Name: resolving water, proteins, and lipids from in vivo confocal raman spectra of stratum corneum through a chemometric approach
Uploaded: 2019-09-26T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Resolving Water, Proteins, and Lipids from In Vivo Confocal Raman Spectra of Stratum Corneum through a Chemometric Approach at JoVE.com

Gli autori riconoscono molto il sostegno finanziario del dipartimento di assistenza alla pulizia della pulizia aziendale. Vogliamo esprimere la nostra gratitudine ai direttori associati analitici Ms. Jasmine Wang e Dr. Robb Gardner per la loro guida e supporto e la signora Li Yang per il suo aiuto sulla raccolta dei dati.

Questo studio è stato approvato dal comitato di revisione istituzionale dell'Ospedale pediatrico di Pechino in conformità con le linee guida etiche della Dichiarazione di Helsinki del 1975. È stato condotto secondo le linee guida ICH per la buona pratica clinica. Lo studio ha avuto luogo da maggio a luglio 2015.
1. Collezione di spettri Raman confocali in vivo da soggetti umani con dermatite atopica
<ol><li>Includere argomenti conformi ai seguenti criteri.<ol>
<li>Includere soggetti di et...

<ol>
	<li>Caspers, P., Lucassen, G., Bruining, H., Puppels, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+depth+-+scanning+confocal+Raman+microspectrometer+for+rapid+in+vivo+determination+of+water+concentration+profiles+in+human+skin.">Automated depth - scanning confocal Raman microspectrometer for rapid in vivo determination of water concentration profiles in human skin.</a> Journal of Raman Spectroscopy. 31 (8-9), 813-818 (2000).</li><li>Crowther, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+effects+of+topical+moisturizers+on+changes+in+stratum+corneum+thickness,+water+gradients+and+hydration+in+vivo.">Measuring the effects of topical moisturizers on changes in stratum corneum thickness, water gradients and hydration in vivo.</a> British Journal of Dermatology. 159 (3), 567-577 (2008).</li><li>Egawa, M., Tagami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+depth+profiles+of+water+and+water-binding+substances+in+the+stratum+corneum+determined+in+vivo+by+Raman+spectroscopy+between+the+cheek+and+volar+forearm+skin:+effects+of+age,+seasonal+changes+and+artificial+forced+hydration.">Comparison of the depth profiles of water and water-binding substances in the stratum corneum determined in vivo by Raman spectroscopy between the cheek and volar forearm skin: effects of age, seasonal changes and artificial forced hydration.</a> British Journal of Dermatology. 158 (2), 251-260 (2008).</li><li>Crowther, J. M., Matts, P. J., Kaczvinsky, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Changes in Stratum Corneum Thickness, Water Gradients and Hydration by Moisturizers. , (2012).</li><li>Pudney, P. D., M&#233;lot, M., Caspers, P. J., Van, D. P. A., Puppels, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+confocal+Raman+study+of+the+delivery+of+trans+retinol+to+the+skin.">An in vivo confocal Raman study of the delivery of trans retinol to the skin.</a> Applied Spectroscopy. 61 (8), 804 (2007).</li><li>Mohammed, D., Matts, P., Hadgraft, J., Lane, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro-in+vivo+correlation+in+skin+permeation.">In vitro-in vivo correlation in skin permeation.</a> Pharmaceutical Research. 31 (2), 394-400 (2014).</li><li>Hanlon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospects+for+in+vivo+Raman+spectroscopy.">Prospects for in vivo Raman spectroscopy.</a> Physics in Medicine and Biology. 45 (2), 1 (2000).</li><li>Mohammed, D., Crowther, J. M., Matts, P. J., Hadgraft, J., Lane, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+niacinamide+containing+formulations+on+the+molecular+and+biophysical+properties+of+the+stratum+corneum.">Influence of niacinamide containing formulations on the molecular and biophysical properties of the stratum corneum.</a> International Journal of Pharmaceutics. 441 (1-2), 192-201 (2013).</li><li>Boireau-Adamezyk, E., Baillet-Guffroy, A., Stamatas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+changes+in+stratum+corneum+barrier+function.">Age-dependent changes in stratum corneum barrier function.</a> Skin Research and Technology. 20 (4), 409-415 (2014).</li><li>Pezzotti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+spectroscopy+of+human+skin:+looking+for+a+quantitative+algorithm+to+reliably+estimate+human+age.">Raman spectroscopy of human skin: looking for a quantitative algorithm to reliably estimate human age.</a> Journal of Biomedical Optics. 20 (6), 065008 (2015).