Name: screening and identification of small peptides targeting fibroblast growth factor receptor2 using a phage display peptide library
Uploaded: 2019-09-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי תוכנית המדע והטכנולוגיה של גואנגג'ואו (No. 2016201604030039).

1. הכנה מגיב
<ol><li>LB (ציר הקימוט) בינוני: לפזר 1 גרם של טריטונים, 0.5 g של תמצית שמרים, ו 0.5 g של הנאל ב 100 mL של H2O. אוטוקלב וחנות ב 4 ° c.</li>
	<li>טטרציקלין מניות: להכין 20 מ"ג/mL ב 1:1 אתנול: H2O. Store-20 ° c, ומערבולת לפני השימוש.</li>
	<li>הפתרון IPTG/X-גל: לערבב 0.5 g של IPTG (איזופרופיל β-D-1-thioגלאויד) ו 0.4 g של X-גל (5-br...

<ol>
	<li>Eswarakumar, V. P., Lax, I., Schlessinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+signaling+by+fibroblast+growth+factor+receptors.">Cellular signaling by fibroblast growth factor receptors.</a> Cytokine &amp; Growth Factor Reviews. 16 (2), 139-149 (2005).</li><li>Turner, N., Grose, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+signaling:+from+development+to+cancer.">Fibroblast growth factor signaling: from development to cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 10 (2), 116-129 (2010).</li><li>Cancer Genome Atlas Network. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+molecular+portraits+of+human+breast+tumors.">Comprehensive molecular portraits of human breast tumors.</a> Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).</li><li>Matsumoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGFR2+gene+amplification+and+clinicopathological+features+in+gastric+cancer.">FGFR2 gene amplification and clinicopathological features in gastric cancer.</a> British Journal of Cancer. 106 (4), 727-732 (2012).</li><li>Weiss, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequent+and+focal+FGFR1+amplification+associates+with+therapeutically+tractable+FGFR1+dependency+in+squamous+cell+lung+cancer.">Frequent and focal FGFR1 amplification associates with therapeutically tractable FGFR1 dependency in squamous cell lung cancer.</a> Science Translational Medicine. 2 (62), 62ra93 (2010).</li><li>Babina, I. S., Turner, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+challenges+in+targeting+FGFR+signaling+in+cancer.">Advances and challenges in targeting FGFR signaling in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (5), 318-322 (2017).</li><li>Katoh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+receptors+as+treatment+targets+in+clinical+oncology.">Fibroblast growth factor receptors as treatment targets in clinical oncology.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 16 (2), 105-122 (2019).</li><li>Soria, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I/IIa+study+evaluating+the+safety,+efficacy,+pharmacokinetics,+and+pharmacodynamics+of+lucitanib+in+advanced+solid+tumors.">Phase I/IIa study evaluating the safety, efficacy, pharmacokinetics, and pharmacodynamics of lucitanib in advanced solid tumors.</a> Annals of Oncology. 25 (11), 2244-2251 (2014).</li><li>French, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+FGFR4+inhibits+hepatocellular+carcinoma+in+preclinical+mouse+models.">Targeting FGFR4 inhibits hepatocellular carcinoma in preclinical mouse models.</a> PLoS ONE. 7 (5), e36713 (2012).</li><li>Martinez-Torrecuadrada, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+extracellular+domain+of+fibroblast+growth+factor+receptor+3+with+human+single-chain+Fv+antibodies+inhibits+bladder+carcinoma+cell+line+proliferation.">Targeting the extracellular domain of fibroblast growth factor receptor 3 with human single-chain Fv antibodies inhibits bladder carcinoma cell line proliferation.</a> Clinical Cancer Research. 11 (17), 6280-6290 (2005).</li><li>Palamakumbura, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysyl+oxidase+propeptide+inhibits+prostate+cancer+cell+growth+by+mechanisms+that+target+FGF-2-cell+binding+and+signaling.">Lysyl oxidase propeptide inhibits prostate cancer cell growth by mechanisms that target FGF-2-cell binding and signaling.</a> Oncogene. 28 (38), 3390-3400 (2009).</li><li>Ladner, R. C., Sato, A. K., Gorzelany, J., de Souza, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+display-derived+peptides+as+therapeutic+alternatives+to+antibodies.">Phage display-derived peptides as therapeutic alternatives to antibodies.</a> Drug Discovery Today. 9 (12), 525-529 (2004).</li><li>Wu, C. H., Liu, I. J., Lu, R. M., Wu, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancement+and+applications+of+peptide+phage+display+technology+in+biomedical+science.">Advancement and applications of peptide phage display technology in biomedical science.</a> Journal of Biomedical Science. 23, 8 (2016).</li><li>Kay, B. K., Kasanov, J., Yamabhai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+phage-displayed+combinatorial+peptide+libraries.">Screening phage-displayed combinatorial peptide libraries.</a> Methods. 