Name: screening and identification of small peptides targeting fibroblast growth factor receptor2 using a phage display peptide library
Uploaded: 2019-09-30T15:00:00
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Diese Arbeit wurde vom Science and Technology Program of Guangzhou (Nr. 2016201604030039) unterstützt.

1. Reagenzzubereitung
<ol><li>LB (Lysogeny-Brühe) Medium: 1 g Trypton, 0,5 g Hefeextrakt und 0,5 g NaCl in 100 mlH2O. Autoklav auflösen und bei 4 °C lagern.</li>
	<li>Tetracyclin-Bestand: Bereiten Sie 20 mg/ml in 1:1 Ethanol:H2O. bei -20 °C auf, und Wirbel vor der Verwendung.</li>
	<li>IPTG/X-gal-Lösung: Mischen Sie 0,5 g IPTG (Isopropyl-D-1-Thiogalactopyranosid) und 0,4 g X-gal (5-bromo-4-chlor-3-indolyl-D-Galactosid) in 10 ml DMF (Dimethylformamid). Die Lösung kann bei -20 °C für ein Jah...

<ol>
	<li>Eswarakumar, V. P., Lax, I., Schlessinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+signaling+by+fibroblast+growth+factor+receptors.">Cellular signaling by fibroblast growth factor receptors.</a> Cytokine &amp; Growth Factor Reviews. 16 (2), 139-149 (2005).</li><li>Turner, N., Grose, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+signaling:+from+development+to+cancer.">Fibroblast growth factor signaling: from development to cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 10 (2), 116-129 (2010).</li><li>Cancer Genome Atlas Network. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+molecular+portraits+of+human+breast+tumors.">Comprehensive molecular portraits of human breast tumors.</a> Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).</li><li>Matsumoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGFR2+gene+amplification+and+clinicopathological+features+in+gastric+cancer.">FGFR2 gene amplification and clinicopathological features in gastric cancer.</a> British Journal of Cancer. 106 (4), 727-732 (2012).</li><li>Weiss, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequent+and+focal+FGFR1+amplification+associates+with+therapeutically+tractable+FGFR1+dependency+in+squamous+cell+lung+cancer.">Frequent and focal FGFR1 amplification associates with therapeutically tractable FGFR1 dependency in squamous cell lung cancer.</a> Science Translational Medicine. 2 (62), 62ra93 (2010).</li><li>Babina, I. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I/IIa+study+evaluating+the+safety,+efficacy,+pharmacokinetics,+and+pharmacodynamics+of+lucitanib+in+advanced+solid+tumors.">Phase I/IIa study evaluating the safety, efficacy, pharmacokinetics, and pharmacodynamics of lucitanib in advanced solid tumors.</a> Annals of Oncology. 25 (11), 2244-2251 (2014).</li><li>French, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+FGFR4+inhibits+hepatocellular+carcinoma+in+preclinical+mouse+models.">Targeting FGFR4 inhibits hepatocellular carcinoma in preclinical mouse models.</a> PLoS ONE. 7 (5), e36713 (2012).</li><li>Martinez-Torrecuadrada, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+extracellular+domain+of+fibroblast+growth+factor+receptor+3+with+human+single-chain+Fv+antibodies+inhibits+bladder+carcinoma+cell+line+proliferation.">Targeting the extracellular domain of fibroblast growth factor receptor 3 with human single-chain Fv antibodies inhibits bladder carcinoma cell line proliferation.</a> Clinical Cancer Research. 11 (17), 6280-6290 (2005).</li><li>Palamakumbura, A. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancement+and+applications+of+peptide+phage+display+technology+in+biomedical+science.">Advancement and applications of peptide phage display technology in biomedical science.</a> Journal of Biomedical Science. 23, 8 (2016).</li><li>Kay, B. K., Kasanov, J., Yamabhai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+phage-displayed+combinatorial+peptide+libraries.">Screening phage-displayed combinatorial peptide libraries.</a> Methods. 24 (3), 240-246 (2001).</li><li>Rodi, D. J., Makowski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage-display+technology+-+Finding+a+needle+in+a+vast+molecular+haystack.">Phage-display technology - Finding a needle in a vast molecular haystack.</a> Current Opinion in Biotechnology. 10, 87-93 (1999).</li><li>Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+M13+for+phage+display.">Engineering M13 for phage display.</a> Biomolecular Engineering. 18, 57-63 (2002).