Name: screening and identification of small peptides targeting fibroblast growth factor receptor2 using a phage display peptide library
Uploaded: 2019-09-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library at JoVE.com

यह काम ग्वांग्झू के विज्ञान और प्रौद्योगिकी कार्यक्रम (सं. 2016201604030039) द्वारा समर्थित किया गया था।

1. अभिकर्मक तैयारी
<ol><li>LB (lysogeny शोरबा) मध्यम: tryptone के 1 ग्राम भंग, खमीर निकालने के 0.5 ग्राम, और 0.5 ग्राम NaCl के 100 एमएल में एच2ओ Autoclave और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.</li>
	<li>टेट्रासाइक्लिन स्टॉक: 1:1 इथेनॉल में 20 मिलीग्राम/ए?...

<ol>
	<li>Eswarakumar, V. P., Lax, I., Schlessinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+signaling+by+fibroblast+growth+factor+receptors.">Cellular signaling by fibroblast growth factor receptors.</a> Cytokine &amp; Growth Factor Reviews. 16 (2), 139-149 (2005).</li><li>Turner, N., Grose, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+signaling:+from+development+to+cancer.">Fibroblast growth factor signaling: from development to cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 10 (2), 116-129 (2010).</li><li>Cancer Genome Atlas Network. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+molecular+portraits+of+human+breast+tumors.">Comprehensive molecular portraits of human breast tumors.</a> Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).</li><li>Matsumoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGFR2+gene+amplification+and+clinicopathological+features+in+gastric+cancer.">FGFR2 gene amplification and clinicopathological features in gastric cancer.</a> British Journal of Cancer. 106 (4), 727-732 (2012).</li><li>Weiss, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequent+and+focal+FGFR1+amplification+associates+with+therapeutically+tractable+FGFR1+dependency+in+squamous+cell+lung+cancer.">Frequent and focal FGFR1 amplification associates with therapeutically tractable FGFR1 dependency in squamous cell lung cancer.</a> Science Translational Medicine. 2 (62), 62ra93 (2010).</li><li>Babina, I. S., Turner, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+challenges+in+targeting+FGFR+signaling+in+cancer.">Advances and challenges in targeting FGFR signaling in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (5), 318-322 (2017).</li><li>Katoh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+receptors+as+treatment+targets+in+clinical+oncology.">Fibroblast growth factor receptors as treatment targets in clinical oncology.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 16 (2), 105-122 (2019).</li><li>Soria, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I/IIa+study+evaluating+the+safety,+efficacy,+pharmacokinetics,+and+pharmacodynamics+of+lucitanib+in+advanced+solid+tumors.">Phase I/IIa study evaluating the safety, efficacy, pharmacokinetics, and pharmacodynamics of lucitanib in advanced solid tumors.</a> Annals of Oncology. 25 (11), 2244-2251 (2014).</li><li>French, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+FGFR4+inhibits+hepatocellular+carcinoma+in+preclinical+mouse+models.">Targeting FGFR4 inhibits hepatocellular carcinoma in preclinical mouse models.</a> PLoS ONE. 7 (5), e36713 (2012).</li><li>Martinez-Torrecuadrada, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+extracellular+domain+of+fibroblast+growth+factor+receptor+3+with+human+single-chain+Fv+antibodies+inhibits+bladder+carcinoma+cell+line+proliferation.">Targeting the extracellular domain of fibroblast growth factor receptor 3 with human single-chain Fv antibodies inhibits bladder carcinoma cell line proliferation.</a> Clinical Cancer Research. 11 (17), 6280-6290 (2005).</li><li>Palamakumbura, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysyl+oxidase+propeptide+inhibits+prostate+cancer+cell+growth+by+mechanisms+that+target+FGF-2-cell+binding+and+signaling.">Lysyl oxidase propeptide inhibits prostate cancer cell growth by mechanisms that target FGF-2-cell binding and signaling.</a> Oncogene. 28 (38), 3390-3400 (2009).</li><li>Ladner, R. C., Sato, A. K., Gorzelany, J., de Souza, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+display-derived+peptides+as+therapeutic+alternatives+to+antibodies.">Phage display-derived peptides as therapeutic alternatives to antibodies.</a> Drug Discovery Today. 9 (12), 525-529 (2004).</li><li>Wu, C. H., Liu, I. J., Lu, R. M., Wu, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancement+and+applications+of+peptide+phage+display+technology+in+biomedical+science.">Advancement and applications of peptide phage display technology in biomedical science.</a> Journal of Biomedical Science. 23, 8 (2016).</li><li>Kay, B. K., Kasanov, J., Yamabhai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+phage-displayed+combinatorial+peptide+libraries.">Screening phage-displayed combinatorial peptide libraries.</a> Methods. 