24 (3), 240-246 (2001).</li><li>Rodi, D. J., Makowski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage-display+technology+-+Finding+a+needle+in+a+vast+molecular+haystack.">Phage-display technology - Finding a needle in a vast molecular haystack.</a> Current Opinion in Biotechnology. 10, 87-93 (1999).</li><li>Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+M13+for+phage+display.">Engineering M13 for phage display.</a> Biomolecular Engineering. 18, 57-63 (2002).</li><li>Hamzeh-Mivehroud, M., Mahmoudpour, A., Dastmalchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+new+peptide+ligands+for+epidermal+growth+factor+receptor+using+phage+display+and+computationally+modeling+their+mode+of+binding.">Identification of new peptide ligands for epidermal growth factor receptor using phage display and computationally modeling their mode of binding.</a> Chemical Biology &amp; Drug Design. 79 (3), 246-259 (2012).</li><li>Askoxylakis, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide-based+targeting+of+the+platelet-derived+growth+factor+receptor+beta.">Peptide-based targeting of the platelet-derived growth factor receptor beta.</a> Molecular Imaging and Biology. 15 (2), 212-221 (2013).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transdermal+protein+delivery+by+a+coadministered+peptide+identified+via+phage+display.">Transdermal protein delivery by a coadministered peptide identified via phage display.</a> Nature Biotechnology. 24 (4), 455-460 (2006).</li><li>Azzazy, H. M., Highsmith, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+display+technology:+clinical+applications+and+recent+innovations.">Phage display technology: clinical applications and recent innovations.</a> Clinical Biochemistry. 35, 425-445 (2002).</li><li>Pasqualini, R., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+targeting+In+vivo+using+phage+display+peptide+libraries.">Organ targeting In vivo using phage display peptide libraries.</a> Nature. 380 (6572), 364-366 (1996).</li><li>Liu, R., Li, X., Xiao, W., Lam, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-targeting+peptides+from+combinatorial+libraries.">Tumor-targeting peptides from combinatorial libraries.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 110-111, 13-37 (2017).</li><li>Binetruy-Tournaire, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+peptide+blocking+vascular+endothelial+growth+factor+(VEGF)-mediated+angiogenesis.">Identification of a peptide blocking vascular endothelial growth factor (VEGF)-mediated angiogenesis.</a> The EMBO Journal. 19, 1525-1533 (2000).</li><li>Peng, Y., Zhang, Y., Mitchell, W. J., Zhang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Lipopolysaccharide-Targeted+Peptide+Mimic+Vaccine+against+Q+Fever.">Development of a Lipopolysaccharide-Targeted Peptide Mimic Vaccine against Q Fever.</a> Journal of Immunology. 189, 4909-4920 (2012).</li><li>Lamichhane, T. N., Abeydeera, N. D., Duc, A. C., Cunningham, P. R., Chow, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+Peptides+Targeting+Helix+31+of+Bacterial+16S+Ribosomal+RNA+by+Screening+M13+Phage-Display+Libraries.">Selection of Peptides Targeting Helix 31 of Bacterial 16S Ribosomal RNA by Screening M13 Phage-Display Libraries.</a> Molecules. 16, 1211-1239 (2011).</li><li>Sahin, D., Taflan, S. O., Yartas, G., Ashktorab, H., Smoot, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+Identification+of+Peptides+Specifically+Targeted+to+Gastric+Cancer+Cells+from+a+Phage+Display+Peptide+Library.+Asian+Pacific.">Screening and Identification of Peptides Specifically Targeted to Gastric Cancer Cells from a Phage Display Peptide Library. Asian Pacific.</a> Journal of Cancer Prevention. 19 (4), 927-932 (2018).</li><li>Kelly, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+nanoparticles+for+imaging+incipient+pancreatic+ductal+adenocarcinoma.">Targeted nanoparticles for imaging incipient pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> PLOS Medicine. 5 (4), e85 (2008).</li><li>Sugihara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+pro-apoptotic+peptides+as+potential+therapy+for+peritoneal+endometriosis.">Development of pro-apoptotic peptides as potential therapy for peritoneal endometriosis.</a> Nature Communications. 5, 4478 (2014).</li><li>Rafii, S., Avecilla, S. T., Jin, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+vasculature+address+book:+Identification+of+stage-specific+tumor+vessel+zip+codes+by+phage+display.">Tumor vasculature address book: Identification of stage-specific tumor vessel zip codes by phage display.</a> Cancer Cell. 4, 331-333 (2003).</li><li>Arap, W., Pasqualini, R., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+Treatment+by+Targeted+Drug+Delivery+to+Tumor+Vasculature+in+a+Mouse+Model.">Cancer Treatment by Targeted Drug Delivery to Tumor Vasculature in a Mouse Model.</a> Science. 279, 377-390 (1997).</li></ol>

