Name: screening and identification of small peptides targeting fibroblast growth factor receptor2 using a phage display peptide library
Uploaded: 2019-09-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library at JoVE.com

وقد دعم هذا العمل برنامج العلوم والتكنولوجيا في قوانغتشو (رقم 2016201604030039).

1. اعداد كاشف
<ol><li>LB (lysogeny مرق) المتوسطة: تذوب 1 غرام من التريتون ، 0.5 غرام من استخراج الخميرة ، و 0.5 غرام من كلوريد الصوديوم في 100 مل من H2س. الاوتوكلاف وتخزين في 4 درجه مئوية.</li>
	<li>الأسهم التاسكلين: اعداد 20 ملغ/مل في 1:1 الايثانول: ح2س. مخزن في-20 درجه مئوية ، ودوامه قبل استخدام.</li>
	<li>IPTG/X-...

<ol>
	<li>Eswarakumar, V. P., Lax, I., Schlessinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+signaling+by+fibroblast+growth+factor+receptors.">Cellular signaling by fibroblast growth factor receptors.</a> Cytokine &amp; Growth Factor Reviews. 16 (2), 139-149 (2005).</li><li>Turner, N., Grose, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+signaling:+from+development+to+cancer.">Fibroblast growth factor signaling: from development to cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 10 (2), 116-129 (2010).</li><li>Cancer Genome Atlas Network. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+molecular+portraits+of+human+breast+tumors.">Comprehensive molecular portraits of human breast tumors.</a> Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).</li><li>Matsumoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGFR2+gene+amplification+and+clinicopathological+features+in+gastric+cancer.">FGFR2 gene amplification and clinicopathological features in gastric cancer.</a> British Journal of Cancer. 106 (4), 727-732 (2012).</li><li>Weiss, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequent+and+focal+FGFR1+amplification+associates+with+therapeutically+tractable+FGFR1+dependency+in+squamous+cell+lung+cancer.">Frequent and focal FGFR1 amplification associates with therapeutically tractable FGFR1 dependency in squamous cell lung cancer.</a> Science Translational Medicine. 2 (62), 62ra93 (2010).</li><li>Babina, I. S., Turner, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+challenges+in+targeting+FGFR+signaling+in+cancer.">Advances and challenges in targeting FGFR signaling in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (5), 318-322 (2017).</li><li>Katoh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+receptors+as+treatment+targets+in+clinical+oncology.">Fibroblast growth factor receptors as treatment targets in clinical oncology.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 16 (2), 105-122 (2019).</li><li>Soria, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I/IIa+study+evaluating+the+safety,+efficacy,+pharmacokinetics,+and+pharmacodynamics+of+lucitanib+in+advanced+solid+tumors.">Phase I/IIa study evaluating the safety, efficacy, pharmacokinetics, and pharmacodynamics of lucitanib in advanced solid tumors.</a> Annals of Oncology. 25 (11), 2244-2251 (2014).</li><li>French, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+FGFR4+inhibits+hepatocellular+carcinoma+in+preclinical+mouse+models.">Targeting FGFR4 inhibits hepatocellular carcinoma in preclinical mouse models.</a> PLoS ONE. 7 (5), e36713 (2012).</li><li>Martinez-Torrecuadrada, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+extracellular+domain+of+fibroblast+growth+factor+receptor+3+with+human+single-chain+Fv+antibodies+inhibits+bladder+carcinoma+cell+line+proliferation.">Targeting the extracellular domain of fibroblast growth factor receptor 3 with human single-chain Fv antibodies inhibits bladder carcinoma cell line proliferation.</a> Clinical Cancer Research. 11 (17), 6280-6290 (2005).</li><li>Palamakumbura, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysyl+oxidase+propeptide+inhibits+prostate+cancer+cell+growth+by+mechanisms+that+target+FGF-2-cell+binding+and+signaling.">Lysyl oxidase propeptide inhibits prostate cancer cell growth by mechanisms that target FGF-2-cell binding and signaling.</a> Oncogene. 28 (38), 3390-3400 (2009).</li><li>Ladner, R. C., Sato, A. K., Gorzelany, J., de Souza, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+display-derived+peptides+as+therapeutic+alternatives+to+antibodies.">Phage display-derived peptides as therapeutic alternatives to antibodies.</a> Drug Discovery Today. 9 (12), 525-529 (2004).</li><li>Wu, C. H., Liu, I. J., Lu, R. M., Wu, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancement+and+applications+of+peptide+phage+display+technology+in+biomedical+science.">Advancement and applications of peptide phage display technology in biomedical science.</a> Journal of Biomedical Science. 23, 8 (2016).</li><li>Kay, B. K., Kasanov, J., Yamabhai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+phage-displayed+combinatorial+peptide+libraries.">Screening phage-displayed combinatorial peptide libraries.</a> Methods. 