</li><li>Hamzeh-Mivehroud, M., Mahmoudpour, A., Dastmalchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+new+peptide+ligands+for+epidermal+growth+factor+receptor+using+phage+display+and+computationally+modeling+their+mode+of+binding.">Identification of new peptide ligands for epidermal growth factor receptor using phage display and computationally modeling their mode of binding.</a> Chemical Biology &amp; Drug Design. 79 (3), 246-259 (2012).</li><li>Askoxylakis, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide-based+targeting+of+the+platelet-derived+growth+factor+receptor+beta.">Peptide-based targeting of the platelet-derived growth factor receptor beta.</a> Molecular Imaging and Biology. 15 (2), 212-221 (2013).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transdermal+protein+delivery+by+a+coadministered+peptide+identified+via+phage+display.">Transdermal protein delivery by a coadministered peptide identified via phage display.</a> Nature Biotechnology. 24 (4), 455-460 (2006).</li><li>Azzazy, H. M., Highsmith, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+display+technology:+clinical+applications+and+recent+innovations.">Phage display technology: clinical applications and recent innovations.</a> Clinical Biochemistry. 35, 425-445 (2002).</li><li>Pasqualini, R., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+targeting+In+vivo+using+phage+display+peptide+libraries.">Organ targeting In vivo using phage display peptide libraries.</a> Nature. 380 (6572), 364-366 (1996).</li><li>Liu, R., Li, X., Xiao, W., Lam, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-targeting+peptides+from+combinatorial+libraries.">Tumor-targeting peptides from combinatorial libraries.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 110-111, 13-37 (2017).</li><li>Binetruy-Tournaire, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+peptide+blocking+vascular+endothelial+growth+factor+(VEGF)-mediated+angiogenesis.">Identification of a peptide blocking vascular endothelial growth factor (VEGF)-mediated angiogenesis.</a> The EMBO Journal. 19, 1525-1533 (2000).</li><li>Peng, Y., Zhang, Y., Mitchell, W. J., Zhang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Lipopolysaccharide-Targeted+Peptide+Mimic+Vaccine+against+Q+Fever.">Development of a Lipopolysaccharide-Targeted Peptide Mimic Vaccine against Q Fever.</a> Journal of Immunology. 189, 4909-4920 (2012).</li><li>Lamichhane, T. N., Abeydeera, N. D., Duc, A. C., Cunningham, P. R., Chow, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+Peptides+Targeting+Helix+31+of+Bacterial+16S+Ribosomal+RNA+by+Screening+M13+Phage-Display+Libraries.">Selection of Peptides Targeting Helix 31 of Bacterial 16S Ribosomal RNA by Screening M13 Phage-Display Libraries.</a> Molecules. 16, 1211-1239 (2011).</li><li>Sahin, D., Taflan, S. O., Yartas, G., Ashktorab, H., Smoot, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+Identification+of+Peptides+Specifically+Targeted+to+Gastric+Cancer+Cells+from+a+Phage+Display+Peptide+Library.+Asian+Pacific.">Screening and Identification of Peptides Specifically Targeted to Gastric Cancer Cells from a Phage Display Peptide Library. Asian Pacific.</a> Journal of Cancer Prevention. 19 (4), 927-932 (2018).</li><li>Kelly, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+nanoparticles+for+imaging+incipient+pancreatic+ductal+adenocarcinoma.">Targeted nanoparticles for imaging incipient pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> PLOS Medicine. 5 (4), e85 (2008).</li><li>Sugihara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+pro-apoptotic+peptides+as+potential+therapy+for+peritoneal+endometriosis.">Development of pro-apoptotic peptides as potential therapy for peritoneal endometriosis.</a> Nature Communications. 5, 4478 (2014).</li><li>Rafii, S., Avecilla, S. T., Jin, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+vasculature+address+book:+Identification+of+stage-specific+tumor+vessel+zip+codes+by+phage+display.">Tumor vasculature address book: Identification of stage-specific tumor vessel zip codes by phage display.</a> Cancer Cell. 4, 331-333 (2003).</li><li>Arap, W., Pasqualini, R., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+Treatment+by+Targeted+Drug+Delivery+to+Tumor+Vasculature+in+a+Mouse+Model.">Cancer Treatment by Targeted Drug Delivery to Tumor Vasculature in a Mouse Model.</a> Science. 279, 377-390 (1997).</li></ol>