ספריית קומבינטורית phage הוא כלי רב עוצמה ויעיל עבור הקרנת תפוקה גבוהה של פפטידים הרומן שיכול לאגד את מולקולות היעד ולווסת את תפקידם13. בשלב זה, לספריות המוצגות באזור יש מגוון רחב של יישומים. לדוגמה, הם יכולים לשמש לבחירת הפפטידים אקטיביים מאוגד לקולטן חלבונים23, שאי?...

קולטני הצמיחה פיברובסט (FGFRs) משחקים תפקידי מפתח בתפוצת תאים, ריפוי פצעים ואנגיוגנזה ב-vivo1. הפעלה חריגה של איתות fgfr נצפתה במגוון רחב של גידולים2,3,4,5 כולל הגברה גנטית, מוטציות גנים, סטיות כרומוזומלית, וליגונים מוגזמת6 . מעכבי רבים המיקוד fgfrs הראו השפעות טיפוליות מבטיחות בניסויים קליניים מסווגים בעיקר לשלושה סוגים: (1) מולקולה קטנה קינאז מעכבי, אשר לאגד את התחום התאיים של fgfrs, (2) האנטוניסטים מיקוד ה קטע מסחטות, ו (3) FGF ליגומלכודות6. למרות שכמה מעכבי מולקולה קטנה קינאז יש השפעות טיפוליות טובות הן בתחום החוץ והן ב vivo7, רובם יש ספציפיות היעד העניים ולהראות תופעות לוואי כגון יתר לחץ דם8. רוב האנטוניסטים הם נוגדנים חד-שבטיים9,10 ו פוליפפטידים11. פפטידים יש יתרונות על פני מולקולות קטנות בשל הספציפיות שלהם תופעות לוואי נמוכות. הם גם שומרים על חדירות התאים ואינם צוברים איברים ספציפיים לעומת תרופות החלבון12. מכאן, פפטידים קטנים ממוקדות הם יעילים ופוטנציאליים סוכנים רפואיים.
טכנולוגיית התצוגה phage הוא כלי קל אך חזק לזיהוי פפטידים קטנים אשר יכולים לאגד למולקולה נתונה13,14,15. השתמשנו בספרייה פפטיד להציג בספריה כי הוא מבוסס על M13 phage פשוטה עם מעל 109 רצפי פפטיד שונים מוצגים בזנב לכריכה למולקולה היעד (ראה טבלת חומרים)16. בשל הזיקה הגבוהה של phages לעבר מולקולה נתונה, phages לא מאוגד יכול להיות שטף משם, ורק מאוגד היטב phages עם פפטידים קצרים הרצוי נשמרים. מטרות מולקולריות נתון יכול להיות מקיבוע חלבונים17,18, פחמימות, תאים מתורבתים, או אפילו חומרים אורגניים19,20. מקרה מרגש דווח היכן הפפטידים הספציפיים לעוגב נבחרו בvivo באמצעות טכנולוגיית התצוגה phage21. היתרונות של טכנולוגיית התצוגה phage כוללים תפוקה גבוהה, קלות הפעולה, עלות נמוכה ומגוון רחב של יישומים22.
במחקר זה, אנו מספקים פרוטוקול מפורט של הקרנת פפטידים קטנים כריכת החלבון הקיבוע (FGFR2) באמצעות ספריית תצוגה phage. יעילותה של הטכנולוגיה נבדקת גם על ידי מדידת הזיקה של הפפטיד המתקבל כלפי FGFR2 על ידי איזותרמי טיטור קלורימטריה (הטכניון), ואת הפעילות הביולוגית על ידי שיטת הפצת תאים. ניתן להאריך את השיטה לסינון פפטידים קטנים הקושרים לפחמימות, לתאים מתורבתים או אפילו לחומרים לא אורגניים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m Filter</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MPGP002A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 cm2 Small dish</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>150460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Guangzhou chemical reagent factory</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-96 gIII sequencing primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Synthesis from Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Nest</td>
			<td>701001-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST004D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto-Tryptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>L0037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c 3T3 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-&#173;6587</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Biodragon</td>
			<td>BD-M10110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCK-8 kit</td>
			<td>DOJINDO</td>
			<td>CK04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>sh30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMF</td>
			<td>Newprobe</td>
			<td>PB10247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15576028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2 Protein</td>
			<td>Sino Biological Inc.</td>
			<td>10014-HNAE</td>
			<td>Purity &#62;95%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITC200 system</td>
			<td>MicroCal Omega</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Guangzhou chemical reagent factory</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaI</td>
			<td>Bidepharm</td>
			<td>BD40879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Guangzhou chemical reagent factory</td>
			<td>1310-73-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG&#8211;8000</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2139-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ph.D.-7 phage display peptide library kit</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E8100S</td>
			<td>Containing the Ph.D.-7 phage library, E. coli ER2738 host strain and M13KE control phage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant FGFR2 extracellular domain proteins</td>
			<td>Sino Biological Inc.</td>
			<td>10824-H08H</td>
			<td>Purity &#62; 97%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small peptide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Synthesis from GL Biochem Ltd. (Shanghai, China)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-SHS-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SLF-T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

