Name: screening and identification of small peptides targeting fibroblast growth factor receptor2 using a phage display peptide library
Uploaded: 2019-09-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door het wetenschaps-en technologieprogramma van Guangzhou (nr. 2016201604030039).

1. bereiding van het reagens
<ol><li>LB (lysogeny Bouillon) medium: Los 1 g Tryptone, 0,5 g gistextract en 0,5 g NaCl op in 100 mL H2O. autoclaaf en bewaar bij 4 °c.</li>
	<li>Tetracycline voorraad: bereid 20 mg/mL in 1:1 ethanol: H2O. bewaren bij-20 °c, en Vortex voor gebruik.</li>
	<li>IPTG/X-gal oplossing: Meng 0,5 g IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) en 0,4 g van X-Gal (5-broom-4-Chloro-3-indolyl β-D-galactoside) in 10 mL DMF (dimethyl formamide). De oplossing kan gedurende één...

<ol>
	<li>Eswarakumar, V. P., Lax, I., Schlessinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+signaling+by+fibroblast+growth+factor+receptors.">Cellular signaling by fibroblast growth factor receptors.</a> Cytokine &amp; Growth Factor Reviews. 16 (2), 139-149 (2005).</li><li>Turner, N., Grose, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+signaling:+from+development+to+cancer.">Fibroblast growth factor signaling: from development to cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 10 (2), 116-129 (2010).</li><li>Cancer Genome Atlas Network. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+molecular+portraits+of+human+breast+tumors.">Comprehensive molecular portraits of human breast tumors.</a> Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).</li><li>Matsumoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGFR2+gene+amplification+and+clinicopathological+features+in+gastric+cancer.">FGFR2 gene amplification and clinicopathological features in gastric cancer.</a> British Journal of Cancer. 106 (4), 727-732 (2012).</li><li>Weiss, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequent+and+focal+FGFR1+amplification+associates+with+therapeutically+tractable+FGFR1+dependency+in+squamous+cell+lung+cancer.">Frequent and focal FGFR1 amplification associates with therapeutically tractable FGFR1 dependency in squamous cell lung cancer.</a> Science Translational Medicine. 2 (62), 62ra93 (2010).</li><li>Babina, I. S., Turner, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+challenges+in+targeting+FGFR+signaling+in+cancer.">Advances and challenges in targeting FGFR signaling in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (5), 318-322 (2017).</li><li>Katoh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+receptors+as+treatment+targets+in+clinical+oncology.">Fibroblast growth factor receptors as treatment targets in clinical oncology.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 16 (2), 105-122 (2019).</li><li>Soria, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I/IIa+study+evaluating+the+safety,+efficacy,+pharmacokinetics,+and+pharmacodynamics+of+lucitanib+in+advanced+solid+tumors.">Phase I/IIa study evaluating the safety, efficacy, pharmacokinetics, and pharmacodynamics of lucitanib in advanced solid tumors.</a> Annals of Oncology. 25 (11), 2244-2251 (2014).</li><li>French, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+FGFR4+inhibits+hepatocellular+carcinoma+in+preclinical+mouse+models.">Targeting FGFR4 inhibits hepatocellular carcinoma in preclinical mouse models.</a> PLoS ONE. 7 (5), e36713 (2012).</li><li>Martinez-Torrecuadrada, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+extracellular+domain+of+fibroblast+growth+factor+receptor+3+with+human+single-chain+Fv+antibodies+inhibits+bladder+carcinoma+cell+line+proliferation.">Targeting the extracellular domain of fibroblast growth factor receptor 3 with human single-chain Fv antibodies inhibits bladder carcinoma cell line proliferation.</a> Clinical Cancer Research. 11 (17), 6280-6290 (2005).</li><li>Palamakumbura, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysyl+oxidase+propeptide+inhibits+prostate+cancer+cell+growth+by+mechanisms+that+target+FGF-2-cell+binding+and+signaling.">Lysyl oxidase propeptide inhibits prostate cancer cell growth by mechanisms that target FGF-2-cell binding and signaling.</a> Oncogene. 28 (38), 3390-3400 (2009).</li><li>Ladner, R. C., Sato, A. K., Gorzelany, J., de Souza, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+display-derived+peptides+as+therapeutic+alternatives+to+antibodies.">Phage display-derived peptides as therapeutic alternatives to antibodies.</a> Drug Discovery Today. 9 (12), 525-529 (2004).</li><li>Wu, C. H., Liu, I. J., Lu, R. M., Wu, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancement+and+applications+of+peptide+phage+display+technology+in+biomedical+science.">Advancement and applications of peptide phage display technology in biomedical science.</a> Journal of Biomedical Science. 23, 8 (2016).</li><li>Kay, B. K., Kasanov, J., Yamabhai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+phage-displayed+combinatorial+peptide+libraries.">Screening phage-displayed combinatorial peptide libraries.