24 (3), 240-246 (2001).</li><li>Rodi, D. J., Makowski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage-display+technology+-+Finding+a+needle+in+a+vast+molecular+haystack.">Phage-display technology - Finding a needle in a vast molecular haystack.</a> Current Opinion in Biotechnology. 10, 87-93 (1999).</li><li>Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+M13+for+phage+display.">Engineering M13 for phage display.</a> Biomolecular Engineering. 18, 57-63 (2002).</li><li>Hamzeh-Mivehroud, M., Mahmoudpour, A., Dastmalchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+new+peptide+ligands+for+epidermal+growth+factor+receptor+using+phage+display+and+computationally+modeling+their+mode+of+binding.">Identification of new peptide ligands for epidermal growth factor receptor using phage display and computationally modeling their mode of binding.</a> Chemical Biology &amp; Drug Design. 79 (3), 246-259 (2012).</li><li>Askoxylakis, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide-based+targeting+of+the+platelet-derived+growth+factor+receptor+beta.">Peptide-based targeting of the platelet-derived growth factor receptor beta.</a> Molecular Imaging and Biology. 15 (2), 212-221 (2013).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transdermal+protein+delivery+by+a+coadministered+peptide+identified+via+phage+display.">Transdermal protein delivery by a coadministered peptide identified via phage display.</a> Nature Biotechnology. 24 (4), 455-460 (2006).</li><li>Azzazy, H. M., Highsmith, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+display+technology:+clinical+applications+and+recent+innovations.">Phage display technology: clinical applications and recent innovations.</a> Clinical Biochemistry. 35, 425-445 (2002).</li><li>Pasqualini, R., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+targeting+In+vivo+using+phage+display+peptide+libraries.">Organ targeting In vivo using phage display peptide libraries.</a> Nature. 380 (6572), 364-366 (1996).</li><li>Liu, R., Li, X., Xiao, W., Lam, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-targeting+peptides+from+combinatorial+libraries.">Tumor-targeting peptides from combinatorial libraries.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 110-111, 13-37 (2017).</li><li>Binetruy-Tournaire, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+peptide+blocking+vascular+endothelial+growth+factor+(VEGF)-mediated+angiogenesis.">Identification of a peptide blocking vascular endothelial growth factor (VEGF)-mediated angiogenesis.</a> The EMBO Journal. 19, 1525-1533 (2000).</li><li>Peng, Y., Zhang, Y., Mitchell, W. J., Zhang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Lipopolysaccharide-Targeted+Peptide+Mimic+Vaccine+against+Q+Fever.">Development of a Lipopolysaccharide-Targeted Peptide Mimic Vaccine against Q Fever.</a> Journal of Immunology. 189, 4909-4920 (2012).</li><li>Lamichhane, T. N., Abeydeera, N. D., Duc, A. C., Cunningham, P. R., Chow, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+Peptides+Targeting+Helix+31+of+Bacterial+16S+Ribosomal+RNA+by+Screening+M13+Phage-Display+Libraries.">Selection of Peptides Targeting Helix 31 of Bacterial 16S Ribosomal RNA by Screening M13 Phage-Display Libraries.</a> Molecules. 16, 1211-1239 (2011).</li><li>Sahin, D., Taflan, S. O., Yartas, G., Ashktorab, H., Smoot, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+Identification+of+Peptides+Specifically+Targeted+to+Gastric+Cancer+Cells+from+a+Phage+Display+Peptide+Library.+Asian+Pacific.">Screening and Identification of Peptides Specifically Targeted to Gastric Cancer Cells from a Phage Display Peptide Library. Asian Pacific.</a> Journal of Cancer Prevention. 19 (4), 927-932 (2018).</li><li>Kelly, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+nanoparticles+for+imaging+incipient+pancreatic+ductal+adenocarcinoma.">Targeted nanoparticles for imaging incipient pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> PLOS Medicine. 5 (4), e85 (2008).</li><li>Sugihara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+pro-apoptotic+peptides+as+potential+therapy+for+peritoneal+endometriosis.">Development of pro-apoptotic peptides as potential therapy for peritoneal endometriosis.</a> Nature Communications. 5, 4478 (2014).</li><li>Rafii, S., Avecilla, S. T., Jin, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+vasculature+address+book:+Identification+of+stage-specific+tumor+vessel+zip+codes+by+phage+display.">Tumor vasculature address book: Identification of stage-specific tumor vessel zip codes by phage display.</a> Cancer Cell. 4, 331-333 (2003).</li><li>Arap, W., Pasqualini, R., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+Treatment+by+Targeted+Drug+Delivery+to+Tumor+Vasculature+in+a+Mouse+Model.">Cancer Treatment by Targeted Drug Delivery to Tumor Vasculature in a Mouse Model.</a> Science. 279, 377-390 (1997).</li></ol>

