function in patients with atopic eczema.</a> British Journal of Dermatology. 170 (6), 1248-1255 (2014).</li><li>Faiman, R., Larsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assignment+of+the+C+H+stretching+vibrational+frequencies+in+the+Raman+spectra+of+lipids.">Assignment of the C H stretching vibrational frequencies in the Raman spectra of lipids.</a> Journal of Raman Spectroscopy. 4 (4), 387-394 (1976).</li><li>Edwards, H. G., Farwell, D. W., Williams, A. C., Barry, B. W., Rull, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+spectroscopic+deconvolution+procedure+for+complex+biological+systems:+vibrational+components+in+the+FT-Raman+spectra+of+ice-man+and+contemporary+skin.">Novel spectroscopic deconvolution procedure for complex biological systems: vibrational components in the FT-Raman spectra of ice-man and contemporary skin.</a> Journal of the Chemical Society, Faraday Transactions. 91 (21), 3883-3887 (1995).</li><li>Choe, C., Lademann, J., Darvin, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+organization+and+stratum+corneum+thickness+determined+in+vivo+in+human+skin+analyzing+lipid-keratin+peak+(2820-3030+cm-+1)+using+confocal+Raman+microscopy.">Lipid organization and stratum corneum thickness determined in vivo in human skin analyzing lipid-keratin peak (2820-3030 cm- 1) using confocal Raman microscopy.</a> Journal of Raman Spectroscopy. 47 (11), 1327-1331 (2016).</li><li>Stamatas, G. N., de Sterke, J., Hauser, M., von Stetten, O., van der Pol, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+uptake+and+skin+occlusion+following+topical+application+of+oils+on+adult+and+infant+skin.">Lipid uptake and skin occlusion following topical application of oils on adult and infant skin.</a> Journal of Dermatological Science. 50 (2), 135-142 (2008).</li><li>Choe, C., Lademann, J., Darvin, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+Raman+microscopy+for+investigating+the+penetration+of+various+oils+into+the+human+skin+in+vivo.">Confocal Raman microscopy for investigating the penetration of various oils into the human skin in vivo.</a> Journal of Dermatological Science. , (2015).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+MCR+approach+revealing+protein,+water+and+lipid+depth+profile+in+atopic+dermatitis+patients'+stratum+corneum+via+in+vivo+confocal+Raman+spectroscopy.">A MCR approach revealing protein, water and lipid depth profile in atopic dermatitis patients' stratum corneum via in vivo confocal Raman spectroscopy.</a> Analytical Chemistry. , (2019).</li><li>Caspers, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> In vivo Skin Characterization by Confocal Raman Microspectroscopy. , (2003).</li><li>Jaumot, J., de Juan, A., Tauler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MCR-ALS+GUI+2.0:+New+features+and+applications.">MCR-ALS GUI 2.0: New features and applications.</a> Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 140, 1-12 (2015).</li><li>Choe, C., Choe, S., Schleusener, J., Lademann, J., Darvin, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+normalization+method+in+in+vivo+stratum+corneum+analysis+using+confocal+Raman+microscopy+to+compensate+nonhomogeneous+distribution+of+keratin.">Modified normalization method in in vivo stratum corneum analysis using confocal Raman microscopy to compensate nonhomogeneous distribution of keratin.</a> Journal of Raman Spectroscopy. , (2019).</li><li>Wise, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemometrics+tutorial+for+PLS_Toolbox+and+Solo.">Chemometrics tutorial for PLS_Toolbox and Solo.</a> Eigenvector Research, Inc. 3905, 102-159 (2006).</li></ol>

Während der Datenerfassung, wie in Abschnitt 2 und 3 des Protokolls beschrieben, wurde jedes Tiefenprofil in einem Bereich mit Kontakt zwischen dem Instrumentenfenster und der Haut gesammelt, indem die dunkleren Bereiche aus den mikroskopischen Bildern gefunden wurden, die in den roten Kreisen in Abbildung 2C. Sobald diese Bereiche lokalisiert wurden, war es wichtig, das Tiefenprofil über der Hautoberfläche zu starten, um die Position der Hautoberfläche für das Datenan...

