Name: screening and identification of small peptides targeting fibroblast growth factor receptor2 using a phage display peptide library
Uploaded: 2019-09-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af det videnskabelige og teknologiske program i Guangzhou (nr. 2016201604030039).

1. klargøring af reagens
<ol><li>LB (lysogeny bouillon) medium: Opløs 1 g tryptone, 0,5 g gærekstrakt og 0,5 g NaCl i 100 mL H2O. autoklave og opbevares ved 4 °c.</li>
	<li>Tetracyclin bestand: Forbered 20 mg/mL i 1:1 ethanol: H2O. opbevares ved-20 °c, og vortex før brug.</li>
	<li>IPTG/X-gal opløsning: Bland 0,5 g IPTG (isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid) og 0,4 g af X-gal (5-brom-4-chloro-3-indolyl β-D-galactosid) i 10 mL DMF (dimethylformamid). Opløsningen kan opbevares ved-20 °C i...

<ol>
	<li>Eswarakumar, V. P., Lax, I., Schlessinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+signaling+by+fibroblast+growth+factor+receptors.">Cellular signaling by fibroblast growth factor receptors.</a> Cytokine &amp; Growth Factor Reviews. 16 (2), 139-149 (2005).</li><li>Turner, N., Grose, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+signaling:+from+development+to+cancer.">Fibroblast growth factor signaling: from development to cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 10 (2), 116-129 (2010).</li><li>Cancer Genome Atlas Network. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+molecular+portraits+of+human+breast+tumors.">Comprehensive molecular portraits of human breast tumors.</a> Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).</li><li>Matsumoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGFR2+gene+amplification+and+clinicopathological+features+in+gastric+cancer.">FGFR2 gene amplification and clinicopathological features in gastric cancer.</a> British Journal of Cancer. 106 (4), 727-732 (2012).</li><li>Weiss, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequent+and+focal+FGFR1+amplification+associates+with+therapeutically+tractable+FGFR1+dependency+in+squamous+cell+lung+cancer.">Frequent and focal FGFR1 amplification associates with therapeutically tractable FGFR1 dependency in squamous cell lung cancer.</a> Science Translational Medicine. 2 (62), 62ra93 (2010).</li><li>Babina, I. S., Turner, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+challenges+in+targeting+FGFR+signaling+in+cancer.">Advances and challenges in targeting FGFR signaling in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (5), 318-322 (2017).</li><li>Katoh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+receptors+as+treatment+targets+in+clinical+oncology.">Fibroblast growth factor receptors as treatment targets in clinical oncology.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 16 (2), 105-122 (2019).</li><li>Soria, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I/IIa+study+evaluating+the+safety,+efficacy,+pharmacokinetics,+and+pharmacodynamics+of+lucitanib+in+advanced+solid+tumors.">Phase I/IIa study evaluating the safety, efficacy, pharmacokinetics, and pharmacodynamics of lucitanib in advanced solid tumors.</a> Annals of Oncology. 25 (11), 2244-2251 (2014).</li><li>French, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+FGFR4+inhibits+hepatocellular+carcinoma+in+preclinical+mouse+models.">Targeting FGFR4 inhibits hepatocellular carcinoma in preclinical mouse models.</a> PLoS ONE. 7 (5), e36713 (2012).</li><li>Martinez-Torrecuadrada, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+extracellular+domain+of+fibroblast+growth+factor+receptor+3+with+human+single-chain+Fv+antibodies+inhibits+bladder+carcinoma+cell+line+proliferation.">Targeting the extracellular domain of fibroblast growth factor receptor 3 with human single-chain Fv antibodies inhibits bladder carcinoma cell line proliferation.</a> Clinical Cancer Research. 11 (17), 6280-6290 (2005).</li><li>Palamakumbura, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysyl+oxidase+propeptide+inhibits+prostate+cancer+cell+growth+by+mechanisms+that+target+FGF-2-cell+binding+and+signaling.">Lysyl oxidase propeptide inhibits prostate cancer cell growth by mechanisms that target FGF-2-cell binding and signaling.</a> Oncogene. 28 (38), 3390-3400 (2009).</li><li>Ladner, R. C., Sato, A. K., Gorzelany, J., de Souza, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+display-derived+peptides+as+therapeutic+alternatives+to+antibodies.">Phage display-derived peptides as therapeutic alternatives to antibodies.</a> Drug Discovery Today. 9 (12), 525-529 (2004).</li><li>Wu, C. H., Liu, I. J., Lu, R. M., Wu, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancement+and+applications+of+peptide+phage+display+technology+in+biomedical+science.">Advancement and applications of peptide phage display technology in biomedical science.</a> Journal of Biomedical Science. 23, 8 (2016).</li><li>Kay, B. K., Kasanov, J., Yamabhai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+phage-displayed+combinatorial+peptide+libraries.">Screening phage-displayed combinatorial peptide libraries.