24 (3), 240-246 (2001).</li><li>Rodi, D. J., Makowski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage-display+technology+-+Finding+a+needle+in+a+vast+molecular+haystack.">Phage-display technology - Finding a needle in a vast molecular haystack.</a> Current Opinion in Biotechnology. 10, 87-93 (1999).</li><li>Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+M13+for+phage+display.">Engineering M13 for phage display.</a> Biomolecular Engineering. 18, 57-63 (2002).</li><li>Hamzeh-Mivehroud, M., Mahmoudpour, A., Dastmalchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+new+peptide+ligands+for+epidermal+growth+factor+receptor+using+phage+display+and+computationally+modeling+their+mode+of+binding.">Identification of new peptide ligands for epidermal growth factor receptor using phage display and computationally modeling their mode of binding.</a> Chemical Biology &amp; Drug Design. 79 (3), 246-259 (2012).</li><li>Askoxylakis, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide-based+targeting+of+the+platelet-derived+growth+factor+receptor+beta.">Peptide-based targeting of the platelet-derived growth factor receptor beta.</a> Molecular Imaging and Biology. 15 (2), 212-221 (2013).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transdermal+protein+delivery+by+a+coadministered+peptide+identified+via+phage+display.">Transdermal protein delivery by a coadministered peptide identified via phage display.</a> Nature Biotechnology. 24 (4), 455-460 (2006).</li><li>Azzazy, H. M., Highsmith, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+display+technology:+clinical+applications+and+recent+innovations.">Phage display technology: clinical applications and recent innovations.</a> Clinical Biochemistry. 35, 425-445 (2002).</li><li>Pasqualini, R., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+targeting+In+vivo+using+phage+display+peptide+libraries.">Organ targeting In vivo using phage display peptide libraries.</a> Nature. 380 (6572), 364-366 (1996).</li><li>Liu, R., Li, X., Xiao, W., Lam, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-targeting+peptides+from+combinatorial+libraries.">Tumor-targeting peptides from combinatorial libraries.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 110-111, 13-37 (2017).</li><li>Binetruy-Tournaire, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+peptide+blocking+vascular+endothelial+growth+factor+(VEGF)-mediated+angiogenesis.">Identification of a peptide blocking vascular endothelial growth factor (VEGF)-mediated angiogenesis.</a> The EMBO Journal. 19, 1525-1533 (2000).</li><li>Peng, Y., Zhang, Y., Mitchell, W. J., Zhang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Lipopolysaccharide-Targeted+Peptide+Mimic+Vaccine+against+Q+Fever.">Development of a Lipopolysaccharide-Targeted Peptide Mimic Vaccine against Q Fever.</a> Journal of Immunology. 189, 4909-4920 (2012).</li><li>Lamichhane, T. N., Abeydeera, N. D., Duc, A. C., Cunningham, P. R., Chow, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+Peptides+Targeting+Helix+31+of+Bacterial+16S+Ribosomal+RNA+by+Screening+M13+Phage-Display+Libraries.">Selection of Peptides Targeting Helix 31 of Bacterial 16S Ribosomal RNA by Screening M13 Phage-Display Libraries.</a> Molecules. 16, 1211-1239 (2011).</li><li>Sahin, D., Taflan, S. O., Yartas, G., Ashktorab, H., Smoot, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+Identification+of+Peptides+Specifically+Targeted+to+Gastric+Cancer+Cells+from+a+Phage+Display+Peptide+Library.+Asian+Pacific.">Screening and Identification of Peptides Specifically Targeted to Gastric Cancer Cells from a Phage Display Peptide Library. Asian Pacific.</a> Journal of Cancer Prevention. 19 (4), 927-932 (2018).</li><li>Kelly, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+nanoparticles+for+imaging+incipient+pancreatic+ductal+adenocarcinoma.">Targeted nanoparticles for imaging incipient pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> PLOS Medicine. 5 (4), e85 (2008).</li><li>Sugihara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+pro-apoptotic+peptides+as+potential+therapy+for+peritoneal+endometriosis.">Development of pro-apoptotic peptides as potential therapy for peritoneal endometriosis.</a> Nature Communications. 5, 4478 (2014).</li><li>Rafii, S., Avecilla, S. T., Jin, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+vasculature+address+book:+Identification+of+stage-specific+tumor+vessel+zip+codes+by+phage+display.">Tumor vasculature address book: Identification of stage-specific tumor vessel zip codes by phage display.</a> Cancer Cell. 4, 331-333 (2003).</li><li>Arap, W., Pasqualini, R., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+Treatment+by+Targeted+Drug+Delivery+to+Tumor+Vasculature+in+a+Mouse+Model.">Cancer Treatment by Targeted Drug Delivery to Tumor Vasculature in a Mouse Model.</a> Science. 279, 377-390 (1997).</li></ol>