Eine kombinatorische Phagenbibliothek ist ein leistungsfähiges und effektives Werkzeug für das Hochdurchsatzscreening neuartiger Peptide, die Zielmoleküle binden und ihre Funktion regulieren können13. Derzeit haben Phagenanzeige Peptidbibliotheken eine breite Palette von Anwendungen. Zum Beispiel können sie für die Auswahl von bioaktiven Peptiden verwendet werden, die an Rezeptorproteine23gebunden sind, Nicht-Protein-Targets24,<sup c...

Fibroblasten-Wachstumsfaktorrezeptoren (GFR) spielen eine Schlüsselrolle bei der Zellproliferation, Wundheilung und Angiogenese in vivo1. Aberrante Aktivierung der FGFR-Signalisierung, die bei einer Vielzahl von Tumoren beobachtet wurde2,3,4,5 umfasst Genverstärkung, Genmutationen, Chromosomenaberrationen und übermäßige Ligandensekretion6 . Viele Inhibitoren, die auf FGFRs abzielen, haben in klinischen Studien vielversprechende therapeutische Wirkungen gezeigt und werden hauptsächlich in drei Typen eingeteilt: (1) kleine Molekülkinase-Inhibitoren, die an die intrazelluläre Domäne von FGFR binden, (2) Antagonisten, die auf die extrazelluläres Segment und (3) FGF-Ligandenfallen6. Obwohl einige der kleinen Molekülkinase-Inhibitoren sowohl in vitro als auch in vivo7eine gute therapeutische Wirkung haben, haben die meisten von ihnen eine schlechte Zielspezifität und zeigen nebenwirkungende Wirkungen wie Bluthochdruck8. Die Mehrheit der Antagonisten sind monoklonale Antikörper9,10 und Polypeptide11. Peptide haben Vorteile gegenüber kleinen Molekülen aufgrund ihrer Spezifität und niedrigeren Nebenwirkungen. Sie behalten auch Zelldurchlässigkeit und akkumulieren nicht in bestimmten Organen im Vergleich zu Protein-Medikamente12. Daher sind gezielte kleine Peptide sowohl wirksame als auch prospektive therapeutische Wirkstoffe.
Phage Display-Technologie ist ein einfaches, aber leistungsfähiges Werkzeug zur Identifizierung von kleinen Peptiden, die an ein bestimmtes Molekül binden können13,14,15. Wir verwendeten eine Phagenanzeige Peptid-Bibliothek, die auf einem einfachen M13-Phagen mit über 109 verschiedenen Peptidsequenzen am Schwanz für die Bindung an das Zielmolekül basiert (siehe Tabelle der Materialien)16. Durch die hohe Affinität von Phagen zum gegebenen Molekül können ungebundene Phagen weggewaschen werden und nur eng gebundene Phagen mit den gewünschten kurzen Peptiden erhalten bleiben. Die gegebenen molekularen Ziele können immobilisierte Proteine17,18, Kohlenhydrate, kultivierte Zellen oder sogar anorganische Materialien19,20sein. Ein spannender Fall wurde berichtet, bei dem organspezifische Peptide in vivo mit der Phagenanzeigetechnologie21ausgewählt wurden. Zu den Vorteilen der Phagenanzeige-Technologie gehören hoher Durchsatz, einfache Bedienung, niedrige Kosten und eine breite Palette von Anwendungen22.
In dieser Studie bieten wir ein detailliertes Protokoll zum Screening kleiner Peptide, die mit hilfe einer Phagenanzeigebibliothek an das immobilisierte Protein (FGFR2) binden. Die Wirksamkeit der Technologie wird auch untersucht, indem die Affinität des erhaltenen Peptids zu FGFR2 durch Isothermale Titrationskalorimetrie (ITC) und die biologische Aktivität durch einen Zellproliferationstest gemessen wird. Die Methode kann für das Screening von kleinen Peptiden erweitert werden, die an Kohlenhydrate, kultivierte Zellen oder sogar anorganische Materialien binden.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m Filter</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MPGP002A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 cm2 Small dish</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>150460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Guangzhou chemical reagent factory</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-96 gIII sequencing primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Synthesis from Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Nest</td>
			<td>701001-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST004D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto-Tryptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>L0037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c 3T3 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-&#173;6587</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Biodragon</td>
			<td>BD-M10110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCK-8 kit</td>
			<td>DOJINDO</td>
			<td>CK04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>sh30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMF</td>
			<td>Newprobe</td>
			<td>PB10247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15576028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2 Protein</td>
			<td>Sino Biological Inc.</td>
			<td>10014-HNAE</td>
			<td>Purity &#62;95%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITC200 system</td>
			<td>MicroCal Omega</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Guangzhou chemical reagent factory</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaI</td>
			<td>Bidepharm</td>
			<td>BD40879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Guangzhou chemical reagent factory</td>
			<td>1310-73-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG&#8211;8000</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2139-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ph.D.-7 phage display peptide library kit</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E8100S</td>
			<td>Containing the Ph.D.-7 phage library, E. coli ER2738 host strain and M13KE control phage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant FGFR2 extracellular domain proteins</td>
			<td>Sino Biological Inc.</td>
			<td>10824-H08H</td>
			<td>Purity &#62; 97%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small peptide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Synthesis from GL Biochem Ltd. (Shanghai, China)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-SHS-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SLF-T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