</a> Methods. 24 (3), 240-246 (2001).</li><li>Rodi, D. J., Makowski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage-display+technology+-+Finding+a+needle+in+a+vast+molecular+haystack.">Phage-display technology - Finding a needle in a vast molecular haystack.</a> Current Opinion in Biotechnology. 10, 87-93 (1999).</li><li>Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+M13+for+phage+display.">Engineering M13 for phage display.</a> Biomolecular Engineering. 18, 57-63 (2002).</li><li>Hamzeh-Mivehroud, M., Mahmoudpour, A., Dastmalchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+new+peptide+ligands+for+epidermal+growth+factor+receptor+using+phage+display+and+computationally+modeling+their+mode+of+binding.">Identification of new peptide ligands for epidermal growth factor receptor using phage display and computationally modeling their mode of binding.</a> Chemical Biology &amp; Drug Design. 79 (3), 246-259 (2012).</li><li>Askoxylakis, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide-based+targeting+of+the+platelet-derived+growth+factor+receptor+beta.">Peptide-based targeting of the platelet-derived growth factor receptor beta.</a> Molecular Imaging and Biology. 15 (2), 212-221 (2013).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transdermal+protein+delivery+by+a+coadministered+peptide+identified+via+phage+display.">Transdermal protein delivery by a coadministered peptide identified via phage display.</a> Nature Biotechnology. 24 (4), 455-460 (2006).</li><li>Azzazy, H. M., Highsmith, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+display+technology:+clinical+applications+and+recent+innovations.">Phage display technology: clinical applications and recent innovations.</a> Clinical Biochemistry. 35, 425-445 (2002).</li><li>Pasqualini, R., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+targeting+In+vivo+using+phage+display+peptide+libraries.">Organ targeting In vivo using phage display peptide libraries.</a> Nature. 380 (6572), 364-366 (1996).</li><li>Liu, R., Li, X., Xiao, W., Lam, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-targeting+peptides+from+combinatorial+libraries.">Tumor-targeting peptides from combinatorial libraries.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 110-111, 13-37 (2017).</li><li>Binetruy-Tournaire, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+peptide+blocking+vascular+endothelial+growth+factor+(VEGF)-mediated+angiogenesis.">Identification of a peptide blocking vascular endothelial growth factor (VEGF)-mediated angiogenesis.</a> The EMBO Journal. 19, 1525-1533 (2000).</li><li>Peng, Y., Zhang, Y., Mitchell, W. J., Zhang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Lipopolysaccharide-Targeted+Peptide+Mimic+Vaccine+against+Q+Fever.">Development of a Lipopolysaccharide-Targeted Peptide Mimic Vaccine against Q Fever.</a> Journal of Immunology. 189, 4909-4920 (2012).</li><li>Lamichhane, T. N., Abeydeera, N. D., Duc, A. C., Cunningham, P. R., Chow, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+Peptides+Targeting+Helix+31+of+Bacterial+16S+Ribosomal+RNA+by+Screening+M13+Phage-Display+Libraries.">Selection of Peptides Targeting Helix 31 of Bacterial 16S Ribosomal RNA by Screening M13 Phage-Display Libraries.</a> Molecules. 16, 1211-1239 (2011).</li><li>Sahin, D., Taflan, S. O., Yartas, G., Ashktorab, H., Smoot, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+Identification+of+Peptides+Specifically+Targeted+to+Gastric+Cancer+Cells+from+a+Phage+Display+Peptide+Library.+Asian+Pacific.">Screening and Identification of Peptides Specifically Targeted to Gastric Cancer Cells from a Phage Display Peptide Library. Asian Pacific.</a> Journal of Cancer Prevention. 19 (4), 927-932 (2018).</li><li>Kelly, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+nanoparticles+for+imaging+incipient+pancreatic+ductal+adenocarcinoma.">Targeted nanoparticles for imaging incipient pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> PLOS Medicine. 5 (4), e85 (2008).</li><li>Sugihara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+pro-apoptotic+peptides+as+potential+therapy+for+peritoneal+endometriosis.">Development of pro-apoptotic peptides as potential therapy for peritoneal endometriosis.</a> Nature Communications. 5, 4478 (2014).</li><li>Rafii, S., Avecilla, S. T., Jin, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+vasculature+address+book:+Identification+of+stage-specific+tumor+vessel+zip+codes+by+phage+display.">Tumor vasculature address book: Identification of stage-specific tumor vessel zip codes by phage display.</a> Cancer Cell. 4, 331-333 (2003).</li><li>Arap, W., Pasqualini, R., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+Treatment+by+Targeted+Drug+Delivery+to+Tumor+Vasculature+in+a+Mouse+Model.">Cancer Treatment by Targeted Drug Delivery to Tumor Vasculature in a Mouse Model.</a> Science. 279, 377-390 (1997).</li></ol>