</li><li>Mlitz, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+filaggrin+mutations+on+Raman+spectra+and+biophysical+properties+of+the+stratum+corneum+in+mild+to+moderate+atopic+dermatitis.">Impact of filaggrin mutations on Raman spectra and biophysical properties of the stratum corneum in mild to moderate atopic dermatitis.</a> Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology. 26 (8), 983-990 (2012).</li><li>Janssens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+to+protein+ratio+plays+an+important+role+in+the+skin+barrier+function+in+patients+with+atopic+eczema.">Lipid to protein ratio plays an important role in the skin barrier function in patients with atopic eczema.</a> British Journal of Dermatology. 170 (6), 1248-1255 (2014).</li><li>Faiman, R., Larsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assignment+of+the+C+H+stretching+vibrational+frequencies+in+the+Raman+spectra+of+lipids.">Assignment of the C H stretching vibrational frequencies in the Raman spectra of lipids.</a> Journal of Raman Spectroscopy. 4 (4), 387-394 (1976).</li><li>Edwards, H. G., Farwell, D. W., Williams, A. C., Barry, B. W., Rull, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+spectroscopic+deconvolution+procedure+for+complex+biological+systems:+vibrational+components+in+the+FT-Raman+spectra+of+ice-man+and+contemporary+skin.">Novel spectroscopic deconvolution procedure for complex biological systems: vibrational components in the FT-Raman spectra of ice-man and contemporary skin.</a> Journal of the Chemical Society, Faraday Transactions. 91 (21), 3883-3887 (1995).</li><li>Choe, C., Lademann, J., Darvin, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+organization+and+stratum+corneum+thickness+determined+in+vivo+in+human+skin+analyzing+lipid-keratin+peak+(2820-3030+cm-+1)+using+confocal+Raman+microscopy.">Lipid organization and stratum corneum thickness determined in vivo in human skin analyzing lipid-keratin peak (2820-3030 cm- 1) using confocal Raman microscopy.</a> Journal of Raman Spectroscopy. 47 (11), 1327-1331 (2016).</li><li>Stamatas, G. N., de Sterke, J., Hauser, M., von Stetten, O., van der Pol, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+uptake+and+skin+occlusion+following+topical+application+of+oils+on+adult+and+infant+skin.">Lipid uptake and skin occlusion following topical application of oils on adult and infant skin.</a> Journal of Dermatological Science. 50 (2), 135-142 (2008).</li><li>Choe, C., Lademann, J., Darvin, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+Raman+microscopy+for+investigating+the+penetration+of+various+oils+into+the+human+skin+in+vivo.">Confocal Raman microscopy for investigating the penetration of various oils into the human skin in vivo.</a> Journal of Dermatological Science. , (2015).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+MCR+approach+revealing+protein,+water+and+lipid+depth+profile+in+atopic+dermatitis+patients'+stratum+corneum+via+in+vivo+confocal+Raman+spectroscopy.">A MCR approach revealing protein, water and lipid depth profile in atopic dermatitis patients' stratum corneum via in vivo confocal Raman spectroscopy.</a> Analytical Chemistry. , (2019).</li><li>Caspers, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> In vivo Skin Characterization by Confocal Raman Microspectroscopy. , (2003).</li><li>Jaumot, J., de Juan, A., Tauler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MCR-ALS+GUI+2.0:+New+features+and+applications.">MCR-ALS GUI 2.0: New features and applications.</a> Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 140, 1-12 (2015).</li><li>Choe, C., Choe, S., Schleusener, J., Lademann, J., Darvin, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+normalization+method+in+in+vivo+stratum+corneum+analysis+using+confocal+Raman+microscopy+to+compensate+nonhomogeneous+distribution+of+keratin.">Modified normalization method in in vivo stratum corneum analysis using confocal Raman microscopy to compensate nonhomogeneous distribution of keratin.</a> Journal of Raman Spectroscopy. , (2019).</li><li>Wise, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemometrics+tutorial+for+PLS_Toolbox+and+Solo.">Chemometrics tutorial for PLS_Toolbox and Solo.</a> Eigenvector Research, Inc. 3905, 102-159 (2006).</li></ol>

Durante la raccolta dei dati, come descritto nei paragrafi 2 e 3 del protocollo, ogni profilo di profondità è stato raccolto in un'area con contatto tra la finestra dello strumento e la pelle trovando le aree più scure dalle immagini microscopiche evidenziate nei cerchi rossi in Figura 2C. Una volta individuate queste aree, è stato fondamentale iniziare il profilo di profondità sopra la superficie della pelle per determinare con precisione la posizione della superficie...