In klinischen Studien hat die konfokale Raman-Spektroskopie in vivo ihre einzigartige Fähigkeit zur Bestimmung der Dicke des Stratum corneum und des Wassergehalts1,2,3,4, und die Verfolgung der Penetration von aktive Materialien topisch auf die Haut aufgetragen5,6. Als nichtinvasiver Ansatz erkennt die konfokale Raman-Spektroskopie molekulare Signale basierend auf Schwingungsmodi. Daher ist eine Kennzeichnung nicht erforderlich7. Die konfokale Raman-Spektroskopie in vivo liefert chemische Informationen mit Tiefenauflösung, die auf der konfokalen Natur der Technik basieren. Diese tiefenabhängigen Informationen sind sehr nützlich bei der Untersuchung der Auswirkungen von Hautpflegeprodukten4,8, Alterung9,10, saisonale Veränderungen3, sowie Hautbarriere Funktionskrankheiten, wie atopische Dermatitis11,12. Es gibt viele Informationen im hochfrequenten Bereich der konfokalen Raman-Spektroskopie (2.500–4.000 cm-1), wo Wasser in der Region zwischen 3.250–3.550 cm-1unterschiedliche Spitzen erzeugt. Die Raman-Spitzen von Proteinen und Lipiden, die zwischen ca. 2.800–3.000 cm-1zentriert sind, überlappen sich jedoch, da die Signale hauptsächlich aus Methylen (-CH2-) und Methyl (-CH3) Gruppen13 . Diese überlappenden Informationen stellen eine technische Herausforderung dar, wenn relativ viele einzelne molekulare Arten erhalten werden. Peak Fitting14,15 und selektive Spitzenposition12,16 Ansätze wurden verwendet, um diese Herausforderung zu lösen. Für diese auf einzelnen Spitzen basierenden Methoden ist es jedoch schwierig, reine Komponenteninformationen zu extrahieren, da mehrere Raman-Spitzen aus derselben Komponente gleichzeitig ändern17. In unserer jüngsten Veröffentlichung18wurde ein MCR-Ansatz vorgeschlagen, um die reinen Komponenteninformationen aufzuklären. Mit diesem Ansatz wurden drei Komponenten (Wasser, Proteine und Lipide) aus einem großen in vivo konfokalen Raman spektroskopischen Datensatz extrahiert.
Die Durchführung großer klinischer Studien kann für Personen, die spektroskopische Daten in vivo sammeln, anspruchsvoll sein. In einigen Fällen kann die spektrale Erfassung Eine Betriebsausrüstung für viele Stunden an einem Tag erfordern und die Studie kann sich bis zu Wochen oder Monate erstrecken. Unter diesen Bedingungen können spektroskopische Daten von Gerätebetreibern generiert werden, denen das technische Know-how fehlt, um alle Quellen spektroskopischer Artefakte zu identifizieren, auszuschließen und zu korrigieren. Der resultierende Datensatz kann einen kleinen Bruchteil spektroskopischer Ausreißer enthalten, die vor der Analyse identifiziert und aus den Daten ausgeschlossen werden müssen. Dieses Papier veranschaulicht detailliert einen chemometrischen Analyseprozess, um ein klinisches Raman-Dataset zu "bereinigen", bevor die Daten mit MCR analysiert werden. Um die Ausreißer erfolgreich zu entfernen, müssen die Arten von Ausreißern und die mögliche Ursache für die Erzeugung der Ausreißerspektren identifiziert werden. Dann kann ein spezifischer Ansatz entwickelt werden, um die gezielten Ausreißer zu entfernen. Dies erfordert Vorkenntnisse des Datensatzes, einschließlich eines detaillierten Verständnisses des Datengenerierungsprozesses und des Studiendesigns. In diesem Datensatz sind die meisten Ausreißer niedrige Signal-Rausch-Spektren und stammen hauptsächlich aus 1) Spektren, die über der Hautoberfläche gesammelt wurden (6.208 von 30.862), und 2) starkem Beitrag zum Spektrum von fluoreszierendem Raumlicht (67 von 30.862). Spektren, die über der Hautoberfläche gesammelt werden, erzeugen eine schwache Raman-Reaktion, da sich der Laserfokus der Hautoberfläche nähert und sich meist im Instrumentenfenster unter der Haut befindet. Spektren mit einem starken Beitrag von fluoreszierendem Raumlicht werden entweder durch Fehler des Gerätebedieners oder durch Subjektbewegung erzeugt, wodurch ein Zustand entsteht, in dem das konfokale Raman-Sammelfenster nicht vollständig von der Körperseite des