Et kombinatorisk fagtypning bibliotek er et kraftfuldt og effektivt værktøj til høj gennemløbs screening af nye peptider, der kan binde målmolekyler og regulere deres funktion13. I øjeblikket, fagtypning display peptid biblioteker har en bred vifte af applikationer. For eksempel kan de bruges til at vælge bioaktive peptider bundet til receptor proteiner23, ikke-protein mål24,25, sygdoms-specifikke antigen ef...

Fibroblast vækstfaktor receptorer (FGFRs) spille nøgleroller i celle proliferation, sårheling, og angiogenese i vivo1. Afvigende aktivering af fgfr signalering observeret i en række tumorer2,3,4,5 omfatter genforstærkning, genmutationer, kromosomale aberrationer, og overdreven ligand sekretion6 . Mange hæmmere rettet mod FGFRs har vist lovende terapeutiske virkninger i kliniske forsøg og er hovedsagelig klassificeret i tre typer: (1) små molekyle kinasehæmmere, som binder til det intracellulære domæne af FGFR, (2) antagonister, der er rettet mod ekstracellulært segment, og (3) FGF ligand fælder6. Selv om flere af de små molekyle kinasehæmmere har gode terapeutiske virkninger både in vitro og in vivo7, de fleste af dem har dårlig målspecificitet og viser bivirkninger såsom hypertension8. Flertallet af antagonister er monoklonale antistoffer9,10 og polypeptider11. Peptider har fordele i forhold til små molekyler på grund af deres specificitet og lavere bivirkninger. De bevarer også cellernes permeabilitet og ophobes ikke i specifikke organer sammenlignet med proteinstoffer12. Derfor, målrettede små peptider er både effektive og potentielle terapeutiske agenter.
Phage display teknologi er et nemt, men kraftfuldt værktøj til at identificere små peptider, som kan binde sig til et givet molekyle13,14,15. Vi brugte et fagtypning display peptid bibliotek, der er baseret på en simpel M13 fagtypning med over 109 forskellige peptidsekvenser vises i halen for binding til målet molekyle (Se tabel over materialer)16. På grund af den høje affinitet af fager mod det givne molekyle, ubundne fager kan vaskes væk, og kun stramt bundet fager med de ønskede korte peptider bevares. De givne molekylære mål kan være immobiliseret proteiner17,18, kulhydrater, dyrkede celler, eller endda uorganiske materialer19,20. En spændende sag blev rapporteret, hvor orgel-specifikke peptider blev valgt in vivo ved hjælp af fagtypning Display Technology21. Fordelene ved fagtypning display teknologi omfatter høj gennemløb, nem betjening, lave omkostninger og en bred vifte af applikationer22.
I denne undersøgelse giver vi en detaljeret protokol til screening af små peptider, der binder sig til det immobiliserede protein (FGFR2) ved hjælp af et fagtypning-skærm bibliotek. Teknologiens effektivitet undersøges også ved at måle affiniteten af det opnåede peptid mod FGFR2 ved isotermisk titrering Calorimetri (ITC) og den biologiske aktivitet ved en celle sprednings analyse. Metoden kan udvides til screening af små peptider, der binder til kulhydrater, dyrkede celler eller endda uorganiske materialer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m Filter</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MPGP002A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 cm2 Small dish</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>150460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Guangzhou chemical reagent factory</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-96 gIII sequencing primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Synthesis from Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Nest</td>
			<td>701001-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST004D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto-Tryptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>L0037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c 3T3 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-&#173;6587</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Biodragon</td>
			<td>BD-M10110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCK-8 kit</td>
			<td>DOJINDO</td>
			<td>CK04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>sh30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMF</td>
			<td>Newprobe</td>
			<td>PB10247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15576028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2 Protein</td>
			<td>Sino Biological Inc.</td>
			<td>10014-HNAE</td>
			<td>Purity &#62;95%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITC200 system</td>
			<td>MicroCal Omega</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Guangzhou chemical reagent factory</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaI</td>
			<td>Bidepharm</td>
			<td>BD40879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Guangzhou chemical reagent factory</td>
			<td>1310-73-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG&#8211;8000</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2139-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ph.D.-7 phage display peptide library kit</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E8100S</td>
			<td>Containing the Ph.D.-7 phage library, E. coli ER2738 host strain and M13KE control phage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant FGFR2 extracellular domain proteins</td>
			<td>Sino Biological Inc.</td>
			<td>10824-H08H</td>
			<td>Purity &#62; 97%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small peptide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Synthesis from GL Biochem Ltd. (Shanghai, China)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-SHS-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SLF-T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