Negli studi clinici, la spettroscopia Raman confocale in vivo ha dimostrato la sua capacità unica di determinare lo spessore dello strato di corneo e il contenuto d'acqua1,2,3,4e di tracciare la penetrazione materiali attivi applicati topicamente alla pelle5,6. Come approccio non invasivo, la spettroscopia confocale Raman rileva i segnali molecolari in base alle modalità vibrazionali. Pertanto, l'etichettatura non è necessaria7. La spettroscopia Raman confocale in vivo fornisce informazioni chimiche con risoluzione di profondità basata sulla natura confocale della tecnica. Queste informazioni dipendenti dalla profondità sono molto utili per studiare gli effetti dei prodotti per la cura della pelle4,8, invecchiamento9,10, cambiamenti stagionali3, così come le malattie di funzione di barriera cutanea, come la dermatite atopica11,12. Ci sono molte informazioni nella regione ad alta frequenza della spettroscopia confocale Raman (2.500–4.000 cm-1), dove l'acqua produce picchi distinti nella regione tra 3.250–3.550 cm-1. Tuttavia, i picchi Raman di proteine e lipidi, che sono centrati tra circa 2.800-3.000 cm-1, si sovrappongono a vicenda perché i segnali sono prodotti principalmente da gruppi di metilene (-CH2-) e metili (-CH3)13 . Queste informazioni sovrapposte presentano una sfida tecnica quando si ottengono quantità relative di singole specie molecolari. Per risolvere questa sfida sono stati utilizzati il montaggio di picco14,15 e la posizione di picco selettiva12,16 approcci. Tuttavia, è difficile per questi singoli metodi basati sul picco estrarre le informazioni pure sui componenti perché più picchi Raman dallo stesso componente cambiano contemporaneamente17. Nella nostra recente pubblicazione18è stato proposto un approccio MCR per chiarire le informazioni pure sui componenti. Utilizzando questo approccio, tre componenti (acqua, proteine e lipidi) sono stati estratti da un grande set di dati spettroscopici Raman confocale in vivo.
L'esecuzione di grandi studi clinici può essere impegnativa per gli individui che raccolgono dati spettroscopici in vivo. In alcuni casi, l'acquisizione spettrale può richiedere attrezzature operative per molte ore in un giorno e lo studio può estendersi fino a settimane o mesi. In queste condizioni, i dati spettroscopici possono essere generati da operatori di apparecchiature che non dispongono delle competenze tecniche necessarie per identificare, escludere e correggere tutte le fonti di artefatti spettroscopici. Il set di dati risultante può contenere una piccola frazione di outlier spettroscopici che devono essere identificati ed esclusi dai dati prima dell'analisi. Questo documento illustra in dettaglio un processo di analisi chemiometrica per "ripulire" un set di dati Clinico Raman prima di analizzare i dati con MCR. Per rimuovere correttamente gli outlier, è necessario identificare i tipi di outlier e la causa potenziale per la generazione degli spettri outlier. Quindi, è possibile sviluppare un approccio specifico per rimuovere gli outlier mirati. Ciò richiede una conoscenza preliminare del set di dati, inclusa una comprensione dettagliata del processo di generazione dei dati e della progettazione dello studio. In questo set di dati, la maggior parte degli outlier sono spettri bassi segnale-rumore e provengono principalmente da 1) spettri raccolti sopra la superficie della pelle (6.208 su 30.862) e 2) forte contributo allo spettro dalla luce della stanza fluorescente (67 su 30.862). Gli spettri raccolti sopra la superficie della pelle producono una risposta Raman debole, poiché il punto focale laser si avvicina alla superficie della pelle ed è per lo più nella finestra dello strumento sotto la pelle. Gli spettri con un forte contributo dalla luce fluorescente della stanza vengono generati a causa dell'errore dell'operatore dello strumento o del movimento del soggetto, il che produce una condizione in cui la finestra di raccolta confocale Raman non è completamente coperta dal sito del corpo del soggetto. Sebbene questi tipi di artefatti spettrali possano essere identificati e corretti durante l'acquisizione spettrale da parte di un esperto spettroscopico al momento dell'acquisizione dei dati, gli operatori di strumenti addestrati utilizzati in questo studio sono stati istruiti a raccogliere tutti i dati, a meno che è stato osservato un guasto catastrofico. Il compito di identificare ed escludere gli outlier è incorporato nel protocollo di analisi dei dati. Il protocollo presentato è stato sviluppato per risolvere questa sfida. Per affrontare gli spettri basso segnale-rumore sopra la superficie della pelle, la posizione della superficie della pelle deve essere determinata prima per consentire la rimozione degli spettri raccolti sopra la superficie della pelle. La posizione della superficie della pelle è definita come la profondità in cui il punto focale laser Raman è la metà della pelle e la metà fuori della pelle, come illustrato nella figura supplementare 1. Dopo aver rimosso gli spettri bassi segnale-rumore, viene implementata un'analisi principale dei componenti (PCA) per estrarre il fattore dominato dai picchi di luce ambiente fluorescenti. Questi outlier vengono rimossi in base al valore del punteggio del fattore corrispondente.
Questo protocollo fornisce informazioni dettagliate su come vengono determinati sei componenti principali nel processo MCR. Questo viene fatto attraverso un'analisi PCA seguita da confronto forma spettrale tra i carichi per i modelli generati con un diverso numero di componenti principali. Il processo sperimentale per la raccolta dei dati dei materiali di riferimento e dei soggetti umani è anche spiegato in dettaglio.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1055px;" width="1054">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:34px;width:319px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:360px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:240px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:360px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Cholesterol 3-sulfate sodium</td>
			<td style="width:360px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">D-Erythro-Dihydrosphingosine</td>
			<td style="width:360px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">DI water</td>
			<td style="width:360px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>Purified with Milipore(18.2M&#937;)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Gen2-SCA skin analyzer</td>
			<td style="width:360px;">River Diagnostics, Rotterdam, The Netherlands</td>
			<td style="width:136px;">Gen2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Matlab 2018b</td>
			<td style="width:360px;">Mathwork</td>
			<td style="width:136px;">2018b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">N-behenoyl-D-erythro-sphingosine</td>
			<td style="width:360px;">Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:319px;">N-Lignoceroyl-D-erythro-sphinganine(ceramide)</td>
			<td style="width:360px;">Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Oleic Acid</td>
			<td style="width:360px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Palmitic Acid</td>
			<td style="width:360px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Palmitoleic Acid</td>
			<td style="width:360px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">PLS_Toolbox version 8.2</td>
			<td style="width:360px;">Eigenvector Research Inc.</td>
			<td align="right" style="width:136px;">8.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">RiverICon</td>
			<td style="width:360px;">River Diagnostics, Rotterdam, The Netherlands</td>
			<td style="width:136px;">version 3.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Squalene</td>
			<td style="width:360px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Stearic Acid</td>
			<td style="width:360px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