screening and identification of small peptides targeting fibroblast growth factor receptor2 using a phage display peptide library

מקדם הגדילה האנושי של הצמיחה פיברובסט (FGFR) מורכב מארבעה חברים, כלומר, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, המעורבים בפעילויות ביולוגיות שונות כולל הפצת תאים, הישרדות, הגירה ובידול. מספר סטיות במסלול האיתות FGFR, בשל מוטציות או אירועי הגברה גנטית, זוהו בסוגים שונים של סרטן. מכאן, מחקר שנערך לאחרונה התמקד בפיתוח אסטרטגיות מעורבות טיפולית של FGFRs. מעכבי FGFRS הנוכחי בשלבים שונים של התפתחות פרה-קליני וקליני כוללים מעכבי מולקולה קטנה של הקינזה או נוגדנים חד שבטיים, עם רק כמה פפטיד מבוססי מעכבי בצינור. כאן, אנו מספקים פרוטוקול באמצעות טכנולוגיית התצוגה phage למסך פפטידים קטנים כאנטוניסטים של FGFR2. בקצרה, ספריה של הפפטידים המוצגים phage היה מודבטים בצלחת מצופה עם FGFR2. לאחר מכן, phage לא מאוגד היה שטף על ידי TBST (TBS + 0.1% [v/v] יצירת רצף-20), ו phage מאוגד היה מוגבל עם 0.2 M גליצין-HCl מאגר (pH 2.2). והשתמשו בו כקלט. לסיבוב הבא בביואננינג בעקבות שלושה סיבובים של ביו ביונינג, רצפי פפטיד של שיבוטים phage בודדים זוהו על ידי רצפי DNA. לבסוף, הפפטידים הוקרן היו מסונתז ונותחו לפעילות זיקה וביולוגית.

השגת פפטיד קטן של זיקה גבוהה מיקוד FGFR2.
כדי להקרין phages מיקוד FGFR2, השתמשו בספריית Ph.D. 7 במחקר זה. ייצוג סכמטי של זרימת העבודה מוצג באיור 1. בתהליך זה, מספר קלט phage (PFU) נשמר ללא שינוי, בעוד ריכוז הציפוי של חלבון FGFR2 הופחת בהדרגה. תוצאות של phage סיכוייו הציע כי ?...

Watch this Scientific Journal Video about Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library at JoVE.com

Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library

בזאת, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לסינון פפטידים קטנים התאגד ל-FGFR2 באמצעות ספריית התצוגה הקטנה של phage. אנו לנתח עוד יותר את האהדה של הפפטידים שנבחרו כלפי FGFR2 בתוך מבחנה ויכולתה לדכא את תפוצת התאים.

הקרנה וזיהוי של פפטידים קטנים פילוח הצמיחה פיברוהפיצוץ מקדם Receptor2 באמצעות ספריית Phage התצוגה פפטיד

The human Fibroblast Growth Factor Receptor (FGFR) family comprises four members, namely, FGFR1, FGFR2, FGFR3, and FGFR4, that are involved in various ...