تعد مكتبه التصوير التوافقي أداه قويه وفعاله للفحص العالي الإنتاجي للببتيدات الجديدة التي يمكنها ربط الجزيئات المستهدفة وتنظيم وظيفتها13. حاليا ، بالعاثيه المكتبات الببتيد العرض لديها مجموعه واسعه من التطبيقات. علي سبيل المثال, يمكن استخدامها لاختيار الببتيدات النشطة بيولو?...

مستقبلات عامل النمو الليفي (FGFRs) تلعب أدوارا رئيسيه في انتشار الخلايا, التئام الجروح, وتولد الاوعيه في الجسم الحيوي1. التنشيط الشاذ من الإشارات fgfr لوحظ في مجموعه متنوعة من الأورام2,3,4,5 ويشمل تضخيم الجينات, الطفرات الجينية, الانحرافات الكروموسومات, والإفراط في إفراز الاربطه6 . وقد أظهرت العديد من مثبطات استهداف FGFRs الآثار العلاجية واعده في التجارب السريرية وتصنف أساسا إلى ثلاثه أنواع: (1) مثبطات جزيء كيناز الصغيرة ، والتي ترتبط المجال داخل الخلايا من FGFRS ، (2) الخصوم التي تستهدف الجزء خارج الخلية ، و (3) fgf يجند الفخاخ6. علي الرغم من ان العديد من مثبطات كيناز جزيء صغير لها اثار علاجيه جيده علي حد سواء في المختبر والجسم الآخر7, معظمهم لديهم الفقراء تحديد الهدف وتظهر الآثار الضارة مثل ارتفاع ضغط الدم8. غالبيه الخصوم هي الأجسام المضادة الاحاديه9،10 والبولي الببتيدات11. الببتيدات لها مزايا علي جزيئات صغيره بسبب خصوصيتها والآثار الجانبية السفلية. كما انها تحتفظ بنفاذيه الخلية ولا تتراكم في أجهزه محدده بالمقارنة مع الادويه البروتينية12. التالي ، الببتيدات الصغيرة المستهدفة هي عوامل علاجيه فعاله ومحتمله علي حد سواء.
Phage التكنولوجيا العرض هو أداه سهله ولكنها قويه لتحديد الببتيدات الصغيرة التي يمكن ان تربط إلى جزيء معين13،14،15. استخدمنا بالعاثيه العرض المكتبة الببتيد التي تقوم علي M13 بالعاثيه بسيطه مع أكثر من 109 تسلسل الببتيد مختلفه عرضها في الذيل للربط إلى جزيء الهدف (انظر جدول المواد)16. نظرا لتقارب عاليه من والعاثيات نحو جزيء معين ، والعاثيات غير منضم يمكن غسلها بعيدا ، ويتم الاحتفاظ فقط والعاثيات ملزمه باحكام مع الببتيدات القصيرة المطلوبة. الأهداف الجزيئية المعطية يمكن ان يتم تعبئتها البروتينات17،18، الكربوهيدرات، الخلايا المستزرعة ، أو حتى المواد غيرالعضوية 19 ،20. تم الإبلاغ عن حاله مثيره حيث تم اختيار الببتيدات الخاصة بالأعضاء في الجسم الخارجي باستخدام تقنيه عرض بالعاثيه21. مزايا التكنولوجيا عرض بالعاثيه وتشمل الانتاجيه العالية ، وسهوله التشغيل ، وانخفاض التكلفة ومجموعه واسعه من التطبيقات22.
في هذه الدراسة ، ونحن نقدم بروتوكول مفصل للكشف عن الببتيدات الصغيرة ملزمه للبروتين المعباه (FGFR2) باستخدام مكتبه عرض بالعاثيه. ويتم فحص فعاليه التكنولوجيا أيضا من خلال قياس تقارب الببتيد الذي تم الحصول عليه نحو FGFR2 بواسطة المعايرة الحرارية الكيميائية (ITC) ، والنشاط البيولوجي بواسطة فحص انتشار الخلايا. ويمكن تمديد الأسلوب للكشف عن الببتيدات الصغيرة التي تربط الكربوهيدرات, الخلايا المستزرعة, أو حتى المواد غير العضوية.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m Filter</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MPGP002A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 cm2 Small dish</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>150460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Guangzhou chemical reagent factory</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-96 gIII sequencing primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Synthesis from Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Nest</td>
			<td>701001-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST004D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto-Tryptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>L0037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c 3T3 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-&#173;6587</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Biodragon</td>
			<td>BD-M10110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCK-8 kit</td>
			<td>DOJINDO</td>
			<td>CK04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>sh30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMF</td>
			<td>Newprobe</td>
			<td>PB10247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15576028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2 Protein</td>
			<td>Sino Biological Inc.</td>
			<td>10014-HNAE</td>
			<td>Purity &#62;95%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITC200 system</td>
			<td>MicroCal Omega</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Guangzhou chemical reagent factory</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaI</td>
			<td>Bidepharm</td>
			<td>BD40879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Guangzhou chemical reagent factory</td>
			<td>1310-73-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG&#8211;8000</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2139-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ph.D.-7 phage display peptide library kit</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E8100S</td>
			<td>Containing the Ph.D.-7 phage library, E. coli ER2738 host strain and M13KE control phage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant FGFR2 extracellular domain proteins</td>
			<td>Sino Biological Inc.</td>
			<td>10824-H08H</td>
			<td>Purity &#62; 97%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small peptide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Synthesis from GL Biochem Ltd. (Shanghai, China)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-SHS-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SLF-T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

screening and identification of small peptides targeting fibroblast growth factor receptor2 using a phage display peptide library