resolving water, proteins, and lipids from in vivo confocal raman spectra of stratum corneum through a chemometric approach

Lo sviluppo di questo metodo spettroscopico Raman confocale in vivo consente la misurazione diretta di acqua, proteine e lipidi con risoluzione di profondità nei soggetti umani. Queste informazioni sono molto importanti per le malattie legate alla pelle e caratterizzano le prestazioni dei prodotti per la cura della pelle. Questo protocollo illustra un metodo per la raccolta di spettri confocali Raman e la successiva analisi del set di dati spettrale sfruttando la chemiometria. L'obiettivo di questo metodo è quello di stabilire un protocollo standard per la raccolta dei dati e fornire indicazioni generali per l'analisi dei dati. La pre-elaborazione (ad esempio, la rimozione degli spettri anomali) è una fase critica nell'elaborazione di set di dati di grandi dimensioni da studi clinici. Ad esempio, forniamo indicazioni basate sulla conoscenza preliminare di un set di dati per identificare i tipi di outlier e sviluppare strategie specifiche per rimuoverli. Viene eseguita un'analisi dei componenti principali e gli spettri di carico vengono confrontati con gli spettri dei materiali di riferimento per selezionare il numero di componenti utilizzati nell'analisi finale della risoluzione della curva multivariata (MCR). Questo approccio ha esito positivo per l'estrazione di informazioni significative da un set di dati spettrale di grandi dimensioni.

In questo studio clinico, sono stati raccolti spettri Raman confocali in vivo da 28 soggetti dai 4 ai 18 anni. Un totale di 30.862 spettri Raman sono stati raccolti con il protocollo di raccolta dati di cui sopra. Questo set di dati spettrale di grandi dimensioni contiene outlier spettrali del 20%, come illustrato nella figura 4A. Gli spettri outlier basso segnale-rumore sono stati rimossi dopo aver determinato la superficie della pelle, seguito dalla PCA per identificare gli spettri con...