Motivs abgedeckt ist. Obwohl diese Arten von Spektralartefakten während der spektralen Erfassung durch einen spektroskopischen Sachverständigen zum Zeitpunkt der Datenerfassung identifiziert und behoben werden konnten, wurden die in dieser Studie verwendeten geschulten Instrumentenbetreiber angewiesen, alle Daten zu sammeln, es sei denn, katastrophales Versagen beobachtet wurde. Die Aufgabe, Ausreißer zu identifizieren und auszuschließen, wird in das Datenanalyseprotokoll integriert. Das vorgelegte Protokoll wurde entwickelt, um diese Herausforderung zu lösen. Um die schwachen Signal-Rausch-Spektren über der Hautoberfläche zu adressieren, muss zuerst die Lage der Hautoberfläche bestimmt werden, um die Entfernung von Spektren zu ermöglichen, die über der Hautoberfläche gesammelt wurden. Die Lage der Hautoberfläche ist definiert als die Tiefe, in der der Raman-Laserfokusdierpunkt zur Hälfte in der Haut und zur Hälfte aus der Haut heraus ist, wie in Der Ergänzungsfigur 1dargestellt. Nach dem Entfernen von schwachen Signal-Rausch-Spektren wird eine Hauptkomponentenanalyse (PCA) implementiert, um den Faktor zu extrahieren, der von fluoreszierenden Raumlichtspitzen dominiert wird. Diese Ausreißer werden basierend auf dem Score-Wert des entsprechenden Faktors entfernt.
Dieses Protokoll enthält detaillierte Informationen darüber, wie sechs Hauptkomponenten im MCR-Prozess bestimmt werden. Dies geschieht durch eine PCA-Analyse, gefolgt von einem spektralen Formvergleich zwischen den Belastungen für Modelle, die mit einer anderen Anzahl von Hauptkomponenten generiert wurden. Auch das experimentelle Verfahren zur Datenerfassung von Referenzmaterialien sowie den menschlichen Probanden wird ausführlich erläutert.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1055px;" width="1054">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:34px;width:319px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:360px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:240px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:360px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Cholesterol 3-sulfate sodium</td>
			<td style="width:360px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">D-Erythro-Dihydrosphingosine</td>
			<td style="width:360px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">DI water</td>
			<td style="width:360px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>Purified with Milipore(18.2M&#937;)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Gen2-SCA skin analyzer</td>
			<td style="width:360px;">River Diagnostics, Rotterdam, The Netherlands</td>
			<td style="width:136px;">Gen2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Matlab 2018b</td>
			<td style="width:360px;">Mathwork</td>
			<td style="width:136px;">2018b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">N-behenoyl-D-erythro-sphingosine</td>
			<td style="width:360px;">Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:319px;">N-Lignoceroyl-D-erythro-sphinganine(ceramide)</td>
			<td style="width:360px;">Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Oleic Acid</td>
			<td style="width:360px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Palmitic Acid</td>
			<td style="width:360px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Palmitoleic Acid</td>
			<td style="width:360px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">PLS_Toolbox version 8.2</td>
			<td style="width:360px;">Eigenvector Research Inc.</td>
			<td align="right" style="width:136px;">8.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">RiverICon</td>
			<td style="width:360px;">River Diagnostics, Rotterdam, The Netherlands</td>
			<td style="width:136px;">version 3.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Squalene</td>
			<td style="width:360px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Stearic Acid</td>
			<td style="width:360px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