screening and identification of small peptides targeting fibroblast growth factor receptor2 using a phage display peptide library

Die menschliche Fibroblast Growth Factor Receptor (FGFR) Familie besteht aus vier Mitgliedern, nämlich FGFR1, FGFR2, FGFR3 und FGFR4, die an verschiedenen biologischen Aktivitäten wie Zellproliferation, Überleben, Migration und Differenzierung beteiligt sind. Mehrere Aberrationen im FGFR-Signalweg aufgrund von Mutationen oder Genamplifikationsereignissen wurden bei verschiedenen Krebsarten identifiziert. Daher konzentrierte sich die jüngste Forschung auf die Entwicklung von Strategien mit therapeutischer Ausrichtung von FGFRs. Aktuelle FGFR-Inhibitoren in verschiedenen Stadien der präklinischen und klinischen Entwicklung umfassen entweder kleine Molekülinhibitoren von Tyrosin-Kinasen oder monoklonale Antikörper, bei dem nur wenige Peptid-basierte Inhibitoren in der Pipeline sind. Hier stellen wir ein Protokoll mit Phagenanzeige-Technologie zur Verfügung, um kleine Peptide als Antagonisten von FGFR2 zu überprüfen. Kurz gesagt, wurde eine Bibliothek von Phagen-angezeigten Peptiden in einer Platte mit FGFR2 beschichtet inkubiert. Anschließend wurde ungebundener Phagen durch TBST abgewaschen (TBS + 0,1% [v/v] Tween-20), und gebundener Phagen wurde mit 0,2 M Glycin-HCl-Puffer (pH 2.2) eluiert. Der eluierte Phagen wurde weiter verstärkt und als Input für die nächste Runde der Biopannierung verwendet. Nach drei Runden Biopanning wurden die Peptidsequenzen einzelner Phagenklone durch DNA-Sequenzierung identifiziert. Schließlich wurden die gescreenten Peptide synthetisiert und auf Affinität und biologische Aktivität analysiert.

Erhalten Sie eine hohe Affinität kleine Peptid Targeting FGFR2.
Um Phagen zu überprüfen, die auf FGFR2 abzielen, wurde in dieser Studie eine Ph.D.-7-Bibliothek verwendet. Eine schematische Darstellung des Workflows ist in Abbildung 1dargestellt. Dabei blieb die Anzahl der Phageneingänge (PFU) unverändert, während die Beschichtungskonzentration des FGFR2-Proteins schrittweise reduziert wurde. Die Ergebnisse des Phagen-Titers legten nahe, daß...