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Resolving Water, Proteins, and Lipids from In Vivo Confocal Raman Spectra of Stratum Corneum through a Chemometric Approach

Qui, presentiamo un protocollo per la raccolta di spettri Raman confocali da soggetti umani in studi clinici combinati con approcci chemiometrici per la rimozione degli outlier spettrali e la successiva estrazione di caratteristiche chiave.

Risolvere acqua, proteine e lipidi da In Vivo Confocal Raman Spectra di Stratum Corneum attraverso un approccio chemiometrico

Development of this in vivo confocal Raman spectroscopic method enables the direct measurement of water, proteins, and lipids with depth resolution in ...

La misurazione diretta di acqua, proteine e lipidi con risoluzione della profondità nei soggetti umani è molto importante per le malattie legate alla pelle, per la caratterizzazione delle prestazioni del prodotto per la cura della pelle. Questo metodo, insieme alla successiva analisi, sfrutta la chemiometria per estrarre informazioni chimiche. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente di raccogliere il set di dati Raman clinico da operatori di strumenti addestrati che non dispongono di competenze tecniche per identificare, escludere e correggere tutte le fonti di artefatti spettroscopici.Il set di dati risultante può quindi essere elaborato per identificare gli outlier che devono essere esclusi dalla data precedente all'analisi. Durante l'analisi dei dati, una sfida chiave è la rimozione degli outlier e l'identificazione del numero dei componenti chiave nel set di dati. L'approccio mostra in questo video sfrutta la conoscenza precedente del set di dati clinici e l'approccio chemiometrico per estrarre con successo l'acqua, le proteine e i lipidi con risoluzione della profondità.A dimostrare la procedura sarà Li Yang, tecnico del nostro laboratorio di C&T. Per iniziare, fare in modo che il soggetto posizionare un sito del corpo della lesione marcato o un sito di controllo a stretto contatto con la finestra di imaging dello strumento Raman confocale in vivo. Assicurati che coprano l'intera finestra per evitare l'impatto della luce della stanza sull'imaging.Quindi, apri il software e sposta la messa a fuoco fino a quando non viene visto uno spettro simile a quello mostrato qui. Successivamente, spostare la messa a fuoco a 10 micron dalla superficie della pelle. Raccogli i dati per 26 passaggi con una dimensione del passo di due micron nella regione di frequenza mostrata qui, utilizzando un tempo di esposizione di un secondo.Misurare otto repliche per ogni area, della durata totale fino a 15 minuti. In primo luogo, utilizzare la finestra di comando e MATLAB per modificare l'estensione del file dei dati raccolti da ric a mat. Quindi caricare il file mat sulla piattaforma software MATLAB, come mostrato qui.Correggere la linea di base del set di dati utilizzando il metodo automatico dei quadrati meno ponderati, andando alla finestra PLS_Workspace e facendo clic con il pulsante destro del mouse sul set di dati importato, scorrendo fino ad Analizzare, selezionando Altri strumenti e facendo clic su Pre-elaborazione. Nella finestra visualizzata fare clic su Mostra. Scorrere quindi verso il basso la barra degli strumenti Metodi disponibili fino al filtro Linea di base quadrati affittati ponderati automatici e selezionare Aggiungi.Quindi, fare clic su OK per impostare le opzioni e applicare la pre-elaborazione ai dati. Salvare questo come Spectra_baseline. Tornare quindi alla finestra di comando e sostituire i dati utilizzando il risultato corretto per la linea di base.Ora, vai all'editor di testo ed esegui il programma come mostrato qui. Questo riassumerà i valori tra 2910 e 2965 centimetri inversi per ottenere i valori di intensità sotto ogni spettro Raman dalla misurazione di 26 passaggi consecutivi e memorizzarli in un file Excel. In MATLAB, andate al workspace e impostate il percorso dei dati in Depth_save, come mostrato.Quindi, utilizzate il processo qui descritto per interpolare il valore di offset dello strumento da 26 a 260 utilizzando la funzione linspace in MATLAB. Questo processo interpolerà il valore di intensità da 26 a 260 utilizzando il metodo spline, sfruttando i valori di posizione 260 appena generati. Inoltre, utilizzerà i valori di posizione e intensità 260 rispettivamente come input x e y per la funzione polyfit, impostando il valore di grado su 20.Quindi, utilizzerà i coefficienti di uscita e i 260 valori di posizione estesa come input per il polivale, per ottenere i