resolving water, proteins, and lipids from in vivo confocal raman spectra of stratum corneum through a chemometric approach

Die Entwicklung dieser in vivo konfokalen Raman spektroskopischen Methode ermöglicht die direkte Messung von Wasser, Proteinen und Lipiden mit Tiefenauflösung bei menschlichen Probanden. Diese Informationen sind sehr wichtig für hautbedingte Erkrankungen und die Charakterisierung der Leistung von Hautpflegeprodukten. Dieses Protokoll veranschaulicht eine Methode zur konfokalen Raman-Spektrensammlung und die anschließende Analyse des Spektraldatensatzes unter Nutzung von Chemometrie. Ziel dieser Methode ist es, ein Standardprotokoll für die Datenerfassung zu erstellen und allgemeine Anleitungen für die Datenanalyse bereitzustellen. Die Vorverarbeitung (z. B. Entfernung von Ausreißerspektren) ist ein entscheidender Schritt bei der Verarbeitung großer Datensätze aus klinischen Studien. Als Beispiel bieten wir Anleitungen, die auf Vorkenntnissen eines Datasets basieren, um die Arten von Ausreißern zu identifizieren und spezifische Strategien zu ihrer Entfernung zu entwickeln. Es wird eine Hauptkomponentenanalyse durchgeführt, und die Belastungsspektren werden mit Spektren aus Referenzmaterialien verglichen, um die Anzahl der Komponenten auszuwählen, die bei der abschließenden Multivariaten-Kurvenauflösungsanalyse (MCR) verwendet werden. Dieser Ansatz ist erfolgreich, um aussagekräftige Informationen aus einem großen Spektraldatensatz zu extrahieren.

In dieser klinischen Studie wurden in vivo konfokale Raman-Spektren von 28 Probanden im Alter von 4 bis 18 Jahren gesammelt. Insgesamt wurden 30.862 Raman-Spektren mit dem oben erwähnten Datenerfassungsprotokoll gesammelt. Dieser große Spektraldatensatz enthält 20 % Spektralausreißer, wie in Abbildung 4Adargestellt. Die schwachen Signal-Rausch-Ausreißerspektren wurden nach der Bestimmung der Hautoberfläche entfernt, gefolgt vom PCA, um die Spektren mit Raumlichtmerkmalen zu identif...

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Resolving Water, Proteins, and Lipids from In Vivo Confocal Raman Spectra of Stratum Corneum through a Chemometric Approach

Hier stellen wir ein Protokoll zur Sammlung konfokaler Raman-Spektren von menschlichen Probanden in klinischen Studien in Kombination mit chemometrischen Ansätzen zur Spektralausreißerentfernung und der anschließenden Extraktion von Schlüsselmerkmalen vor.

Auflösen von Wasser, Proteinen und Lipiden aus In Vivo konfokale Raman Spectra von Stratum Corneum durch einen chemometrischen Ansatz

Development of this in vivo confocal Raman spectroscopic method enables the direct measurement of water, proteins, and lipids with depth resolution in ...