screening and identification of small peptides targeting fibroblast growth factor receptor2 using a phage display peptide library

Den humane fibroblast vækstfaktor receptor (FGFR) familie består af fire medlemmer, nemlig FGFR1, FGFR2, FGFR3 og FGFR4, der er involveret i forskellige biologiske aktiviteter, herunder celle spredning, overlevelse, migration og differentiering. Flere afvigelser i FGFR signalering pathway, på grund af mutationer eller genamplifikation hændelser, er blevet identificeret i forskellige typer af kræft. Nyere forskning har derfor fokuseret på at udvikle strategier, der involverer terapeutisk målretning af FGFRs. nuværende FGFR-hæmmere på forskellige stadier af præklinisk og klinisk udvikling omfatter enten små molekyle hæmmere af tyrosinkinaser eller monoklonalt antistoffer, med kun få peptidbaserede hæmmere i rørledningen. Her giver vi en protokol ved hjælp af fagtypning display teknologi til at screene små peptider som antagonister af FGFR2. Kort, et bibliotek af Phage-viste peptider blev inkuberet i en plade belagt med FGFR2. Efterfølgende blev ubundet fagtypning vasket af tbst (TBS + 0,1% [v/v] Tween-20), og bundet fagtypning blev elueret med 0,2 M Glycin-HCL buffer (pH 2,2). Den elueret fagtypning blev yderligere forstærket og anvendt som input til den næste runde af biopanning. Efter tre runder af biopanning blev peptidsekvenserne af individuelle fagtypning kloner identificeret ved DNA-sekvensering. Endelig blev de screenede peptider syntetiseret og analyseret for affinitet og biologisk aktivitet.

Opnåelse af en høj affinitet lille peptid målretning FGFR2.
Til skærm fager målretning FGFR2, en ph.D.-7 bibliotek blev brugt i denne undersøgelse. En skematisk gengivelse af arbejdsprocessen vises i figur 1. I denne proces, antallet af fagtypning input (PFU) blev holdt uændret, mens belægningen koncentrationen af FGFR2 protein blev reduceret gradvist. Resultaterne af fagtypning titer tydede på, at antallet af genvundne fager steg gradvis...