בהשוואה לשיטות אחרות, פרוטוקול זה קל יותר לגלות אנטגוניסטרים חדשים, אגוניסטרים, אפנונים allosteric כמותית ואיכותית מבלי לדעת את מבנה דילול הידרו היווצרות של חלבון היעד. פרוטוקול זה יעיל מאוד, קל לטיפול, חסכוני וזמין מסחרית. שלב שיטת סינון תפוקה גבוהה זו עם ניתוח ITC, פפטידים קטנים פונקציונליים ניתן להשיג כמותית ואיכותית.הדגמת ההליך תהיה יינג זאו וצ'יאנג וואנג, סטודנטים לתואר שני מהמעבדה שלנו. כדי להתחיל בהליך זה, להכין פתרון של FGFR2 במאגר ציפוי בריכוז של 10 מיקרוגרם למיליליטר. מוסיפים מיליליטר אחד של הפתרון לצלחת של 35 ס"מ רבועים ומסתחררים שוב ושוב עד שהמשטח רטוב לחלוטין.דגירה לילה בארבע מעלות צלזיוס עם רעידות. למחרת, יוצקים את פתרון הציפוי ומוסיפים את פתרון החסימה המוכן. דגירה בארבע מעלות צלזיוס לפחות שעה אחת, ואז להשליך את פתרון החסימה במהירות לשטוף את הצלחת שש פעמים עם TBST תוך הקפדה על המנה לא להתייבש.יש לייחס מחדש את ספריית הפאג' המקורית במיליליטר אחד של TBST ולהוסיף זאת לצלחת הצפויה. בעדינות לטלטל את הצלחת על שייקר בטמפרטורת החדר במשך שעתיים. לאחר מכן, להשליך את supernatant ולשטוף את המנה 10 פעמים עם TBST.אלוט פאג' כרוך על ידי הוספת מיליליטר אחד של 0.2 גליצין HCL טוחן לצלחת נדנדה בעדינות בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. מעבירים את האלונט לצינור מיקרוצנטריפוגה מעקר ומנטרלים אותו עם 100 מיקרוליטרים של טריס-HCL טוחנת אחת ב-pH 9.1. ראשית, לפני המלחמה את צלחות LB ו- IPTG X-Gal המוכנות ב 37 מעלות צלזיוס לפחות שעה לפני השימוש.באמצעות טיפים pipette עם מחסניות מסנן, להכין 100 microliters של דילול פי עשרה של eluent ב LB. לאחר שתרבות ה- E.coli המוכנה מגיעה לשלב אמצע הרישום, מחלקים 200 מיקרוליטרים של התרבות לצינורות מיקרוצנטריפוגה מעוקרים אחד עבור כל דילול אלוני. כדי ליזום את הזיהום, להוסיף 50 microliters של כל דילול לצינורות המכילים את תרבות E.coli. מערבולת במהירות דגירה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות.לאחר מכן השתמש מקלות ציפוי כדי לצפות את צלחות LB ו IPTG X-GAL עם 90 microliters של תערובת זו. לאחר חמש דקות, להפוך את הצלחות קטורת אותם לילה ב 37 מעלות צלזיוס. לספור לוחות כאשר הם מופיעים.כדי להתחיל, לדלל את תרבות הלילה ב 20 מיליליטר של LB בבקבוק ארלנפייר 250 מיליליטר. מוסיפים את הדגירה הבלתי מועשרת והדגירה ב-37 מעלות צלזיוס עם טלטול נמרץ במשך 4-1/2 שעות. לאחר מכן, צנטריפוגה התרבות ב 12, 000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.מעבירים את העל-טבעי לצינור טרי. צנטריפוגה שוב באמצעות אותם תנאים להשליך את גלולה. מעבירים את ה-80% העליונים של העל-טבעי לצינור טרי ומוסיפים אותו לנפח 1/6 של 20% פוליאתילן גליקול ו-2.5 נתרן כלורי טוחן.אפשרו לפואג' לזרז בן לילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, צנטריפוגה פאג' זירז ב 12, 000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. השלך שוב את העל-טבעי והצנטריפוגה באותם תנאים.השתמש פיפטה כדי להסיר את שאריות על טבעי. תעבירו את גלולת הכדור במיליליטר אחד של TBS והעברו את העל-טבעי לצינור מיקרוצנטריפוגה. צנטריפוגה ב 12, 000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.מעבירים את העל-טבעי לצינור מיקרוצנטריפוגה טרי ומזרזים שוב על-ידי הוספת נפח 1/6 של 20% פוליאתילן גליקול ו-2.5 נתרן כלורי טוחנת. דגירה על קרח במשך 15 עד 60 דקות. לאחר מכן, צנטריפוגה ב 12, 000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.השלך שוב את העל-טבעי והצנטריפוגה באותם תנאים. השתמש פיפטה כדי להסיר את שאריות על טבעי. תן את גלולה ב 200 microliters של TBS ו צנטריפוגה לדקה נוספת כדי להסיר זיהומים.לאחר מכן מעבירים את העל-טבעי לצינור מיקרוצנטריפוגה טרי כדי להשיג את האלונט המוגבר. במחקר זה, מספר קלט הפאג' נשמר ללא שינוי ואילו ריכוז הציפוי של חלבון FGFR2 מצטמצם בהדרגה. תוצאות טיטר הפאג' מצביעות על כך שמספר הפאג'ים המתאוששים עולה בהדרגה, ולאחר שלושה סיבובים, יש עלייה של פי 65 בהשוואה לזה של הסיבוב הראשון.לאחר מכן נערך ניסוי ITC כדי למדוד את הזיקה של הפפטיד הקטן ל- FGFR2. התוצאות מצביעות על כך שלפפטיד SP1 יש זיקה גבוהה כלפי FGFR2. נתונים אלה מדגימים את היעילות של פרוטוקול המיון.כדי לחקור את הפעילות הביולוגית של פפטיד SP1, בדיקה התפשטות fibroblast מבוצעת באמצעות ערכת CCK-8. BALB/C3T3 הם דגירה עם פפטיד SP1 בריכוזים שונים. התוצאות מראות כי פפטיד SP1 מדכא את הצמיחה של התאים.יש להימנע מהזיהום על ידי פאג'ים פראיים כאן. הקפד להשתמש טיפים פיפטה עמידים בתרסיס. תוך כדי צמיחה על ידי קבלת הגברה פאג'.הליך זה יכול לשמש גם בהקרנת פפטידים קטנים שנקשרים לפחמימות, תאי תרבות ורקמות. פפטידים אלה יכולים להיות הגברה נוספת על אבחון וממוקד