</a> Methods. 24 (3), 240-246 (2001).</li><li>Rodi, D. J., Makowski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage-display+technology+-+Finding+a+needle+in+a+vast+molecular+haystack.">Phage-display technology - Finding a needle in a vast molecular haystack.</a> Current Opinion in Biotechnology. 10, 87-93 (1999).</li><li>Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+M13+for+phage+display.">Engineering M13 for phage display.</a> Biomolecular Engineering. 18, 57-63 (2002).</li><li>Hamzeh-Mivehroud, M., Mahmoudpour, A., Dastmalchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+new+peptide+ligands+for+epidermal+growth+factor+receptor+using+phage+display+and+computationally+modeling+their+mode+of+binding.">Identification of new peptide ligands for epidermal growth factor receptor using phage display and computationally modeling their mode of binding.</a> Chemical Biology &amp; Drug Design. 79 (3), 246-259 (2012).</li><li>Askoxylakis, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide-based+targeting+of+the+platelet-derived+growth+factor+receptor+beta.">Peptide-based targeting of the platelet-derived growth factor receptor beta.</a> Molecular Imaging and Biology. 15 (2), 212-221 (2013).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transdermal+protein+delivery+by+a+coadministered+peptide+identified+via+phage+display.">Transdermal protein delivery by a coadministered peptide identified via phage display.</a> Nature Biotechnology. 24 (4), 455-460 (2006).</li><li>Azzazy, H. M., Highsmith, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+display+technology:+clinical+applications+and+recent+innovations.">Phage display technology: clinical applications and recent innovations.</a> Clinical Biochemistry. 35, 425-445 (2002).</li><li>Pasqualini, R., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+targeting+In+vivo+using+phage+display+peptide+libraries.">Organ targeting In vivo using phage display peptide libraries.</a> Nature. 380 (6572), 364-366 (1996).</li><li>Liu, R., Li, X., Xiao, W., Lam, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-targeting+peptides+from+combinatorial+libraries.">Tumor-targeting peptides from combinatorial libraries.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 110-111, 13-37 (2017).</li><li>Binetruy-Tournaire, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+peptide+blocking+vascular+endothelial+growth+factor+(VEGF)-mediated+angiogenesis.">Identification of a peptide blocking vascular endothelial growth factor (VEGF)-mediated angiogenesis.</a> The EMBO Journal. 19, 1525-1533 (2000).</li><li>Peng, Y., Zhang, Y., Mitchell, W. J., Zhang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Lipopolysaccharide-Targeted+Peptide+Mimic+Vaccine+against+Q+Fever.">Development of a Lipopolysaccharide-Targeted Peptide Mimic Vaccine against Q Fever.</a> Journal of Immunology. 189, 4909-4920 (2012).</li><li>Lamichhane, T. N., Abeydeera, N. D., Duc, A. C., Cunningham, P. R., Chow, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+Peptides+Targeting+Helix+31+of+Bacterial+16S+Ribosomal+RNA+by+Screening+M13+Phage-Display+Libraries.">Selection of Peptides Targeting Helix 31 of Bacterial 16S Ribosomal RNA by Screening M13 Phage-Display Libraries.</a> Molecules. 16, 1211-1239 (2011).</li><li>Sahin, D., Taflan, S. O., Yartas, G., Ashktorab, H., Smoot, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+Identification+of+Peptides+Specifically+Targeted+to+Gastric+Cancer+Cells+from+a+Phage+Display+Peptide+Library.+Asian+Pacific.">Screening and Identification of Peptides Specifically Targeted to Gastric Cancer Cells from a Phage Display Peptide Library. Asian Pacific.</a> Journal of Cancer Prevention. 19 (4), 927-932 (2018).</li><li>Kelly, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+nanoparticles+for+imaging+incipient+pancreatic+ductal+adenocarcinoma.">Targeted nanoparticles for imaging incipient pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> PLOS Medicine. 5 (4), e85 (2008).</li><li>Sugihara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+pro-apoptotic+peptides+as+potential+therapy+for+peritoneal+endometriosis.">Development of pro-apoptotic peptides as potential therapy for peritoneal endometriosis.</a> Nature Communications. 5, 4478 (2014).</li><li>Rafii, S., Avecilla, S. T., Jin, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+vasculature+address+book:+Identification+of+stage-specific+tumor+vessel+zip+codes+by+phage+display.">Tumor vasculature address book: Identification of stage-specific tumor vessel zip codes by phage display.</a> Cancer Cell. 4, 331-333 (2003).</li><li>Arap, W., Pasqualini, R., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+Treatment+by+Targeted+Drug+Delivery+to+Tumor+Vasculature+in+a+Mouse+Model.">Cancer Treatment by Targeted Drug Delivery to Tumor Vasculature in a Mouse Model.</a> Science. 279, 377-390 (1997).</li></ol>