एक combinatorial phage पुस्तकालय उपन्यास पेप्टाइड्स है कि लक्ष्य अणुओं बाँध और उनके समारोह13को विनियमित कर सकते हैं की उच्च throughput स्क्रीनिंग के लिए एक शक्तिशाली और प्रभावी उपकरण है. वर्तमान में, phage प्रदर्शन...

Fibroblast विकास कारक रिसेप्टर्स (FGFRs) सेल प्रसार में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, घाव भरने, और विवो1में एंजियोजेनेसिस . FGFR संकेतन के Aberrant सक्रियण ट्यूमरकीएक किस्म में मनाया 2,3,4,5 जीन प्रवर्धन, जीन उत्परिवर्तन, गुणसूत्र विपथन, और अत्यधिक लिगंड स्राव6 शामिल हैं . FGFRs को लक्षित कई inhibitors नैदानिक परीक्षणों में होनहार चिकित्सीय प्रभाव दिखाया गया है और मुख्य रूप से तीन प्रकार में वर्गीकृत कर रहे हैं: (1) छोटे अणु kinase inhibitors, जो FGFR के intracellular डोमेन के लिए बाध्य, (2) विरोधी को लक्षित extracellular खंड, और (3) FGF ligand जाल6| यद्यपि अनेक छोटे अणु काइनेज अवरोधकों का विट्रो और विवो7दोनों में अच्छा चिकित्सीय प्रभाव होता है , फिर भी उनमें से अधिकांश का लक्ष्य विशिष्टता नहीं है और उच्च रक्तचाप8जैसे प्रतिकूल प्रभाव दिखाई देते हैं . अधिकांश विरोधी एक-एक एंटीबॉडी9,10 और पॉलीपेप्टाइड11हैं . पेप्टाइड्स उनकी विशिष्टता और कम साइड इफेक्ट के कारण छोटे अणुओं पर लाभ है. वे कोशिका पारगम्यता को भी बनाए रखते हैं और प्रोटीन औषधियोंकीतुलना में विशिष्ट अंगों में संचित नहीं होते . इसलिए, लक्षित छोटे पेप्टाइड्स दोनों प्रभावी और संभावित चिकित्सीय एजेंट हैं।
फाज प्रदर्शन प्रौद्योगिकी छोटे पेप्टाइडों की पहचान करने के लिए एक आसान लेकिन शक्तिशाली उपकरण है जो किसी दिए गए अणु13,14,15को बाध्य कर सकता है . हमने एक फैज डिस्प्ले पेप्टाइड लाइब्रेरी का उपयोग किया जो एक साधारण M13 फैज पर आधारित है जिसमें 109 से अधिक विभिन्न पेप्टाइड अनुक्रम ों के साथ, जो लक्ष्य अणु के लिए बाध्य करने के लिए पूंछ पर प्रदर्शित होते हैं (सामग्री की तालिकादेखें )16. दिए गए अणु के प्रति phages की उच्च आत्मीयता के कारण, असीम phages धोया जा सकता है, और केवल कसकर बंधे phages वांछित कम पेप्टाइड्स के साथ बनाए रखा है. दिए गए आणविक लक्ष्यों को स्थिर प्रोटीन17,18, कार्बोहाइड्रेट , सुसंस्कृत कोशिकाओं , या यहां तक कि अकार्बनिक पदार्थ19,20से स्थिर किया जा सकता है . एक रोमांचक मामले की सूचना मिली जहां अंग-विशिष्ट पेप्टाइड्स का चयन विवो में फैज डिस्प्ले टेक्नोलॉजी21का उपयोग करके किया गया था। phage प्रदर्शन प्रौद्योगिकी के लाभ उच्च थ्रूपुट, आपरेशन में आसानी, कम लागत और अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला22शामिल हैं.
इस अध्ययन में, हम स्क्रीनिंग छोटे पेप्टाइड्स immobilized प्रोटीन के लिए बाध्यकारी की एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान (FGFR2) एक phage प्रदर्शन पुस्तकालय का उपयोग कर. प्रौद्योगिकी की प्रभावकारिता भी Isothermal Titration कैलोरीमेट्री द्वारा FGFR2 की ओर प्राप्त पेप्टाइड की समानता को मापने के द्वारा जांच की है (आईटीसी), और एक सेल प्रसार परख द्वारा जैविक गतिविधि. विधि छोटे पेप्टाइड्स कि कार्बोहाइड्रेट के लिए बाध्य स्क्रीनिंग के लिए बढ़ाया जा सकता है, सुसंस्कृत कोशिकाओं, या यहां तक कि अकार्बनिक सामग्री.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m Filter</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MPGP002A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 cm2 Small dish</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>150460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Guangzhou chemical reagent factory</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-96 gIII sequencing primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Synthesis from Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Nest</td>
