Name: screening and identification of small peptides targeting fibroblast growth factor receptor2 using a phage display peptide library
Uploaded: 2019-09-30T15:00:00
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この研究は広州科学技術プログラム(No.201604030039)によって支援されました。

1. 試薬の調製
<ol><li>LB(リソジェニーブロス)培地:トリプトン1g、酵母エキス0.5g、NaCl 0.5gをH2O.オートクレーブの100mLで溶解し、4°Cに保存します。</li>
	<li>テトラサイクリンストック:1:1エタノールで20mg/mLを調製:H2O.ストア-20°Cで、使用する前に渦を調製する。</li>
	<li>IPTG/X-gal溶液:IPTGの0.5g(イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド)と0.4gのX-gal(5-ブロモ-4-クロロ-3-indolyl β-ガラ?...

<ol>
	<li>Eswarakumar, V. P., Lax, I., Schlessinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+signaling+by+fibroblast+growth+factor+receptors.">Cellular signaling by fibroblast growth factor receptors.</a> Cytokine &amp; Growth Factor Reviews. 16 (2), 139-149 (2005).</li><li>Turner, N., Grose, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+signaling:+from+development+to+cancer.">Fibroblast growth factor signaling: from development to cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 10 (2), 116-129 (2010).</li><li>Cancer Genome Atlas Network. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+molecular+portraits+of+human+breast+tumors.">Comprehensive molecular portraits of human breast tumors.</a> Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).</li><li>Matsumoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGFR2+gene+amplification+and+clinicopathological+features+in+gastric+cancer.">FGFR2 gene amplification and clinicopathological features in gastric cancer.</a> British Journal of Cancer. 106 (4), 727-732 (2012).</li><li>Weiss, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequent+and+focal+FGFR1+amplification+associates+with+therapeutically+tractable+FGFR1+dependency+in+squamous+cell+lung+cancer.">Frequent and focal FGFR1 amplification associates with therapeutically tractable FGFR1 dependency in squamous cell lung cancer.</a> Science Translational Medicine. 2 (62), 62ra93 (2010).</li><li>Babina, I. S., Turner, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+challenges+in+targeting+FGFR+signaling+in+cancer.">Advances and challenges in targeting FGFR signaling in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (5), 318-322 (2017).</li><li>Katoh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+receptors+as+treatment+targets+in+clinical+oncology.">Fibroblast growth factor receptors as treatment targets in clinical oncology.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 16 (2), 105-122 (2019).</li><li>Soria, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I/IIa+study+evaluating+the+safety,+efficacy,+pharmacokinetics,+and+pharmacodynamics+of+lucitanib+in+advanced+solid+tumors.">Phase I/IIa study evaluating the safety, efficacy, pharmacokinetics, and pharmacodynamics of lucitanib in advanced solid tumors.</a> Annals of Oncology. 25 (11), 2244-2251 (2014).</li><li>French, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+FGFR4+inhibits+hepatocellular+carcinoma+in+preclinical+mouse+models.">Targeting FGFR4 inhibits hepatocellular carcinoma in preclinical mouse models.</a> PLoS ONE. 7 (5), e36713 (2012).</li><li>Martinez-Torrecuadrada, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+extracellular+domain+of+fibroblast+growth+factor+receptor+3+with+human+single-chain+Fv+antibodies+inhibits+bladder+carcinoma+cell+line+proliferation.">Targeting the extracellular domain of fibroblast growth factor receptor 3 with human single-chain Fv antibodies inhibits bladder carcinoma cell line proliferation.</a> Clinical Cancer Research. 11 (17), 6280-6290 (2005).</li><li>Palamakumbura, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysyl+oxidase+propeptide+inhibits+prostate+cancer+cell+growth+by+mechanisms+that+target+FGF-2-cell+binding+and+signaling.">Lysyl oxidase propeptide inhibits prostate cancer cell growth by mechanisms that target FGF-2-cell binding and signaling.</a> Oncogene. 28 (38), 3390-3400 (2009).</li><li>Ladner, R. C., Sato, A. K., Gorzelany, J., de Souza, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+display-derived+peptides+as+therapeutic+alternatives+to+antibodies.">Phage display-derived peptides as therapeutic alternatives to antibodies.</a> Drug Discovery Today. 9 (12), 525-529 (2004).</li><li>Wu, C. H., Liu, I. J., Lu, R. M., Wu, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancement+and+applications+of+peptide+phage+display+technology+in+biomedical+science.">Advancement and applications of peptide phage display technology in biomedical science.</a> Journal of Biomedical Science. 23, 8 (2016).</li><li>Kay, B. K., Kasanov, J., Yamabhai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+phage-displayed+combinatorial+peptide+libraries.">Screening phage-displayed combinatorial peptide libraries.</a> Methods. 24 (3), 240-246 (2001).