Die direkte Messung von Wasser, Proteinen und Lipiden mit Tiefenauflösung bei Menschen ist sehr wichtig für hautbedingte Erkrankungen, für die Charakterisierung der Leistung von Hautpflegeprodukten. Diese Methode nutzt zusammen mit der anschließenden Analyse Chemometrie, um chemische Informationen zu extrahieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass der klinische Raman-Datensatz von geschulten Instrumentenbedienern gesammelt werden kann, denen es an technischem Know-how fehlt, um alle Quellen spektroskopischer Artefakte zu identifizieren, auszuschließen und zu beheben.Der resultierende Datensatz kann dann verarbeitet werden, um Ausreißer zu identifizieren, die aus dem Datum vor der Analyse ausgeschlossen werden müssen. Eine zentrale Herausforderung bei der Datenanalyse ist das Entfernen der Ausreißer und die Identifizierung der Anzahl der Schlüsselkomponenten im Datensatz. Der Ansatz zeigt in diesem Video, dass Vorkenntnisse über den klinischen Datensatz und den Chemometrie-Ansatz genutzt werden, um Wasser, Protein und Lipid mit Tiefenauflösung erfolgreich zu extrahieren.Demonstriert wird das Verfahren von Li Yang, Techniker aus unserem C&T-Labor. Lassen Sie den Gegenstand zunächst eine markierte Läsionskörperstelle oder Kontrollstelle in engem Kontakt mit dem bildgebenden Fenster des in vivo konfokalen Raman-Instruments platzieren. Achten Sie darauf, dass sie das gesamte Fenster abdecken, um die Auswirkungen von Raumlicht auf die Bildgebung zu vermeiden.Öffnen Sie dann die Software und verschieben Sie den Fokus, bis ein Spektrum ähnlich dem hier gezeigten zu sehen ist. Danach bewegen Sie den Fokus 10 Mikrometer von der Hautoberfläche weg. Sammeln Sie Daten für 26 Schritte mit einer Zwei-Mikron-Schrittgröße in dem hier gezeigten Frequenzbereich mit einer Belichtungszeit von einer Sekunde.Messen Sie acht Replikationen für jeden Bereich, die insgesamt bis zu 15 Minuten dauern. Verwenden Sie zunächst das Befehlsfenster und MATLAB, um die Dateierweiterung der gesammelten Daten von ric in mat zu ändern. Laden Sie dann die Mattendatei auf die MATLAB-Softwareplattform, wie hier gezeigt.Korrigieren Sie die Basislinie des Datensatzes mit der Methode der automatischen gewichteten kleinsten Quadrate, indem Sie in das PLS_Workspace-Fenster gehen und mit der rechten Maustaste auf den importierten Datensatz klicken, zu Analysieren scrollen, Andere Tools auswählen und auf Vorverarbeitung klicken. Klicken Sie in dem Fenster, das angezeigt wird, auf Anzeigen. Scrollen Sie dann auf der Symbolleiste Verfügbare Methoden nach unten zur Filterung automatisch gewichteter Geleaster Quadrate, und wählen Sie Hinzufügen aus.Klicken Sie als Nächstes auf OK, um die Optionen festzulegen und die Vorverarbeitung auf die Daten anzuwenden. Speichern Sie dies als Spectra_baseline. Kehren Sie als Nächstes zum Befehlsfenster zurück, und ersetzen Sie die Daten durch das korrigierte Basisergebnis.Gehen Sie nun zum Texteditor und führen Sie das Programm wie hier gezeigt aus. Dadurch werden die Werte zwischen 2910 und 2965 inversen Zentimetern zusammengefasst, um die Intensitätswerte unter jedem Raman-Spektrum aus der Messung von 26 aufeinanderfolgenden Schritten zu erhalten und sie in einer Excel-Datei zu speichern. Wechseln Sie in MATLAB zum Arbeitsbereich, und legen Sie den Pfad für die Daten in Depth_save fest, wie gezeigt.Verwenden Sie als Nächstes den hier beschriebenen Prozess, um den Instrumentenversatzwert von 26 bis 260 mithilfe der linspace-Funktion in MATLAB zu interpolieren. Dieser Prozess interpoliert den Intensitätswert von 26 bis 260 mithilfe der Spline-Methode und nutzt die neu generierten 260 Positionswerte. Darüber hinaus werden die 260 Positions- und Intensitätswerte als x- und y-Eingänge für die Polyfit-Funktion verwendet, wodurch der Gradwert auf 20 gesetzt wird.Anschließend werden die Ausgangskoeffizienten und die 260 erweiterten Positionswerte als Eingang für Polyval verwendet, um die endgültigen 260 Intensitätswerte zu erhalten. Als Nächstes berechnet er die mittlere Intensität und findet den Punkt in der Kurve, der der mittleren Intensität am nächsten ist. Es wird auch den Tiefenwert entsprechend der Hautoberfläche ändern, in der bekannten Zwei-Mikron-Schrittgröße.Führen Sie nun das Programm aus. Laden Sie den Raman-Spektren-Datensatz nach dem Entfernen der äußeren Hautspektren in die PLS_Toolbox-Software, unter der MATLAB-Plattform und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Datensatz, um Analysieren