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

משלוח ין transfection ב אדם בתאי סרטן הלבלב באמצעות גורם גדילה עוריות קולטן במיקוד לטין מבוסס Nanovectors מתוכנן

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

גילוי חיידקים וזיהוי באמצעות חיישנים אלקטרוכימיים

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Generation and Recovery of ÃƒÅ½Ã‚Â²-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

דור ושחזור של spheroids β-תא מהידרוג שלב צמיחת PEG-פפטיד

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional  microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for  ...

Observing and Quantifying Fibroblast-mediated Fibrin Gel Compaction

התבוננות וכימות דחיסה של ג'ל פיברובלסט בתיווך פיברין

Cells embedded in collagen and fibrin gels attach and exert traction forces on the fibers of the gel. These forces can lead to local and global ...

Electrospinning Growth Factor Releasing Microspheres into Fibrous Scaffolds

גורם הגדילה Electrospinning שחרור מיקרוסכמות לתוך סיביים פיגומים

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth.  This system incorporates mechanical, topographical, ...

Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

משלוח של חלבונים, פפטידים או מולקולות קטנות Cell-חדיר לתאים חיים על ידי דגירה עם Endosomolytic מגיב dfTAT

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the ...

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

לומד את ההרכב של עוריות Growth Factor Receptor בתאים השלמים באמצעות מתאם מיקרוסקופית

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

A Rapid and Quantitative Fluorimetric Method for Protein-Targeting Small Molecule Drug Screening

מהיר וכמוני Fluorimetric שיטה להקרנת סמים מיקוד-חלבון מולקולה קטנה

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold ...

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

קומפלקס polyelectrolyte למשלוח גורם הגדילה osteogenic דומיין כריכה הפרין

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

Initial Evaluation of Antibody-conjugates Modified with Viral-derived Peptides for Increasing Cellular Accumulation and Improving Tumor Targeting

ההערכה הראשונית של נוגדן-conjugates שונה עם פפטידים ויראלי-derived הגדלת לצבירה התאית ושיפור הגידול מיקוד

Antibody-conjugates (ACs) modified with virus-derived peptides are a potentially powerful class of tumor cell delivery agents for molecular payloads used ...