</li><li>Rodi, D. J., Makowski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage-display+technology+-+Finding+a+needle+in+a+vast+molecular+haystack.">Phage-display technology - Finding a needle in a vast molecular haystack.</a> Current Opinion in Biotechnology. 10, 87-93 (1999).</li><li>Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+M13+for+phage+display.">Engineering M13 for phage display.</a> Biomolecular Engineering. 18, 57-63 (2002).</li><li>Hamzeh-Mivehroud, M., Mahmoudpour, A., Dastmalchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+new+peptide+ligands+for+epidermal+growth+factor+receptor+using+phage+display+and+computationally+modeling+their+mode+of+binding.">Identification of new peptide ligands for epidermal growth factor receptor using phage display and computationally modeling their mode of binding.</a> Chemical Biology &amp; Drug Design. 79 (3), 246-259 (2012).</li><li>Askoxylakis, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide-based+targeting+of+the+platelet-derived+growth+factor+receptor+beta.">Peptide-based targeting of the platelet-derived growth factor receptor beta.</a> Molecular Imaging and Biology. 15 (2), 212-221 (2013).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transdermal+protein+delivery+by+a+coadministered+peptide+identified+via+phage+display.">Transdermal protein delivery by a coadministered peptide identified via phage display.</a> Nature Biotechnology. 24 (4), 455-460 (2006).</li><li>Azzazy, H. M., Highsmith, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+display+technology:+clinical+applications+and+recent+innovations.">Phage display technology: clinical applications and recent innovations.</a> Clinical Biochemistry. 35, 425-445 (2002).</li><li>Pasqualini, R., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+targeting+In+vivo+using+phage+display+peptide+libraries.">Organ targeting In vivo using phage display peptide libraries.</a> Nature. 380 (6572), 364-366 (1996).</li><li>Liu, R., Li, X., Xiao, W., Lam, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-targeting+peptides+from+combinatorial+libraries.">Tumor-targeting peptides from combinatorial libraries.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 110-111, 13-37 (2017).</li><li>Binetruy-Tournaire, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+peptide+blocking+vascular+endothelial+growth+factor+(VEGF)-mediated+angiogenesis.">Identification of a peptide blocking vascular endothelial growth factor (VEGF)-mediated angiogenesis.</a> The EMBO Journal. 19, 1525-1533 (2000).</li><li>Peng, Y., Zhang, Y., Mitchell, W. J., Zhang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Lipopolysaccharide-Targeted+Peptide+Mimic+Vaccine+against+Q+Fever.">Development of a Lipopolysaccharide-Targeted Peptide Mimic Vaccine against Q Fever.</a> Journal of Immunology. 189, 4909-4920 (2012).</li><li>Lamichhane, T. N., Abeydeera, N. D., Duc, A. C., Cunningham, P. R., Chow, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+Peptides+Targeting+Helix+31+of+Bacterial+16S+Ribosomal+RNA+by+Screening+M13+Phage-Display+Libraries.">Selection of Peptides Targeting Helix 31 of Bacterial 16S Ribosomal RNA by Screening M13 Phage-Display Libraries.</a> Molecules. 16, 1211-1239 (2011).</li><li>Sahin, D., Taflan, S. O., Yartas, G., Ashktorab, H., Smoot, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+Identification+of+Peptides+Specifically+Targeted+to+Gastric+Cancer+Cells+from+a+Phage+Display+Peptide+Library.+Asian+Pacific.">Screening and Identification of Peptides Specifically Targeted to Gastric Cancer Cells from a Phage Display Peptide Library. Asian Pacific.</a> Journal of Cancer Prevention. 19 (4), 927-932 (2018).</li><li>Kelly, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+nanoparticles+for+imaging+incipient+pancreatic+ductal+adenocarcinoma.">Targeted nanoparticles for imaging incipient pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> PLOS Medicine. 5 (4), e85 (2008).</li><li>Sugihara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+pro-apoptotic+peptides+as+potential+therapy+for+peritoneal+endometriosis.">Development of pro-apoptotic peptides as potential therapy for peritoneal endometriosis.</a> Nature Communications. 5, 4478 (2014).</li><li>Rafii, S., Avecilla, S. T., Jin, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+vasculature+address+book:+Identification+of+stage-specific+tumor+vessel+zip+codes+by+phage+display.">Tumor vasculature address book: Identification of stage-specific tumor vessel zip codes by phage display.</a> Cancer Cell. 4, 331-333 (2003).</li><li>Arap, W., Pasqualini, R., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+Treatment+by+Targeted+Drug+Delivery+to+Tumor+Vasculature+in+a+Mouse+Model.">Cancer Treatment by Targeted Drug Delivery to Tumor Vasculature in a Mouse Model.</a> Science. 279, 377-390 (1997).</li></ol>