Een combinatorische faag-bibliotheek is een krachtig en effectief hulpmiddel voor de screening van nieuwe peptiden met een hoge doorvoer die doelwit moleculen kan binden en hun functie13kunnen reguleren. Op dit moment hebben faag display peptide bibliotheken een breed scala aan toepassingen. Bijvoorbeeld, ze kunnen worden gebruikt voor het selecteren van bioactieve peptiden gebonden aan receptor eiwitten23, niet-eiwit targets24,<sup class=...

Fibroblast groeifactor receptoren (FGFRs) spelen belangrijke rollen in celproliferatie, wondgenezing en angiogenese in vivo1. Afwijkende activering van fgfr-signalering waargenomen in een verscheidenheid van tumoren2,3,4,5 omvat genamplificatie, genmutaties, chromosomale afwijkingen en overmatige ligand secretie6 . Veel remmers gericht FGFRs hebben veelbelovende therapeutische effecten aangetoond in klinische proeven en zijn voornamelijk ingedeeld in drie soorten: (1) kleine molecuul kinase remmers, die binden aan het intracellulaire domein van FGFR, (2) antagonisten gericht op de extracellulair segment, en (3) FGF ligand traps6. Hoewel verscheidene van de kleine molecuul kinase remmers goede therapeutische effecten zowel in vitro en in vivo7, de meeste van hen hebben slechte doel specificiteit en vertonen nadelige effecten zoals hypertensie8. De meerderheid van de antagonisten zijn monoklonale antilichamen9,10 en poly peptides11. Peptiden hebben voordelen ten opzichte van kleine moleculen als gevolg van hun specificiteit en lagere bijwerkingen. Ze behouden ook de permeabiliteit van de cel en accumuleren niet in specifieke organen in vergelijking met eiwit drugs12. Vandaar, gerichte kleine peptiden zijn zowel effectieve en potentiële therapeutische agenten.
Phage display technologie is een eenvoudig maar krachtig hulpmiddel voor het identificeren van kleine peptiden die kunnen binden aan een bepaald molecuul13,14,15. We gebruikten een faag display peptide bibliotheek die is gebaseerd op een eenvoudige M13 faag met meer dan 109 verschillende peptide sequenties weergegeven aan de staart voor binding aan het doelwit molecuul (Zie tabel van de materialen)16. Vanwege de hoge affiniteit van Fagen naar het gegeven molecuul, kunnen ongebonden Fagen weggewassen worden, en alleen strak gebonden Fagen met de gewenste korte peptiden blijven behouden. De gegeven moleculaire doelen kunnen worden geïmmobiliseerd eiwitten17,18, koolhydraten, gekweekte cellen, of zelfs anorganische materialen19,20. Een spannende zaak werd gerapporteerd waar Orgaanspecifieke peptiden werden geselecteerd in vivo met behulp van faag Display Technology21. De voordelen van faag display technologie zijn onder andere een hoge doorvoer, bedieningsgemak, lage kosten en een breed scala aan toepassingen22.
In deze studie bieden we een gedetailleerd protocol voor het screenen van kleine peptiden binding aan het geïmmobiliseerde eiwit (FGFR2) met behulp van een faag display Library. De werkzaamheid van de technologie wordt ook onderzocht door het meten van de affiniteit van de verkregen peptide naar FGFR2 door isothermische titratie calorimetrie (ITC), en de biologische activiteit door een celproliferatie test. De methode kan worden uitgebreid voor het screenen van kleine peptiden die binden aan koolhydraten, gekweekte cellen, of zelfs anorganische materialen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m Filter</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MPGP002A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 cm2 Small dish</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>150460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Guangzhou chemical reagent factory</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-96 gIII sequencing primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Synthesis from Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Nest</td>
			<td>701001-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST004D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto-Tryptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>L0037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c 3T3 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-&#173;6587</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Biodragon</td>
			<td>BD-M10110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCK-8 kit</td>
			<td>DOJINDO</td>
			<td>CK04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>sh30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMF</td>
			<td>Newprobe</td>
			<td>PB10247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15576028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2 Protein</td>
			<td>Sino Biological Inc.</td>
			<td>10014-HNAE</td>
			<td>Purity &#62;95%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITC200 system</td>
			<td>MicroCal Omega</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Guangzhou chemical reagent factory</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaI</td>
			<td>Bidepharm</td>
			<td>BD40879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Guangzhou chemical reagent factory</td>
			<td>1310-73-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG&#8211;8000</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2139-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ph.D.-7 phage display peptide library kit</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E8100S</td>
			<td>Containing the Ph.D.-7 phage library, E. coli ER2738 host strain and M13KE control phage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant FGFR2 extracellular domain proteins</td>
			<td>Sino Biological Inc.</td>
			<td>10824-H08H</td>
			<td>Purity &#62; 97%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small peptide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Synthesis from GL Biochem Ltd. (Shanghai, China)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-SHS-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SLF-T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