			<td>701001-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST004D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto-Tryptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>L0037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c 3T3 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-&#173;6587</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Biodragon</td>
			<td>BD-M10110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCK-8 kit</td>
			<td>DOJINDO</td>
			<td>CK04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>sh30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMF</td>
			<td>Newprobe</td>
			<td>PB10247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15576028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2 Protein</td>
			<td>Sino Biological Inc.</td>
			<td>10014-HNAE</td>
			<td>Purity &#62;95%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITC200 system</td>
			<td>MicroCal Omega</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Guangzhou chemical reagent factory</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaI</td>
			<td>Bidepharm</td>
			<td>BD40879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Guangzhou chemical reagent factory</td>
			<td>1310-73-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG&#8211;8000</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2139-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ph.D.-7 phage display peptide library kit</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E8100S</td>
			<td>Containing the Ph.D.-7 phage library, E. coli ER2738 host strain and M13KE control phage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant FGFR2 extracellular domain proteins</td>
			<td>Sino Biological Inc.</td>
			<td>10824-H08H</td>
			<td>Purity &#62; 97%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small peptide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Synthesis from GL Biochem Ltd. (Shanghai, China)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-SHS-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SLF-T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

screening and identification of small peptides targeting fibroblast growth factor receptor2 using a phage display peptide library

मानव फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर रिसेप्टर (एफजीएफआर) परिवार में चार सदस्य शामिल हैं, नामत, FGFR1, FGFR2, FGFR3, और FGFR4, जो सेल प्रसार, अस्तित्व, प्रवास और भेदभाव सहित विभिन्न जैविक गतिविधियों में शामिल हैं। उत्परिवर्तन या जीन प्रवर्धन की घटनाओं के कारण, FGFR संकेतन मार्ग में कई विपथन, कैंसर के विभिन्न प्रकार में पहचान की गई है. इसलिए, हाल ही में अनुसंधान FGFRs के चिकित्सीय लक्ष्यीकरण शामिल रणनीतियों के विकास पर ध्यान केंद्रित किया है. पूर्व नैदानिक और नैदानिक विकास के विभिन्न चरणों में वर्तमान FGFR inhibitors या तो टायरोसिन kinases के छोटे अणु inhibitors शामिल हैं या मोनोक्लोनल एंटीबॉडी, पाइप लाइन में केवल कुछ पेप्टाइड-आधारित अवरोधकों के साथ। यहाँ, हम FGFR2 के विरोधी के रूप में छोटे पेप्टाइड्स स्क्रीन करने के लिए phage प्रदर्शन प्रौद्योगिकी का उपयोग कर एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. संक्षेप में, phage-प्रदर्शित पेप्टाइड्स के एक पुस्तकालय FGFR2 के साथ लेपित एक थाली में incubated था. बाद में, असीम phage TBST द्वारा धोया गया था (टीबीएस + 0.1% [v/v] ट्वीन-20), और बाध्य phage 0.2 M glycine-HCl बफर (पीएच 2.2) के साथ eluted किया गया था. eluted phage आगे परिलक्षित किया गया था और biopanning के अगले दौर के लिए इनपुट के रूप में इस्तेमाल किया. बायोपैनिंग के तीन दौर के बाद, व्यक्तिगत फेज क्लोन के पेप्टाइड दृश्यों की पहचान डीएनए अनुक्रमण द्वारा की गई थी। अंत में, स्क्रीन पेप्टाइड्स संश्लेषित और आत्मीयता और जैविक गतिविधि के लिए विश्लेषण किया गया.