Watch this Scientific Journal Video about Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library at JoVE.com

Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library

Heri præsenterer vi en detaljeret protokol til screening af små peptider, der binder sig til FGFR2 ved hjælp af et fagtypning-display peptid-bibliotek. Vi analyserer yderligere affiniteten af de valgte peptider mod FGFR2 in vitro og dets evne til at undertrykke celle proliferation.

Screening og identifikation af små peptider rettet mod fibroblast vækstfaktor Receptor2 ved hjælp af et Phage display peptid bibliotek

The human Fibroblast Growth Factor Receptor (FGFR) family comprises four members, namely, FGFR1, FGFR2, FGFR3, and FGFR4, that are involved in various ...

Sammenlignet med andre metoder, denne protokol er lettere at finde ud af nye antagonisters, agonisteres, og allosteriske modulatorer kvantitativt og kvalitativt uden at kende hydro-fortynding struktur og dannelse af målet protein. Denne protokol er højeffektiv, nem at håndtere, økonomisk og kommercielt tilgængelig. Kombiner denne høje gennemløbsscreeningsmetode med ITC-analyse, de funktionelle små peptider kan opnås kvantitativt og kvalitativt.Demonstration af proceduren vil være Ying Zhao og Qiang Wang, kandidatstuderende fra vores laboratorium. For at påbegynde denne procedure skal der forberedes en opløsning af FGFR2 i belægningsbuffer ved en koncentration på 10 mikrogram pr. milliliter. Tilsæt en milliliter af opløsningen til en 35 kvadratcentimeter skål og hvirvle gentagne gange, indtil overfladen er helt våd.Inkubere natten over ved fire grader Celsius med rystelser. Den næste dag hældes belægningsopløsningen af og den forberedte blokeringsopløsning. Inkuber ved fire grader Celsius i mindst en time, kassér derefter blokeringsopløsningen og vask hurtigt pladen seks gange med TBST, samtidig med at skålen ikke tørres ud.Rekonstituere det oprindelige fagbibliotek i en milliliter TBST og tilføje dette til den belagte skål. Ryd forsigtigt pladen på en shaker ved stuetemperatur i to timer. Derefter kasseres supernatanten, og skålen vaskes 10 gange med TBST.Eluter den bundne ved at tilsætte en milliliter 0,2 molar glycin HCL til fadet og rokke forsigtigt ved stuetemperatur i 10 minutter. Eluenten overføres til et steriliseret mikrocentrifugerør, og det neutraliseres med 100 mikroliter af en molar Tris-HCL ved pH 9.1. Først prewarm den forberedte LB og IPTG X-Gal plader ved 37 grader Celsius i mindst en time før brug.Ved hjælp af pipettespidser med filterpatroner skal der tilberedes 100 mikroliter af tidobbelte fortyndinger af elueringstånen i LB. Efter den forberedte E.coli-kultur når midten af logfasen, skal 200 mikroliter af kulturen dispenseres i steriliserede mikrocentrifugerør ét for hver elueringsfortynding. For at starte infektionen tilsættes 50 mikroliter af hver fortynding til de rør, der indeholder E.coli-kulturen. Vortex hurtigt og inkubere ved stuetemperatur i fem minutter.Brug derefter belægningspinde til at belægge LB- og IPTG X-GAL-pladerne med 90 mikroliter af denne blanding. Efter fem minutter, vende pladerne og inkubere dem natten over ved 37 grader Celsius. Tæl plaques, når de vises.Til at begynde, fortyndes natten kultur i 20 milliliter LB i en 250 milliliter Erlenmeyer kolbe. Tilsæt den uforstærkede elueringsret og inkuberes ved 37 grader Celsius med kraftig omrystning i 4-1/2 time. Dernæst centrifuge kulturen på 12, 000 gange G og fire grader Celsius i 10 minutter.Overfør supernatanten til et frisk rør. Centrifuge igen ved hjælp af de samme betingelser og kassér pellet. Overfør den øverste 80% af supernatanten til et frisk rør og tilsæt det til 1/6th volumen af 20% polyethylenglycol og 2,5 molar natriumchlorid.Lad faget udløse natten over ved fire grader Celsius. Den næste dag, centrifuge den udfældede ved 12, 000 gange G og fire grader Celsius i 15 minutter. Supernatanten kasseres igen og centrifugeres på samme betingelser.Brug en pipette til at fjerne den resterende supernatant. Pelletsuspendrer pelletet op igen i en milliliter TBS, og overfør supernatanten til et mikrocentrifugerør. Centrifuge ved 12, 000 gange G og fire grader Celsius i fem minutter.Supernatanten overføres til et frisk mikrocentrifugerør og bundfald igen ved at tilsætte 1/6th volumen på 20% polyethylenglycol og 2,5 molarnatriumchlorid. Inkuber på is i 15 til 60 minutter. Dernæst centrifuge ved 12, 000 gange G og fire grader Celsius i 10 minutter.Supernatanten kasseres igen og centrifugeres på samme betingelser. Brug en pipette til at fjerne den resterende supernatant. Pelletsuspendrer pellet i 200 mikroliter TBS og centrifuge i yderligere et minut for at fjerne urenheder.Overfør derefter supernatanten til et frisk mikrocentrifugerør for at opnå det forstærkede elluent. I denne undersøgelse holdes antallet af faginput uændret, mens belægningskoncentrationen af FGFR2-protein gradvist reduceres. Resultaterne af fagtiteren tyder på, at antallet af genvundne fager gradvist stiger, og at der efter tre runder er en 65-dobling i forhold til første runde.En ITC eksperiment udføres derefter for at måle affiniteten af den lille peptid til FGFR2. Resultaterne viser, at SP1 peptid har høj affinitet mod FGFR2. Disse data viser screeningprotokollens effektivitet.At undersøge den biologiske aktivitet af SP1 peptid, en fibroblast spredning assay udføres ved hjælp af en CCK-8 kit. BALB/C3T3 inkuberes med SP1-peptidet i forskellige koncentrationer. Resultaterne tyder på, at SP1 peptid undertrykker væksten af cellerne.Forureningen med vildtype-fag skal her undgås. Sørg for at bruge aerosolbestandige pipettespidser. Mens vækst ved at opnå forstærkning.Denne procedure kan også bruges i screening små peptider, der binder sig til kulhydrater, kulturceller, og væv. Disse peptider kan yderligere forstærkning over diagnostiske og målrettede