組み合わせファージライブラリーは、標的分子を結合し、その機能13を調節することができる新規ペプチドのハイスループットスクリーニングのための強力かつ効果的なツールです。現在、ファージディスプレイペプチドライブラリーは、幅広い用途を持っている。例えば、それらは、受容体タンパク質23に結合した生理活性ペプチド23、非タンパク質<sup cl...

線維芽細胞増殖因子受容体(FGFR)は、生体内1における細胞増殖、創傷治癒、血管新生において重要な役割を果たす。様々な腫瘍2、3、4、5で観察されるFGFRシグナル伝達の異常な活性化は、遺伝子増幅、遺伝子変異、染色体収差、および過剰なリガンド分泌6を含む.FGFRを標的とする多くの阻害剤は、臨床試験において有望な治療効果を示しており、主に(1)FGFRの細胞内ドメインに結合する(1)低分子キナーゼ阻害剤、(2)アンタゴニストを標的とするアンタゴニスト細胞外セグメント、および (3) FGF リガンドトラップ6.いくつかの小分子キナーゼ阻害剤はインビトロとインビボ7の両方で良好な治療効果を有するが、それらのほとんどは標的特異性が悪く、高血圧8などの副作用を示す。アンタゴニストの大部分は、モノクローナル抗体9、10およびポリペプチド11である。ペプチドは、その特異性と低い副作用のために小分子よりも利点があります。.それらはまた細胞透過性を保持し、タンパク質薬12と比較して特定の器官に蓄積しない。したがって、標的化された小ペプチドは、有効かつ将来的な治療薬の両方である。
ファージ表示技術は、与えられた分子13、14、15に結合することができる小さなペプチドを識別するための簡単だが強力なツールである。標的分子に結合するために尾部に表示される10以上の9種類のペプチド配列を有する単純なM13ファージに基づくファージ表示ペプチドライブラリーを用いた(材料の表を参照)16。与えられた分子に対するファージの親和性が高いため、結合されていないファージを洗い流し、所望の短いペプチドと密接に結合したファージのみが保持されます。与えられた分子標的は、固定化タンパク質17、18、炭水化物、培養細胞、あるいは無機材料19、20であってもある。ファージ表示技術21を用いて生体内で臓器特異的ペプチドが選択されたエキサイティングな症例が報告された。ファージディスプレイ技術の利点は、高スループット、操作の容易さ、低コストとアプリケーションの広い範囲2を含みます。
本研究では、ファージ表示ライブラリーを用いて固定化タンパク質(FGFR2)に結合する小さなペプチドをスクリーニングする詳細なプロトコルを提供する。この技術の有効性は、イソソーマル滴定カロリー(ITC)によるFGFR2に対する得られたペプチドの親和性、および細胞増殖アッセイによる生物活性を測定することによっても検討される。この方法は、炭水化物、培養細胞、あるいは無機材料に結合する小さなペプチドをスクリーニングするために拡張されてもよい。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m Filter</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MPGP002A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 cm2 Small dish</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>150460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Guangzhou chemical reagent factory</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-96 gIII sequencing primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Synthesis from Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Nest</td>
			<td>701001-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST004D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto-Tryptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>L0037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c 3T3 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-&#173;6587</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Biodragon</td>
			<td>BD-M10110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCK-8 kit</td>
			<td>DOJINDO</td>
			<td>CK04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>sh30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMF</td>