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Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library

Hierin präsentieren wir ein detailliertes Protokoll zum Screening kleiner Peptide, die mit einer Phagenanzeige-Peptidbibliothek an FGFR2 binden. Wir analysieren weiter die Affinität der ausgewählten Peptide zu FGFR2 in vitro und seine Fähigkeit, die Zellproliferation zu unterdrücken.

Screening und Identifizierung von kleinen Peptiden Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 mit einem Phage Display Peptid Bibliothek

The human Fibroblast Growth Factor Receptor (FGFR) family comprises four members, namely, FGFR1, FGFR2, FGFR3, and FGFR4, that are involved in various ...

Im Vergleich zu anderen Methoden ist dieses Protokoll leichter, neue Antagonisten, Agonister und allosterische Modulatoren quantitativ und qualitativ zu finden, ohne die Hydroverdünnungsstruktur und die Bildung des Zielproteins zu kennen. Dieses Protokoll ist hocheffizient, einfach zu handhaben, wirtschaftlich und kommerziell erhältlich. Kombinieren Sie diese Hochdurchsatz-Screening-Methode mit der ITC-Analyse, die funktionellen kleinen Peptide können quantitativ und qualitativ erhalten werden.Demonstriert wird das Verfahren von Ying Zhao und Qiang Wang, Absolventen unseres Labors. Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie eine Lösung von FGFR2 in Beschichtungspuffer mit einer Konzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliter vor. Einen Milliliter der Lösung zu einer 35-Quadratzentimeter-Schale geben und immer wieder wirbeln, bis die Oberfläche vollständig nass ist.Über Nacht bei vier Grad Celsius mit Schütteln bebrüten. Gießen Sie am nächsten Tag die Beschichtungslösung ab und fügen Sie die vorbereitete Blockierlösung hinzu. Bei vier Grad Celsius mindestens eine Stunde inkubieren, dann die Sperrlösung entsorgen und die Platte mit TBST sechsmal waschen und gleichzeitig sicherstellen, dass die Schale nicht austrocknet.Rekonstituieren Sie die ursprüngliche Phagenbibliothek in einem Milliliter TBST und fügen Sie diese der beschichteten Schale hinzu. Schaukeln Sie die Platte vorsichtig auf einem Shaker bei Raumtemperatur für zwei Stunden. Danach den Überstand entsorgen und die Schale 10 Mal mit TBST waschen.Elute den gebundenen Phagen, indem Sie einen Milliliter 0,2 Molglycin HCL in die Schale geben und bei Raumtemperatur 10 Minuten sanft schaukeln. Übertragen Sie das Eluent in ein sterilisiertes Mikrozentrifugenrohr und neutralisieren Sie es mit 100 Mikrolitern eines Molaren Tris-HCL bei pH 9,1. Zuerst die vorbereiteten LB- und IPTG X-Gal-Platten bei 37 Grad Celsius mindestens eine Stunde vor Gebrauch vorwärmen.Mit Pipettenspitzen mit Filterpatronen 100 Mikroliter zehnfacher Verdünnungen des Eluenten in LB zubereiten. Nachdem die vorbereitete E.coli-Kultur die Mid-Log-Phase erreicht hat, geben Sie 200 Mikroliter der Kultur in sterilisierte Mikrozentrifugenröhren eins für jede Eluentverdünnung. Um die Infektion zu initiieren, fügen Sie 50 Mikroliter jeder Verdünnung in die Röhren, die die E.coli-Kultur enthalten. Wirbel schnell und inkubieren bei Raumtemperatur für fünf Minuten.Dann verwenden Sie Beschichtungsstäbe, um die LB- und IPTG X-GAL-Platten mit 90 Mikrolitern dieser Mischung zu beschichten. Nach fünf Minuten die Platten umkehren und über Nacht bei 37 Grad Celsius bebrüten. Zählen Sie Plaketten, wenn sie erscheinen.Zunächst die Nachtkultur in 20 Milliliter LB in einem 250-Milliliter-Erlenmeyerkolben verdünnen. Fügen Sie das ungezügelte Eluent hinzu und brüten Bei 37 Grad Celsius mit kräftigem Schütteln für 4-1/2 Stunden. Als nächstes zentrifugieren Sie die Kultur bei 12.000 Mal G und vier Grad Celsius für 10 Minuten.