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

Gene Levering og transfektion i Human bugspytkirtelkræftceller hjælp epidermal vækstfaktor receptor-målrettede Gelatine-baseret Engineered Nanovectors

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

Bakteriel Detection og identifikation Brug elektrokemiske sensorer

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Generation and Recovery of ÃƒÅ½Ã‚Â²-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Generation og indvinding af β-celle Sfæroider Fra Step-vækst PEG-peptid hydrogeler

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional  microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for  ...

Observing and Quantifying Fibroblast-mediated Fibrin Gel Compaction

Observation og kvantificering fibroblast-medieret Fibrin Gel Compaction

Cells embedded in collagen and fibrin gels attach and exert traction forces on the fibers of the gel. These forces can lead to local and global ...

Electrospinning Growth Factor Releasing Microspheres into Fibrous Scaffolds

Electrospinning Growth Factor Releasing Mikrosfærer i Fiber Stilladser

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth.  This system incorporates mechanical, topographical, ...

Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

Levering af proteiner, peptider eller celleimpermeable små molekyler i levende celler ved inkubering med Endosomolytic Reagent dfTAT

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the ...

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

Undersøgelse af støkiometrien af ​​epidermal vækstfaktor receptor i intakte celler ved hjælp af korrelative Microscopy

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

A Rapid and Quantitative Fluorimetric Method for Protein-Targeting Small Molecule Drug Screening

En hurtig og kvantitativ Fluorimetrisk Metode til Protein-Targeting småmolekyle Drug Screening

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold ...

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

Polyelektrolyt kompleks for heparinbindende område osteogent vækstfaktor Delivery

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

Initial Evaluation of Antibody-conjugates Modified with Viral-derived Peptides for Increasing Cellular Accumulation and Improving Tumor Targeting

Indledende vurdering af antistof-konjugater modificeret med Viral-afledte peptider til at øge cellulære ophobning og forbedring af Tumor målretning

Antibody-conjugates (ACs) modified with virus-derived peptides are a potentially powerful class of tumor cell delivery agents for molecular payloads used ...