			<td>Newprobe</td>
			<td>PB10247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15576028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2 Protein</td>
			<td>Sino Biological Inc.</td>
			<td>10014-HNAE</td>
			<td>Purity &#62;95%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITC200 system</td>
			<td>MicroCal Omega</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Guangzhou chemical reagent factory</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaI</td>
			<td>Bidepharm</td>
			<td>BD40879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Guangzhou chemical reagent factory</td>
			<td>1310-73-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG&#8211;8000</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2139-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ph.D.-7 phage display peptide library kit</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E8100S</td>
			<td>Containing the Ph.D.-7 phage library, E. coli ER2738 host strain and M13KE control phage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant FGFR2 extracellular domain proteins</td>
			<td>Sino Biological Inc.</td>
			<td>10824-H08H</td>
			<td>Purity &#62; 97%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small peptide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Synthesis from GL Biochem Ltd. (Shanghai, China)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-SHS-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SLF-T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

screening and identification of small peptides targeting fibroblast growth factor receptor2 using a phage display peptide library

ヒト線維芽細胞増殖因子受容体(FGFR)ファミリーは、細胞増殖、生存、移行および分化を含む様々な生物学的活動に関与する4つのメンバー、すなわち、FGFR1、FGFR2、FGFR3、およびFGFR4からなる。変異または遺伝子増幅イベントに起因するFGFRシグナル伝達経路におけるいくつかの収差は、様々なタイプの癌で同定されている。したがって、最近の研究は、FGFRの治療的ターゲティングを含む戦略の開発に焦点を当てています.モノクローナル抗体は、パイプライン内のいくつかのペプチドベースの阻害剤しか持ち合わせていません。ここでは、FGFR2のアンタゴニストとして小さなペプチドをスクリーニングするファージ表示技術を用いるプロトコルを提供する。簡単に言えば、ファージ表示ペプチドのライブラリーをFGFR2でコーティングしたプレートでインキュベートした。続いて、非結合ファージをTBST(TBS+0.1%[v/v]Tween-20)によって洗い流し、結合ファージを0.2Mグリシン-HClバッファー(pH2.2)でelate化した。elutedファージをさらに増幅し、バイオパンニングの次のラウンドの入力として使用した。3回のバイオパンニングの後、個々のファージクローンのペプチド配列をDNAシーケンシングにより同定した。最後に、スクリーニングされたペプチドを合成し、親和性および生物学的活性について分析した。

FGFR2を標的とする高親和性の小ペプチドを得る。
FGFR2を標的とするファージをスクリーニングするために、本研究では博士号-7ライブラリを用いて使用した。ワークフローの概略図を図 1 に示します。この過程で、ファージ入力数(PFU)は変化しないまま、FGFR2タンパク質のコーティング濃度は徐々に減少した。ファージ・ティターの結果?...