Übertragen Sie den Überstand auf ein frisches Rohr. Zentrifuge wieder unter den gleichen Bedingungen und entsorgen Sie das Pellet. Übertragen Sie die oberen 80% des Überstandes in ein frisches Rohr und fügen Sie es zu 1/6 Volumen von 20%Polyethylenglycol und 2,5 Mol Natriumchlorid.Lassen Sie den Phagen über Nacht bei vier Grad Celsius ausfallen. Am nächsten Tag zentrifugieren Sie den gefällten Phagen bei 12.000 Mal G und vier Grad Celsius für 15 Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und die Zentrifuge unter den gleichen Bedingungen erneut.Verwenden Sie eine Pipette, um den Restüberstand zu entfernen. Das Pellet in einem Milliliter TBS wieder aufhängen und den Überstand in ein Mikrozentrifugenrohr übertragen. Zentrifuge bei 12.000 mal G und vier Grad Celsius für fünf Minuten.Übertragen Sie den Überstand auf ein frisches Mikrozentrifugenrohr und fällen Sie erneut, indem Sie 1/6 Volumen von 20%Polyethylenglycol und 2,5 Mol Natriumchlorid hinzufügen. 15 bis 60 Minuten auf Eis bebrüten. Als nächstes Zentrifuge bei 12.000 mal G und vier Grad Celsius für 10 Minuten.Entsorgen Sie den Überstand und die Zentrifuge unter den gleichen Bedingungen erneut. Verwenden Sie eine Pipette, um den Restüberstand zu entfernen. Setzen Sie das Pellet in 200 Mikroliter TBS und Zentrifuge für eine zusätzliche Minute aus, um Verunreinigungen zu entfernen.Dann den Überstand in ein frisches Mikrozentrifugenrohr geben, um das verstärkte Eluent zu erhalten. In dieser Studie wird die Anzahl der Phageneingaben unverändert gehalten, während die Beschichtungskonzentration von FGFR2-Protein enden wird. Die Ergebnisse des Phagen-Titers deuten darauf hin, dass die Zahl der wiedergewonnenen Phagen allmählich zunimmt und dass nach drei Runden eine 65-fache Zunahme im Vergleich zur ersten Runde zu verzeichnen ist.Anschließend wird ein ITC-Experiment durchgeführt, um die Affinität des kleinen Peptids zu FGFR2 zu messen. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass das SP1-Peptid eine hohe Affinität zu FGFR2 hat. Diese Daten zeigen die Effizienz des Screening-Protokolls.Um die biologische Aktivität des SP1-Peptids zu untersuchen, wird ein Fibroblasten-Proliferationstest mit einem CCK-8-Kit durchgeführt. BALB/C3T3 werden mit dem SP1-Peptid in unterschiedlichen Konzentrationen inkubiert. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass das SP1-Peptid das Wachstum der Zellen unterdrückt.Hier muss die Kontamination durch Wildphagen vermieden werden. Achten Sie darauf, aerosolbeständige Pipettenspitzen zu verwenden. Während Wachstum durch die Erlangung der Phagenverstärkung.Dieses Verfahren kann auch beim Screening von kleinen Peptiden verwendet werden, die an Kohlenhydrate, Kulturzellen und Gewebe binden. Diese Peptide können eine weitere Amplifikation über diagnostische und gezielte

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

Gentransfer und Transfektion in humanen Pankreaskarzinom-Zellen mit Epidermal Growth Factor Gelatin-Based Engineered Nanovektoren Rezeptor-gezielte

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

Forschung

Biotechnik

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

Bakterielle Erkennung und Identifizierung mit elektrochemischen Sensoren

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Generation and Recovery of ÃƒÅ½Ã‚Â²-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Erzeugung und Verwertung von β-Zellen Spheroids Von Step-Wachstum PEG-Peptid-Hydrogele

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Observing and Quantifying Fibroblast-mediated Fibrin Gel Compaction

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During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

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