valori finali di intensità 260. Successivamente, calcolerà l'intensità media e troverà il punto nella curva più vicino all'intensità media. Cambierà anche il valore di profondità in base alla superficie della pelle, nella dimensione nota del passo di due micron.Ora, esegui il programma. Caricare il set di dati degli spettri Raman dopo la rimozione degli spettri esterni della pelle nel software PLS_Toolbox, sotto la piattaforma MATLAB e fare clic con il pulsante destro del mouse sul set di dati per scegliere Analizza e quindi PCA. Quindi, fare clic su Scegli pre-elaborazione.Selezionate Normalizza (Normalize) come approccio di pre-elaborazione. Quindi, non scegliere nessuno per la convalida incrociata. Quindi, compilare il modello utilizzando i tre componenti per l'analisi di decomposizione PCA.Ora, rimuovere il coperchio nella finestra di raccolta degli strumenti Ramen in vivo e raccogliere gli spettri di luce della stanza nella regione ad alta frequenza utilizzando gli stessi parametri utilizzati per la raccolta dei dati del materiale di riferimento. Identificare il fattore di effetto luce della stanza attraverso il confronto con lo sfondo della luce della stanza. Ora, rivedi i punteggi e rimuovi gli spettri con il valore di punteggio corrispondente significativamente più alto del normale.Ciò significa rimuovere i valori di punteggio di oltre il 99,8% dell'intero set di dati, che è 0,16 in questo studio. Salvare i dati x-block di calibrazione risultanti. Infine, vai al browser PLS_Workspace e modifica il nuovo file.Selezionare le etichette di riga e passare a Eliminazione disco rigido esclusa per eliminare definitivamente i dati esclusi prima di salvare di nuovo il file. Inizia correggendo la linea di base degli spettri Raman usando lo stesso appena mostrato. Eseguire quindi l'analisi PCA sul set di dati pre-elaborazione.Tracciate gli autovalori in scala logaritmica insieme al numero di componenti facendo clic sul pulsante Scegli componente (Choose Component) e selezionate log(eigenvalues) come valore y. Per eseguire analisi della risoluzione delle curve multivariate, utilizzare innanzitutto il pulsante di selezione dei dati per caricare il set di dati nel software MCR_main dati. Scegliete manualmente il numero di componenti e impostate il numero del componente tra tre e otto.Quindi, nella scheda Stima iniziale, fare clic sul pulsante Pure. Selezionare Quindi Concentrazione e fare clic sul pulsante Fai. Una volta aggiornata la schermata, fare clic sul pulsante OK e quindi su Continua per passare alla pagina successiva.Fare clic su Continua e in Implementazione applicare fnnls. Selezionare quindi sei dal menu a discesa per il numero di specie con profili di non negatività e fare clic su Continua. Nella pagina successiva scegliere gli stessi parametri e fare clic su Continua.Per determinare la posizione sulla superficie della pelle, l'area sotto il picco Raman della proteina è stata integrata per ottenere il profilo di profondità del segnale proteico. La superficie della pelle è stata definita come la posizione in cui il valore di intensità dal profilo di profondità interpolato era più vicino all'intensità media. La posizione esatta della superficie della pelle non deve coincidere con un punto dati sperimentale.Un totale di 30.862 spettri Raman sono stati raccolti con il protocollo di raccolta dati descritto in questo video. Questo set di dati spettrali di grandi dimensioni contiene valori anomali spettrali del 20%. Una corretta identificazione e rimozione degli spettri anomali è importante per ottenere un set di dati adeguato.Qui, si può vedere il contributo dalle luci della stanza, sovrapposto a uno spettro di riferimento di Roomlight. L'analisi dei componenti principali è stata eseguita sul set di dati Raman confocale pre-elaborazione e l'autovalore, insieme al numero di fattori utilizzati, viene tracciato qui. Una significativa diminuzione dell'autovalore è stata osservata per il fattore nove.Questa osservazione suggerisce di studiare modelli con il numero di componenti principali che variano da tre a otto fattori per l'inclusione nel modello di risoluzione della curva multivariata. Quando si tenta questa procedura, è fondamentale avviare un profilo di profondità sopra la superficie della pelle, per determinare con precisione la posizione della superficie della pelle. Questa metodologia consente di esaminare l'impatto dei prodotti per la cura della pelle sui componenti chiave della pelle, tra cui acqua, proteine e lipidi.

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