وتتالف أسره مستقبلات عامل النمو الليفي البشري (FGFR) من أربعه أعضاء ، وهي FGFR1 ، و FGFR2 ، و FGFR3 ، و FGFR4 ، التي تشارك في مختلف الانشطه البيولوجية بما في ذلك انتشار الخلايا ، والبقاء علي قيد الحياة ، والهجرة ، والتمايز. وقد تم تحديد العديد من الانحرافات في مسار الإشارات FGFR ، بسبب الطفرات أو احداث تضخيم الجينات ، في أنواع مختلفه من السرطانات. التالي ، ركزت البحوث الاخيره علي وضع استراتيجيات تنطوي علي استهداف علاجي لل FGFRs. مثبطات FGFRS الحالية في مراحل مختلفه من التطور قبل السريرية والسريرية تشمل اما مثبطات جزيء صغيره من كيناسيس تيروزين أو الأجسام المضادة الاحاديه ، مع فقط عدد قليل من مثبطات المستندة إلى الببتيد في خط الأنابيب. هنا ، ونحن نقدم بروتوكول باستخدام تقنيه عرض بالعاثيه لشاشه الببتيدات الصغيرة كخصوم من FGFR2. لفتره وجيزة ، تم احتضان مكتبه من الببتيدات المعروضة phage في لوحه المغلفة مع FGFR2. وفي وقت لاحق ، تم غسلها بالعاثيه غير منضم من قبل tbst (TBS + 0.1 ٪ [v/v] توين-20) ، وكان التملص من بالعاثيه ملزمه مع 0.2 M غليسين-HCl العازلة (pH 2.2). وتم تضخيم البالعاثيه الذي تم التملص منه واستخدامه كمدخل للجولة التالية من القرصنة البيولوجية. وبعد ثلاث جولات من القرصنة البيولوجية ، تم تحديد تسلسل الببتيد من الاستنساخ الفردي للفاج بتسلسل الحمض النووي. وأخيرا ، تم توليف الببتيدات التي تم فرزها وتحليلها للتقارب والنشاط البيولوجي.

الحصول علي عاليه التقارب الببتيد الصغيرة استهداف FGFR2.
لفحص الوالعاثيات التي تستهدف FGFR2 ، استخدمت مكتبه الدكتوراه-7 في هذه الدراسة. ويبين الشكل 1التمثيل التخطيطي لسير العمل. في هذه العملية ، تم الاحتفاظ بعدد المدخلات بالعاثيه (pfu) دون تغيير ، في حين تم ...

Watch this Scientific Journal Video about Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library at JoVE.com

Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library

هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا لفحص الببتيدات الصغيرة التي تربط FGFR2 باستخدام مكتبه الببتيد العرض بالعاثيه. ونحن أيضا تحليل تقارب الببتيدات المحددة نحو FGFR2 في المختبر وقدرته علي قمع انتشار الخلايا.

فحص وتحديد الببتيدات الصغيرة التي تستهدف عامل نمو الخلايا الليفية Receptor2 باستخدام مكتبه الببتيد العرض Phage

The human Fibroblast Growth Factor Receptor (FGFR) family comprises four members, namely, FGFR1, FGFR2, FGFR3, and FGFR4, that are involved in various ...