एक उच्च आत्मीयता छोटे पेप्टाइड FGFR2 को लक्षित प्राप्त करने.
FGFR2 को लक्षित phages स्क्रीन करने के लिए, एक पीएच.डी.-7 पुस्तकालय इस अध्ययन में इस्तेमाल किया गया था. कार्यप्रवाह का एक योजनाबद्ध प्रत...

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Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library

यहाँ, हम छोटे पेप्टाइड्स है कि FGFR2 के लिए बाध्य एक phage प्रदर्शन पेप्टाइड पुस्तकालय का उपयोग स्क्रीनिंग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. हम आगे इन विट्रो में FGFR2 और सेल प्रसार को दबाने की क्षमता की ओर चयनित पेप्टाइड्स की समानता का विश्लेषण.

स्क्रीनिंग और एक Phage प्रदर्शन पेप्टाइड लाइब्रेरी का उपयोग कर Fibroblast विकास कारक Receptor2 को लक्षित छोटे पेप्टाइड की पहचान

The human Fibroblast Growth Factor Receptor (FGFR) family comprises four members, namely, FGFR1, FGFR2, FGFR3, and FGFR4, that are involved in various ...

अन्य तरीकों की तुलना में, इस प्रोटोकॉल को हाइड्रो-कमजोर पड़ने की संरचना और लक्ष्य प्रोटीन के गठन को जाने बिना मात्रात्मक और गुणात्मक रूप से नए विरोधी, एगॉनिस्टरी, और एलोस्टेरिक मॉड्यूलर का पता लगाना आसान है। यह प्रोटोकॉल उच्च कुशल, संभालना आसान, किफायती और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है। आईटीसी विश्लेषण के साथ इस उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग विधि को मिलाएं, कार्यात्मक छोटे पेप्टाइड्स को मात्रात्मक और गुणात्मक रूप से प्राप्त किया जा सकता है।प्रक्रिया का प्रदर्शन Ying Zhao और Qiang वांग, हमारी प्रयोगशाला से स्नातक छात्रों होगा । इस प्रक्रिया को शुरू करने के लिए, 10 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर की एकाग्रता पर कोटिंग बफर में FGFR2 का समाधान तैयार करें। एक 35 वर्ग सेंटीमीटर पकवान के समाधान का एक मिलीलीटर जोड़ें और सतह पूरी तरह से गीला होने तक बार-बार घूमता है।मिलाते हुए चार डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट । अगले दिन, कोटिंग समाधान बंद करें और तैयार अवरुद्ध समाधान जोड़ें। कम से कम एक घंटे के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट, तो अवरुद्ध समाधान त्यागने और जल्दी से TBST के साथ छह बार थाली धोने जबकि सुनिश्चित करें कि पकवान बाहर सूख नहीं है ।टीबीस्ट के एक मिलीलीटर में मूल फेक लाइब्रेरी का पुनर्गठन करें और इसे लेपित डिश में जोड़ें। धीरे दो घंटे के लिए कमरे के तापमान पर एक शेखर पर थाली रॉक । इसके बाद सुपरनेट को डिस्कार्ड करें और डिश को टीबीस्ट से 10 बार धोएं।डिश में 0.2 मोलर ग्लाइसिन एचसीएल के एक मिलीलीटर जोड़कर बाध्य फेज को एल्यूट करें और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर धीरे से कमाल करें। एलुएंट को एक निष्फल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और पीएच 9.1 पर एक मोलर ट्रिस-एचसीएल के 100 माइक्रोलीटर के साथ इसे बेअसर करें। सबसे पहले, उपयोग से पहले कम से एक घंटे के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर तैयार पौंड और आईपीटीजी एक्स-गल प्लेटों को प्रीवार्म करें ।फिल्टर कारतूस के साथ पिपेट युक्तियों का उपयोग करके, एलबी में एल्यूएंट के दस गुना कमजोर पड़ने के 100 माइक्रोलीटर तैयार करें। तैयार ई.कोलाई संस्कृति के मध्य लॉग चरण तक पहुंचने के बाद, प्रत्येक एलूंट कमजोर पड़ने के लिए एक निष्फल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों में संस्कृति के 200 माइक्रोलीटर वितरित करें। संक्रमण शुरू करने के लिए, ई.कोलाई संस्कृति युक्त ट्यूबों में प्रत्येक कमजोर पड़ने के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें। भंवर जल्दी और कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए इनक्यूबेट ।