und dann PCA auszuwählen. Klicken Sie als Nächstes auf Vorverarbeitung auswählen.Wählen Sie Normalisieren als Vorverarbeitungsansatz aus. Wählen Sie dann keine für die Kreuzvalidierung aus. Erstellen Sie dann das Modell unter Verwendung der drei Komponenten für die PCA-Zerlegungsanalyse.Entfernen Sie nun die Abdeckung auf dem In-vivo-Fenster zur Sammlung von Ramen-Instrumenten, und erfassen Sie die Raumlichtspektren im Hochfrequenzbereich mit den gleichen Parametern, die für die Datensammlung des Referenzmaterials verwendet werden. Identifizieren Sie den Raumlichteffektfaktor durch Vergleich mit dem Raumlichthintergrund. Überprüfen Sie nun die Ergebnisse und entfernen Sie die Spektren mit dem deutlich höheren entsprechenden Score-Wert als normal.Dies bedeutet, dass Score-Werte von mehr als 99,8 % des gesamten Datensatzes entfernt werden, was 0,16 in dieser Studie entspricht. Speichern Sie die resultierenden X-Block-Daten der Kalibrierung. Gehen Sie schließlich zum PLS_Workspace Browser und bearbeiten Sie die neue Datei.Wählen Sie die Zeilenbeschriftungen aus, und gehen Sie zu Hard Delete Excluded, um die ausgeschlossenen Daten vor dem erneuten Speichern der Datei dauerhaft zu löschen. Beginnen Sie, indem Sie die Raman-Spektren-Baseline mit der gleichen gerade gezeigt korrigiert. Führen Sie als Nächstes die PCA-Analyse für den vorverarbeiteten Datensatz durch.Zeichnen Sie die Eigenwerte in logarithmischer Skala zusammen mit der Anzahl der Komponenten, indem Sie auf die Schaltfläche Komponente auswählen klicken, und wählen Sie log(eigenvalues) als y-Wert aus. Um eine multivariate Kurvenauflösungsanalyse durchzuführen, verwenden Sie zunächst die Datenauswahltaste, um den Datensatz in die MCR_main-Software zu laden. Wählen Sie manuell die Anzahl der Komponenten aus, und legen Sie die Komponentennummer zwischen drei und acht fest.Klicken Sie dann unter der Registerkarte Erste Schätzung auf die Schaltfläche Rein. Wählen Sie als Nächstes Konzentration aus, und klicken Sie auf die Schaltfläche Tun. Sobald der Bildschirm aktualisiert wird, klicken Sie auf die Schaltfläche Ok, und fahren Sie dann fort, um zur nächsten Seite zu wechseln.Klicken Sie nun auf Weiter, und wenden Sie unter Implementierung fnnls an. Wählen Sie dann sechs aus dem Dropdown-Menü für die Anzahl der Arten mit Nicht-Negativitätsprofilen aus, und klicken Sie auf Weiter. Wählen Sie auf der nächsten Seite dieselben Parameter aus, und klicken Sie auf Weiter.Um die Position an der Hautoberfläche zu bestimmen, wurde der Bereich unter dem Raman-Peak des Proteins integriert, um das Tiefenprofil des Proteinsignals zu erhalten. Die Hautoberfläche wurde definiert als die Position, an der der Intensitätswert aus dem interpolierten Tiefenprofil der mittleren Intensität am nächsten kam. Die genaue Position der Hautoberfläche muss nicht mit einem experimentellen Datenpunkt übereinstimmen.Insgesamt wurden 30 862 Raman-Spektren mit dem in diesem Video beschriebenen Datenerfassungsprotokoll gesammelt. Dieser große Spektraldatensatz enthält 20% Spektralausreißer. Die richtige Identifizierung und Entfernung der Ausreißerspektren ist wichtig, um einen korrekten Datensatz zu erreichen.Hier kann man den Beitrag von Raumleuchten sehen, die auf einem Referenzspektren von Roomlight überlagert sind. Die Hauptkomponentenanalyse wurde für den vorverarbeiteten konfokalen Raman-Datensatz durchgeführt, und der Eigenwert wird zusammen mit der Anzahl der verwendeten Faktoren hier dargestellt. Für Faktor neun wurde ein signifikanter Rückgang des Eigenwertes beobachtet.Diese Beobachtung schlägt vor, Modelle mit der Anzahl der Hauptkomponenten zu untersuchen, die zwischen drei und acht Faktoren für die Aufnahme in das modellierte multivariate Kurvenauflösung variieren. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, ein Tiefenprofil über der Hautoberfläche zu starten, um die Position der Hautoberfläche genau zu bestimmen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der Auswirkungen von Hautpflegeprodukten auf wichtige Hautkomponenten, einschließlich Wasser, Proteine und Lipide.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Untargeted Metabolomics aus biologischen Quellen Mit UltraPerformance Flüssigkeits-Chromatographie-hochauflösender Massenspektrometrie (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

Forschung

Chemie

High-pressure Sapphire Cell for Phase Equilibria Measurements of CO2/Organic/Water Systems

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