بالمقارنة مع الأساليب الأخرى، هذا البروتوكول هو أسهل لمعرفة الخصوم جديدة، ناهضات، والتعديلات allosteric كما ونوعيا دون معرفة هيكل هيدرو تمييع وتشكيل البروتين المستهدف. هذا البروتوكول هو عالية الكفاءة، وسهلة للتعامل، والاقتصادية، والمتاحة تجاريا. الجمع بين هذا الأسلوب الفرز الإنتاجية العالية مع تحليل مركز تكنولوجيا المعلومات، يمكن الحصول على الببتيدات الصغيرة الوظيفية كما ونوعيا.وسوف يكون إثبات الإجراء يينغ تشاو ووانغ تشيانغ، طلاب الدراسات العليا من مختبرنا. لبدء هذا الإجراء، وإعداد حل من FGFR2 في العازلة طلاء بتركيز 10 ميكروغرام لكل ملليلتر. إضافة ملليلتر واحد من الحل إلى طبق 35 سم مربع ودوامة مرارا وتكرارا حتى السطح الرطب تماما.احتضان بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية مع اهتزاز. في اليوم التالي، صب قبالة حل الطلاء وإضافة حل مانع المعدة. احتضان في أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل، ثم تجاهل محلول الحجب وغسل لوحة بسرعة ست مرات مع TBST مع التأكد من أن الطبق لا تجف.إعادة إنشاء مكتبة phage الأصلي في ملليلتر واحد من TBST وإضافة هذا إلى الطبق المغلفة. صخرة بلطف لوحة على شاكر في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. بعد ذلك، تجاهل المابير وغسل الطبق 10 مرات مع TBST.Elute phage ملزمة عن طريق إضافة ملليلتر واحد من 0.2 المولى الجليسين HCL إلى الطبق وهزاز بلطف في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. نقل eluent إلى أنبوب microcentuge تعقيم وتحييد مع 100 ميكرولترات من واحد المول تريس-HCL في 9.1 pH. أولاً، قم بتعبئة لوحات LB و IPTG X-Gal المعدة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل الاستخدام.باستخدام نصائح ماصة مع خراطيش تصفية، وإعداد 100 ميكرولترات من 10 ضعفا من التخفيف من الوميض في LB. بعد أن تصل ثقافة E.coli المعدة إلى مرحلة منتصف السجل ، استغن 200 ميكرولترات من الثقافة إلى أنابيب microcentuge معقمة واحدة لكل تخفيف eluent. لبدء العدوى، إضافة 50 ميكرولترات من كل تخفيف إلى الأنابيب التي تحتوي على ثقافة الإشريكية القولونية. دوامة بسرعة واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.ثم استخدام الطلاء العصي لمعطف لوحات LB و IPTG X-GAL مع 90 ميكرولترات من هذا الخليط. بعد خمس دقائق، عكس اللوحات واحتضانها بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. عد اللويحات عندما تظهر.للبدء، تمييع ثقافة بين عشية وضحاها في 20 ملليلتر من LB في قارورة Erlenmeyer 250 ملليلتر. إضافة eluent unamplified واحتضان في 37 درجة مئوية مع اهتزاز قوية لمدة 4-1/2 ساعات. بعد ذلك، الطرد المركزي في 12،000 مرات G وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق.نقل المُنَتَكّل إلى أنبوب جديد. أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى باستخدام نفس الشروط والتخلص من بيليه. نقل 80٪ العليا من عظمى إلى أنبوب جديد وإضافته إلى حجم 1/6th من 20٪ البولي ايثيلين جلايكول و 2.5 كلوريد الصوديوم المولر.السماح phage للعجلة بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية. في اليوم التالي، الطرد المركزي الفاج المُعجَّل في 12,000 مرة G وأربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. تخلص من المُتفوّك والطرد المركزي مرة أخرى باستخدام نفس الشروط.استخدام ماصة لإزالة فائقة المتبقية. Resuspend بيليه في ملليلتر واحد من TBS ونقل سوبرانت إلى أنبوب microcentrifuge. جهاز طرد مركزي في 12،000 مرة G وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق.نقل سوبرنات إلى أنبوب الطرد الدقيق الطازج ويترسب مرة أخرى بإضافة 1/6 حجم من 20٪ البولي ايثيلين جلايكول و 2.5 كلوريد الصوديوم المولار. احتضان على الجليد لمدة 15 إلى 60 دقيقة. بعد ذلك، الطرد المركزي في 12،000 مرة G وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق.تخلص من المُتفوّك والطرد المركزي مرة أخرى باستخدام نفس الشروط. استخدام ماصة لإزالة فائقة المتبقية. إعادة تعليق بيليه في 200 ميكرولترات من TBS والطرد المركزي لمدة دقيقة إضافية لإزالة الشوائب.ثم نقل سوبرنات إلى أنبوب جديد microcentuge للحصول على eluent تضخيمها. في هذه الدراسة، يتم الاحتفاظ بعدد المدخلات phage دون تغيير في حين يتم تقليل تركيز الطلاء من بروتين FGFR2 تدريجيا. وتشير نتائج الـ phage titer إلى أن عدد الففاج المتعافى يزداد تدريجياً وأن هناك زيادة بمقدار 65 ضعفاً بعد ثلاث جولات مقارنة بالجولة الأولى.ثم يتم إجراء تجربة مركز هتك لقياس تقارب الببتيد الصغير إلى FGFR2. وتشير النتائج إلى أن الببتيد SP1 لديه تقارب عالية نحو FGFR2. وتبين هذه البيانات كفاءة بروتوكول الفرز.للتحقيق في النشاط البيولوجي للببتيد SP1 ، يتم إجراء مقايسة انتشار ليفي باستخدام مجموعة CCK-8. BALB/C3T3 هي محتضنة مع الببتيد SP1 بتركيزات مختلفة. وتشير النتائج إلى أن ببتيد SP1 يقمع نمو الخلايا.التلوث بالـ(فاغ) من النوع البري يجب تجنبه هنا تأكد من استخدام نصائح الماصات المقاومة للهباء الجوي. في حين أن النمو من خلال الحصول على phage التضخيم.ويمكن أيضا أن تستخدم هذه العملية في فحص الببتيدات الصغيرة التي ترتبط الكربوهيدرات, الخلايا الثقافية, والأنسجة. يمكن أن تكون هذه الببتيدات تضخيمًا إضافيًا على التشخيص والمستهدف