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Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library

本明細書では、ファージ表示ペプチドライブラリーを用いてFGFR2に結合する小さなペプチドをスクリーニングするための詳細なプロトコルを提示する。さらに、インビトロのFGFR2に対する選択されたペプチドの親和性と細胞増殖を抑制する能力を分析した。

ファージ表示ペプチドライブラリーを用いて線維芽細胞増殖因子受容体2を標的とする小ペプチドのスクリーニングと同定

The human Fibroblast Growth Factor Receptor (FGFR) family comprises four members, namely, FGFR1, FGFR2, FGFR3, and FGFR4, that are involved in various ...

他の方法と比較して、このプロトコルは、新しいアンタゴニスター、アゴニスト、およびアロステリックモジュレーターを、水力希釈構造と標的タンパク質の形成を知らずに定量的かつ定性的に見つけ出す方が簡単です。このプロトコルは、高効率、取り扱いが容易、経済的、および商業的に入手可能である。この高スループットスクリーニング法をITC分析と組み合わせることで、機能的小ペプチドを定量的かつ定性的に得ることができる。この手順のデモンストレーションは、私たちの研究室の大学院生であるイン・ジャオとチャン・ワンです。この手順を開始するには、1ミリリットル当たり10マイクログラムの濃度でコーティングバッファーにFGFR2の溶液を調製する。35平方センチメートルの皿に溶液の1ミリリットルを追加し、表面が完全に濡れるまで繰り返し旋回します。揺れで摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、コーティング液を注ぎ、準備したブロッキング溶液を追加します。少なくとも1時間摂氏4度でインキュベートし、ブロッキング溶液を捨て、皿が乾燥しないようにしながらTBSTでプレートを6回素早く洗います。元のファージライブラリをTBSTの1ミリリットルで再構成し、コーティングされた皿にこれを追加します。室温でプレートを静かに揺らす。その後、上清を捨て、TBSTで10回洗います。0.2モルグリシンHCLの1ミリリットルを皿に加え、室温で10分間穏やかに揺らすことで、結合ファージをエルプします。溶出管を殺菌されたマイクロ遠心分離管に移し、pH 9.1で1モルトリスHCLの100マイクロリットルでそれを中和する。まず、準備したLBとIPTG X-Galプレートを使用前に少なくとも1時間摂氏37度で予熱します。フィルターカートリッジとピペットチップを使用して、LBで溶出液の10倍希釈液の100マイクロリットルを調製します。調製された大腸菌培養が中ログ相に達した後、200マイクロリットルの培養液を、溶出希釈液ごとに1本の滅菌マイクロ遠心チューブに分配する。感染を開始するには、大腸菌培養物を含むチューブに各希釈液の50マイクロリットルを加える。渦を素早く、室温で5分間インキュベートします。次に、コーティングスティックを使用して、この混合物の90マイクロリットルでLBとIPTG X-GALプレートをコーティングします。5分後、プレートを反転させ、摂氏37度で一晩インキュベートします。プラークが現れたときに数えます。まず、250ミリリットルのエルレンマイヤーフラスコで20ミリリットルのLBで一晩培養を希釈する。増幅されていない溶出液を加え、4-1/2時間激しく揺れで摂氏37度でインキュベートします。次に、培養物を12,000倍G、摂氏4度で10分間遠心する。上清を新鮮なチューブに移します。同じ条件を使用して再び遠心分離機を使用し、ペレットを捨てます。上清の上80%を新鮮なチューブに移し、20%ポリエチレングリコールと2.5モル塩化ナトリウムの1/6体積に加えます。ファージを摂氏4度で一晩沈殿させます。翌日、12,000倍Gで沈殿したファージを遠心分離し、摂氏4度で15分間行う。上清と遠心分離機を同じ条件でもう一度捨てます。ピペットを使用して残留上清を除去します。1ミリリットルのTBSでペレットを再懸濁し、上清をマイクロ遠心チューブに移します。12,000倍Gで遠心分離機、5分間摂氏4度。上清を新鮮なマイクロ遠心分離チューブに移し、20%ポリエチレングリコールと2.5モル塩化ナトリウムの1/6体積を加えて再び沈殿します。氷の上で15〜60分間インキュベートします。次に、12,000倍Gで遠心分離機、摂氏4度で10分間。上清と遠心分離機を同じ条件でもう一度捨てます。ピペットを使用して残留上清を除去します。200マイクロリットルのTBSと遠心分離機のペレットを再懸濁して、不純物を取り除きます。次いで上清を新鮮なマイクロ遠心チューブに移し、増幅された溶出液を得る。本研究では、FGFR2タンパク質の被覆濃度が徐々に低下する一方で、ファージ入力の数は変わらない。ファージ価の結果は、回収されたファージの数が徐々に増加し、3ラウンド後に、第1ラウンドのそれに比べて65倍の増加があることを示唆している。次いで、FGFR2に対する小ペプチドの親和性を測定するためにITC実験を行う。結果は、SP1ペプチドがFGFR2に対して高い親和性を有することを示す。このデータは、スクリーニングプロトコルの効率を示しています。SP1ペプチドの生物活性を調べるため、CCK-8キットを用いて線維芽細胞増殖アッセイが行われる。BALB/C3T3は、異なる濃度でSP1ペプチドと共にインキュベートされる。この結果は、SP1ペプチドが細胞の増殖を抑制することを示唆している。野生型ファージによる汚染はここで避ける必要があります。エアロゾル耐性ピペットチップを使用してください。成長しながらファージ増幅を得る。この手順は、炭水化物、培養細胞、および組織に結合する小さなペプチドのスクリーニングにも使用できます。これらのペプチドは、診断および標的化を介してさらに増幅することができる