फिर इस मिश्रण के 90 माइक्रोलीटर के साथ एलबी और आईपीटीजी एक्स-गल प्लेटों को कोट करने के लिए कोटिंग स्टिक का उपयोग करें। पांच मिनट के बाद प्लेटों को उलटा करें और उन्हें रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। जब वे दिखाई देते हैं तो सजीले टुकड़े गिनें।शुरू करने के लिए, एक २५० मिलीलीटर Erlenmeyer फ्लास्क में पौंड के 20 मिलीलीटर में रातोंरात संस्कृति को पतला । 4-1/2 घंटे के लिए जोरदार मिलाते हुए के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर अमुद्रीकृत eluent और इनक्यूबेट जोड़ें । इसके बाद, 12, 000 बार जी और 10 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति अपकेंद्रित्र ।सुपरनेट को एक ताजा ट्यूब में स्थानांतरित करें। अपकेंद्रित्र फिर से एक ही शर्तों का उपयोग कर और गोली त्यागें। सुपरनेटेंट के ऊपरी 80% को एक ताजा ट्यूब में स्थानांतरित करें और इसे 20% पॉलीथीन ग्लाइकोल और 2.5 मोलर सोडियम क्लोराइड की 1/6 मात्रा में जोड़ें।फेज को चार डिग्री सेल्सियस पर रात भर उपजी करने की अनुमति दें। अगले दिन, 12, 000 बार जी और चार डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए उपजी फाज अपकेंद्रित्र । सुपरनेट और अपकेंद्रित्र को फिर से उन्हीं शर्तों का उपयोग करके त्यागें।अवशिष्ट सुपरनेट को हटाने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें। टीबीएस के एक मिलीलीटर में गोली को फिर से खर्च करें और सुपरनेट को माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। पांच मिनट के लिए 12, 000 बार जी और चार डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रलाइज ।सुपरनेट को एक ताजा माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और 20% पॉलीथीन ग्लाइकोल और 2.5 मोलर सोडियम क्लोराइड की 1/6 मात्रा जोड़कर फिर से बिपस करें। 15 से 60 मिनट तक बर्फ पर इनक्यूबेट करें। इसके बाद, 12, 000 बार जी और 10 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र ।सुपरनेट और अपकेंद्रित्र को फिर से उन्हीं शर्तों का उपयोग करके त्यागें। अवशिष्ट सुपरनेट को हटाने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें। अशुद्धियों को दूर करने के लिए एक अतिरिक्त मिनट के लिए टीबीएस और अपकेंद्रित्र के 200 माइक्रोलीटर में गोली को फिर से खर्च करें।फिर एम्पलीड एल्यूएंट प्राप्त करने के लिए सुपरनेट को एक ताजा माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। इस अध्ययन में, फेज इनपुट की संख्या अपरिवर्तित रखी जाती है जबकि FGFR2 प्रोटीन की कोटिंग एकाग्रता धीरे-धीरे कम हो जाती है। फेज टाइटर के परिणाम बताते हैं कि बरामद फेज की संख्या धीरे-धीरे बढ़ती है और तीन राउंड के बाद पहले राउंड की तुलना में 65 गुना बढ़ोतरी होती है।इसके बाद एफजीएफआर2 को छोटे पेप्टाइड की आत्मीयता को मापने के लिए आईटीसी प्रयोग किया जाता है । परिणामों से संकेत मिलता है कि SP1 पेप्टाइड FGFR2 के प्रति उच्च लगाव है । यह डेटा स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल की दक्षता को दर्शाता है।SP1 पेप्टाइड की जैविक गतिविधि की जांच करने के लिए, एक फाइब्रोब्लास्ट प्रसार परख एक CCK-8 किट का उपयोग कर किया जाता है । BALB/C3T3 विभिन्न सांद्रता पर SP1 पेप्टाइड के साथ इनक्यूबेटेड हैं । परिणाम बताते हैं कि एसपी1 पेप्टाइड कोशिकाओं के विकास को दबा देता है।यहां जंगली प्रकार के फेज द्वारा प्रदूषण से बचना होगा । एयरोसोल प्रतिरोधी पिपेट युक्तियों का उपयोग करना सुनिश्चित करें। जबकि फेज प्रवर्धन प्राप्त करके विकास।इस प्रक्रिया का उपयोग कार्बोहाइड्रेट, संस्कृति कोशिकाओं और ऊतकों से बांधने वाले छोटे पेप्टाइड्स को स्क्रीनिंग में भी किया जा सकता है। उन पेप्टाइड्स नैदानिक और लक्षित पर आगे प्रवर्धन किया जा सकता है