screening and identification of small peptides targeting fibroblast growth factor receptor2 using a phage display peptide library

De humane fibroblast growth factor receptor (FGFR) familie bestaat uit vier leden, namelijk FGFR1, FGFR2, FGFR3 en FGFR4, die betrokken zijn bij verschillende biologische activiteiten, waaronder celproliferatie, overleving, migratie en differentiatie. Verschillende aberraties in het FGFR-signalerings traject, als gevolg van mutaties of genamplificatie gebeurtenissen, zijn geïdentificeerd in verschillende soorten kankers. Daarom is recent onderzoek gericht op het ontwikkelen van strategieën met betrekking tot therapeutische targeting van FGFRs. huidige FGFR-remmers in verschillende stadia van pre-klinische en klinische ontwikkeling omvatten ofwel kleine molecuul remmers van tyrosine kinases of monoklonale antilichamen, met slechts enkele peptide-gebaseerde remmers in de pijpleiding. Hier bieden we een protocol met behulp van faag display technologie om kleine peptiden te schermen als antagonisten van FGFR2. Kort, een bibliotheek van phage-getoonde peptiden werd geïncubeerd in een plaat bedekt met FGFR2. Vervolgens werd ongebonden faag afgespoeld door TBST (TBS + 0,1% [v/v] tween-20), en gebonden faag werd geeleerd met 0,2 M glycine-HCL buffer (pH 2,2). De befaamde faag werd verder versterkt en gebruikt als input voor de volgende biopanning. Na drie rondes biopanning werden de peptide sequenties van individuele faag klonen geïdentificeerd door DNA-sequencing. Tot slot, de afgeschermde peptiden werden gesynthetiseerd en geanalyseerd voor affiniteit en biologische activiteit.

Het verkrijgen van een high Affinity Small peptide targeting FGFR2.
Voor het scherm phages targeting FGFR2, een Ph.D.-7 bibliotheek werd gebruikt in deze studie. Een schematische weergave van de workflow wordt weergegeven in Figuur 1. In dit proces werd het aantal faag input (Pfu) onveranderd gehouden, terwijl de coating concentratie van FGFR2 proteïne geleidelijk werd verlaagd. De resultaten van de faag titer suggereerden dat het aantal hersteld...

Watch this Scientific Journal Video about Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library at JoVE.com

Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library

Hierin presenteren we een gedetailleerd protocol voor het screenen van kleine peptiden die binden aan FGFR2 met behulp van een faag display peptide Library. Verder analyseren we de affiniteit van de geselecteerde peptiden naar FGFR2 in vitro en het vermogen om celproliferatie te onderdrukken.