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

上皮成長因子受容体をターゲットとしたゼラチンベースのエンジニアNanovectorsを使用してヒト膵臓癌細胞における遺伝子デリバリーとトランスフェクション

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

電気化学センサを用いた細菌検出＆識別

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Generation and Recovery of ÃƒÅ½Ã‚Â²-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

ステップ成長PEG-ペプチドハイドロゲルからβ細胞のスフェロイドの発生と復旧

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional  microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for  ...

Observing and Quantifying Fibroblast-mediated Fibrin Gel Compaction

線維芽細胞媒介フィブリンゲル圧縮の観察と定量

Cells embedded in collagen and fibrin gels attach and exert traction forces on the fibers of the gel. These forces can lead to local and global ...

Electrospinning Growth Factor Releasing Microspheres into Fibrous Scaffolds

繊維状足場に微小球を離すエレクトロ成長因子

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth.  This system incorporates mechanical, topographical, ...

Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

エンドソーム溶解試薬dfTATとのインキュベーションによって生細胞へのタンパク質、ペプチドまたは細胞不浸透性小分子の送達

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the ...

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

相関顕微鏡を用いて、無傷の細胞における上皮成長因子受容体の化学量論を学びます

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

A Rapid and Quantitative Fluorimetric Method for Protein-Targeting Small Molecule Drug Screening

タンパク質 - 小分子標的薬のスクリーニングのための迅速かつ定量的蛍光法

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold ...

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

ヘパリン結合ドメイン骨形成成長因子の送達のための高分子電解質複合体

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

Initial Evaluation of Antibody-conjugates Modified with Viral-derived Peptides for Increasing Cellular Accumulation and Improving Tumor Targeting

細胞集積量の増加と腫瘍標的化の改善のためウイルス由来ペプチド修飾抗体複合体の初期評価

Antibody-conjugates (ACs) modified with virus-derived peptides are a potentially powerful class of tumor cell delivery agents for molecular payloads used ...