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

जीन और मानव अग्नाशय के कैंसर epidermal वृद्धि कारक का उपयोग कक्ष में डिलिवरी अभिकर्मक जिलेटिन आधारित इंजीनियर Nanovectors रिसेप्टर - लक्षित

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

विद्युत सेंसर का उपयोग बैक्टीरिया का पता लगाने और पहचान

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Generation and Recovery of ÃƒÅ½Ã‚Â²-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

और स्टेप - विकास खूंटी पेप्टाइड Hydrogels से β सेल spheroids का सृजन वसूली

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional  microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for  ...

Observing and Quantifying Fibroblast-mediated Fibrin Gel Compaction

देख रहा है और फाइब्रोब्लास्ट-मध्यस्थता फिब्रिन जेल कॉम्पैक्टेशन की मात्रा

Cells embedded in collagen and fibrin gels attach and exert traction forces on the fibers of the gel. These forces can lead to local and global ...

Electrospinning Growth Factor Releasing Microspheres into Fibrous Scaffolds

रेशेदार Scaffolds में microspheres विमोचन Electrospinning ग्रोथ फैक्टर

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth.  This system incorporates mechanical, topographical, ...

Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

Endosomolytic अभिकर्मक dfTAT साथ ऊष्मायन द्वारा जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन, पेप्टाइड या सेल अभेद्य छोटे अणुओं की डिलिवरी

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the ...

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

Correlative माइक्रोस्कोपी का उपयोग बरकरार कोशिकाओं में epidermal वृद्धि कारक रिसेप्टर की स्तुईचिओमेटरी का अध्ययन

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

A Rapid and Quantitative Fluorimetric Method for Protein-Targeting Small Molecule Drug Screening

प्रोटीन को टारगेट कर छोटे अणु दवा स्क्रीनिंग के लिए एक तेजी से और मात्रात्मक fluorimetric विधि

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold ...

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

के लिए हेपरिन बाध्यकारी डोमेन osteogenic विकास फैक्टर प्रसव Polyelectrolyte परिसर

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

Initial Evaluation of Antibody-conjugates Modified with Viral-derived Peptides for Increasing Cellular Accumulation and Improving Tumor Targeting

सेलुलर संचय बढ़ाने और ट्यूमर लक्ष्यीकरण में सुधार के लिए वायरल-व्युत्पन्न पेप्टाइड्स के साथ संशोधित एंटीबॉडी-conjugates का प्रारंभिक मूल्यांकन

Antibody-conjugates (ACs) modified with virus-derived peptides are a potentially powerful class of tumor cell delivery agents for molecular payloads used ...