Screening en identificatie van kleine peptiden gericht op fibroblast groei factor Receptor2 met behulp van een Phage display peptide Library

The human Fibroblast Growth Factor Receptor (FGFR) family comprises four members, namely, FGFR1, FGFR2, FGFR3, and FGFR4, that are involved in various ...

Vergeleken met andere methoden, dit protocol is gemakkelijker om uit te vinden nieuwe antagonisters, agonisteres, en allosterische modulatoren kwantitatief en kwalitatief zonder te weten de hydro-verdunning structuur en de vorming van het doeleiwit. Dit protocol is hoog efficiënt, gemakkelijk te hanteren, zuinig en commercieel beschikbaar. Combineer deze hoge doorvoer screening methode met ITC-analyse, de functionele kleine peptiden kunnen kwantitatief en kwalitatief worden verkregen.Het aantonen van de procedure zal Ying Zhao en Qiang Wang, afgestudeerde studenten van ons laboratorium. Om deze procedure te beginnen, bereid een oplossing van FGFR2 in coating buffer bij een concentratie van 10 microgram per milliliter. Voeg een milliliter van de oplossing aan een 35 vierkante centimeter schotel en wervel herhaaldelijk totdat het oppervlak volledig nat is.Incubeer 's nachts bij vier graden Celsius met schudden. Giet de volgende dag de coatingoplossing af en voeg de voorbereide blokkeringsoplossing toe. Broed op vier graden Celsius gedurende ten minste een uur, gooi dan de blokkerende oplossing weg en was de plaat snel zes keer met TBST terwijl u ervoor zorgt dat de schotel niet uitdroogt.Reconstrueer de originele faagbibliotheek in één milliliter tbst en voeg dit toe aan het gecoate gerecht. Wieg de plaat zachtjes op een shaker bij kamertemperatuur gedurende twee uur. Gooi hierna de supernatant weg en was de schotel 10 keer met TBST.Elute de gebonden faag door het toevoegen van een milliliter van 0,2 molaire glycine HCL aan de schotel en schommelen zachtjes op kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Breng het eluent over in een gesteriliseerde microcentrifugebuis en neutraliseer het met 100 microliter van één kies Tris-HCL bij pH 9.1. Verwarm eerst de bereide LB- en IPTG X-Gal-platen op 37 graden Celsius gedurende ten minste een uur voor gebruik.Bereid met pipettips met filtercartridges 100 microliter van tienvoudige verdunningen van het eluent in LB. Nadat de voorbereide E.coli-cultuur halverwege de logfase is bereikt, moet u 200 microliters van de cultuur in gesteriliseerde microcentrifugebuizen voor elke eluent verdunning. Om de infectie te starten, voeg 50 microliter van elke verdunning toe aan de buizen die de E.coli-cultuur bevatten. Vortex snel en incubeer bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten.Gebruik vervolgens coatingsticks om de LB- en IPTG X-GAL-platen te coaten met 90 microliter van dit mengsel. Na vijf minuten, omkeren van de platen en incubeer ze 's nachts op 37 graden Celsius. Tel plaques wanneer ze verschijnen.Om te beginnen verdun de nachtcultuur in 20 milliliter LB in een 250 milliliter Erlenmeyer-kolf. Voeg de unamplified eluent en incubeer bij 37 graden Celsius met krachtig schudden voor 4-1/2 uur. Vervolgens centrifuge de cultuur op 12,000 keer G en vier graden Celsius gedurende 10 minuten.Breng de supernatant over op een verse buis. Centrifuge opnieuw met dezelfde omstandigheden en gooi de pellet. Breng de bovenste 80% van het supernatant over op een verse buis en voeg het toe aan het 1/6e volume van 20% polyethyleenglycol en 2,5 molaire natriumchloride.Laat de faag 's nachts neerslaan bij vier graden Celsius. De volgende dag, centrifuge de neergeslagen faag op 12,000 keer G en vier graden Celsius gedurende 15 minuten. Gooi de supernatant en centrifuge opnieuw met dezelfde voorwaarden.Gebruik een pipet om de resterende supernatant te verwijderen. Resuspend de pellet in een milliliter van TBS en breng de supernatant naar een microcentrifuge buis. Centrifuge op 12.000 keer G en vier graden Celsius gedurende vijf minuten.Breng het supernatant over op een verse microcentrifugebuis en neerslaan opnieuw door 1/6e volume van 20% polyethyleenglycol en 2,5 molaire natriumchloride toe te voegen. Incubeer op ijs voor 15 tot 60 minuten. Vervolgens centrifugeren op 12,000 keer G en vier graden Celsius gedurende 10 minuten.Gooi de supernatant en centrifuge opnieuw met dezelfde voorwaarden. Gebruik een pipet om de resterende supernatant te verwijderen. Resuspend de pellet in 200 microliters van TBS en centrifuge voor een extra minuut om onzuiverheden te verwijderen.Breng vervolgens de supernatant over naar een verse microcentrifugebuis om het versterkte eluent te verkrijgen. In deze studie wordt het aantal faaginput ongewijzigd gehouden, terwijl de coatingconcentratie van FGFR2-eiwit geleidelijk wordt verminderd. De resultaten van de faagtiter suggereren dat het aantal herstelde fagen geleidelijk toeneemt en dat er na drie ronden een 65-voudige toename is ten opzichte van die van de eerste ronde.Vervolgens wordt een ITC-experiment uitgevoerd om de affiniteit van het kleine peptide op FGFR2 te meten. De resultaten geven aan dat het SP1 peptide een hoge affiniteit heeft met FGFR2. Deze gegevens tonen de efficiëntie van het screeningprotocol aan.Om de biologische activiteit van het SP1-peptide te onderzoeken, wordt een fibroblastproliferatietest uitgevoerd met behulp van een CCK-8-kit. BALB/C3T3 worden in verschillende concentraties geïncubeerd met het SP1 peptide. De resultaten suggereren dat de SP1 peptide onderdrukt de groei van de cellen.De besmetting door wilde fagen moet hier worden vermeden. Zorg ervoor dat u aerosol-resistente pipet tips te gebruiken. Terwijl de groei door het verkrijgen van faagversterking.Deze procedure kan ook worden gebruikt bij het screenen van kleine peptiden die binden aan koolhydraten, kweekcellen en weefsels. Deze peptiden kunnen verdere versterking over diagnostische en gerichte