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

تسليم الجينات والخلايا البشرية في ترنسفكأيشن سرطان البنكرياس باستخدام مستقبلات عامل نمو البشرة استهداف الجيلاتين المستندة Nanovectors المهندسة

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

كشف البكتيرية والاستدلال باستخدام مجسات الكهروكيميائية

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Generation and Recovery of ÃƒÅ½Ã‚Â²-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

جيل واسترداد خلايا β الأجسام الشبه الكروية من الهلاميات المائية PEG-الببتيد الخطوة النمو

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional  microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for  ...

Observing and Quantifying Fibroblast-mediated Fibrin Gel Compaction

مراقبة وقياس حجم فيبرين جل ضغط الخلايا الليفية بوساطة

Cells embedded in collagen and fibrin gels attach and exert traction forces on the fibers of the gel. These forces can lead to local and global ...

Electrospinning Growth Factor Releasing Microspheres into Fibrous Scaffolds

عامل نمو Electrospinning الافراج الجزئي في الليفية السقالات

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth.  This system incorporates mechanical, topographical, ...

Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

تسليم والبروتينات، والببتيدات أو خلية بردة الجزيئات الصغيرة إلى الخلايا الحية التي الحضانة مع Endosomolytic الكاشف dfTAT

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the ...

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

دراسة رياضيات الكيمياء من البشرة عامل نمو مستقبلات في الخلايا السليمة باستخدام الميكروسكوب المتلازم

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

A Rapid and Quantitative Fluorimetric Method for Protein-Targeting Small Molecule Drug Screening

A السريع والكمية Fluorimetric طريقة لاستهداف البروتين جزيء صغير فحص المخدرات

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold ...

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

مجمع متضاعف الكتروليتي للهيبارين ربط تسليم عظمية عامل نمو المجال

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

Initial Evaluation of Antibody-conjugates Modified with Viral-derived Peptides for Increasing Cellular Accumulation and Improving Tumor Targeting

تعديل التقييم الأولى لجسم-يصرف مع الببتيدات المشتقة من الفيروسية لزيادة تراكم الخلوية وتحسين استهداف الورم

Antibody-conjugates (ACs) modified with virus-derived peptides are a potentially powerful class of tumor cell delivery agents for molecular payloads used ...