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

Gene Levering en Transfectie in Human alvleesklierkankercellen met epidermale groeifactor receptor-gerichte Gelatine-Based Engineered Nanovectors

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

Bacteriële Detection &amp; Identification gebruiken elektrochemische sensoren

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Generation and Recovery of ÃƒÅ½Ã‚Â²-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Generatie en terugwinning van β-cel sferoïden Van Step-groei PEG-peptide Hydrogelen

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional  microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for  ...

Observing and Quantifying Fibroblast-mediated Fibrin Gel Compaction

Observeren en kwantificeren van fibroblast-gemedieerde Fibrin Gel Compaction

Cells embedded in collagen and fibrin gels attach and exert traction forces on the fibers of the gel. These forces can lead to local and global ...

Electrospinning Growth Factor Releasing Microspheres into Fibrous Scaffolds

Elektrospinproces Growth Factor Releasing microsferen in Stapel- Steigers

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth.  This system incorporates mechanical, topographical, ...

Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

Levering van eiwitten, peptiden of Cell-ondoordringbare Kleine moleculen in levende cellen door incubatie met de endosomolytisch reagens dfTAT

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the ...

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

Het bestuderen van de stoichiometrie van de epidermale groeifactor receptor in intacte cellen met Correlatieve Microscopy

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

A Rapid and Quantitative Fluorimetric Method for Protein-Targeting Small Molecule Drug Screening

Een snelle en kwantitatieve Fluorimetrische Methode voor-eiwit targeting Small Molecule drugscontrole

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold ...

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

Polyelectrolyte Complex voor Heparine Binding Domain osteogeen Growth Factor Delivery

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

Initial Evaluation of Antibody-conjugates Modified with Viral-derived Peptides for Increasing Cellular Accumulation and Improving Tumor Targeting

Eerste beoordeling van antilichaam-geconjugeerde bewerkt met virale afkomstige peptiden voor verhoging van cellulaire accumulatie en verbetering van de Tumor gericht op

Antibody-conjugates (ACs) modified with virus-derived peptides are a potentially powerful class of tumor cell delivery agents for molecular payloads used ...