Name: screening and identification of small peptides targeting fibroblast growth factor receptor2 using a phage display peptide library
Uploaded: 2019-09-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library at JoVE.com

이 작품은 광저우의 과학 기술 프로그램 (No. 2016201604030039)에 의해 지원되었습니다.

1. 시약 준비
<ol><li>LB (리소제니 국물) 매체: 트립톤 1g, 효모 추출물 0.5 g, NaCl 0.5 g을 H2O. 오토클레이브 100 mL에 녹여 4°C에서 보관합니다.</li>
	<li>테트라 사이클린 재고: 1:1 에탄올:H2O. -20°C에 보관하고 사용하기 전에 소용돌이에 20 mg/mL을 준비하십시오.</li>
	<li>IPTG/X-gal 용액: 0.5 g의 IPTG(이소프로필 β-D-1-티오갈라코피라노사이드)와 X-gal 0.4 g(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴라일 β-D-갈락토...

<ol>
	<li>Eswarakumar, V. P., Lax, I., Schlessinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+signaling+by+fibroblast+growth+factor+receptors.">Cellular signaling by fibroblast growth factor receptors.</a> Cytokine &amp; Growth Factor Reviews. 16 (2), 139-149 (2005).</li><li>Turner, N., Grose, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+signaling:+from+development+to+cancer.">Fibroblast growth factor signaling: from development to cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 10 (2), 116-129 (2010).</li><li>Cancer Genome Atlas Network. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+molecular+portraits+of+human+breast+tumors.">Comprehensive molecular portraits of human breast tumors.</a> Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).</li><li>Matsumoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGFR2+gene+amplification+and+clinicopathological+features+in+gastric+cancer.">FGFR2 gene amplification and clinicopathological features in gastric cancer.</a> British Journal of Cancer. 106 (4), 727-732 (2012).</li><li>Weiss, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequent+and+focal+FGFR1+amplification+associates+with+therapeutically+tractable+FGFR1+dependency+in+squamous+cell+lung+cancer.">Frequent and focal FGFR1 amplification associates with therapeutically tractable FGFR1 dependency in squamous cell lung cancer.</a> Science Translational Medicine. 2 (62), 62ra93 (2010).</li><li>Babina, I. S., Turner, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+challenges+in+targeting+FGFR+signaling+in+cancer.">Advances and challenges in targeting FGFR signaling in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (5), 318-322 (2017).</li><li>Katoh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+receptors+as+treatment+targets+in+clinical+oncology.">Fibroblast growth factor receptors as treatment targets in clinical oncology.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 16 (2), 105-122 (2019).</li><li>Soria, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I/IIa+study+evaluating+the+safety,+efficacy,+pharmacokinetics,+and+pharmacodynamics+of+lucitanib+in+advanced+solid+tumors.">Phase I/IIa study evaluating the safety, efficacy, pharmacokinetics, and pharmacodynamics of lucitanib in advanced solid tumors.</a> Annals of Oncology. 25 (11), 2244-2251 (2014).</li><li>French, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+FGFR4+inhibits+hepatocellular+carcinoma+in+preclinical+mouse+models.">Targeting FGFR4 inhibits hepatocellular carcinoma in preclinical mouse models.</a> PLoS ONE. 7 (5), e36713 (2012).</li><li>Martinez-Torrecuadrada, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+extracellular+domain+of+fibroblast+growth+factor+receptor+3+with+human+single-chain+Fv+antibodies+inhibits+bladder+carcinoma+cell+line+proliferation.">Targeting the extracellular domain of fibroblast growth factor receptor 3 with human single-chain Fv antibodies inhibits bladder carcinoma cell line proliferation.</a> Clinical Cancer Research. 11 (17), 6280-6290 (2005).</li><li>Palamakumbura, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysyl+oxidase+propeptide+inhibits+prostate+cancer+cell+growth+by+mechanisms+that+target+FGF-2-cell+binding+and+signaling.">Lysyl oxidase propeptide inhibits prostate cancer cell growth by mechanisms that target FGF-2-cell binding and signaling.</a> Oncogene. 28 (38), 3390-3400 (2009).</li><li>Ladner, R. C., Sato, A. K., Gorzelany, J., de Souza, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+display-derived+peptides+as+therapeutic+alternatives+to+antibodies.">Phage display-derived peptides as therapeutic alternatives to antibodies.</a> Drug Discovery Today. 9 (12), 525-529 (2004).</li><li>Wu, C. H., Liu, I. J., Lu, R. M., Wu, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancement+and+applications+of+peptide+phage+display+technology+in+biomedical+science.">Advancement and applications of peptide phage display technology in biomedical science.</a> Journal of Biomedical Science. 23, 8 (2016).</li><li>Kay, B. K., Kasanov, J., Yamabhai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+phage-displayed+combinatorial+peptide+libraries.">Screening phage-displayed combinatorial peptide libraries.</a> Methods. 24 (3), 240-246 (2001).</li><li>Rodi, D. J., Makowski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage-display+technology+-+Finding+a+needle+in+a+vast+molecular+haystack.">Phage-display technology - Finding a needle in a vast molecular haystack.</a> Current Opinion in Biotechnology. 10, 87-93 (1999).</li><li>Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+M13+for+phage+display.">Engineering M13 for phage display.</a> Biomolecular Engineering. 18, 57-63 (2002).</li><li>Hamzeh-Mivehroud, M., Mahmoudpour, A., Dastmalchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+new+peptide+ligands+for+epidermal+growth+factor+receptor+using+phage+display+and+computationally+modeling+their+mode+of+binding.">Identification of new peptide ligands for epidermal growth factor receptor using phage display and computationally modeling their mode of binding.</a> Chemical Biology &amp; Drug Design. 79 (3), 246-259 (2012).</li><li>Askoxylakis, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide-based+targeting+of+the+platelet-derived+growth+factor+receptor+beta.">Peptide-based targeting of the platelet-derived growth factor receptor beta.</a> Molecular Imaging and Biology. 15 (2), 212-221 (2013).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transdermal+protein+delivery+by+a+coadministered+peptide+identified+via+phage+display.">Transdermal protein delivery by a coadministered peptide identified via phage display.</a> Nature Biotechnology. 24 (4), 455-460 (2006).</li><li>Azzazy, H. M., Highsmith, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+display+technology:+clinical+applications+and+recent+innovations.">Phage display technology: clinical applications and recent innovations.</a> Clinical Biochemistry. 35, 425-445 (2002).</li><li>Pasqualini, R., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+targeting+In+vivo+using+phage+display+peptide+libraries.">Organ targeting In vivo using phage display peptide libraries.</a> Nature. 380 (6572), 364-366 (1996).</li><li>Liu, R., Li, X., Xiao, W., Lam, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-targeting+peptides+from+combinatorial+libraries.">Tumor-targeting peptides from combinatorial libraries.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 110-111, 13-37 (2017).</li><li>Binetruy-Tournaire, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+peptide+blocking+vascular+endothelial+growth+factor+(VEGF)-mediated+angiogenesis.">Identification of a peptide blocking vascular endothelial growth factor (VEGF)-mediated angiogenesis.</a> The EMBO Journal. 19, 1525-1533 (2000).</li><li>Peng, Y., Zhang, Y., Mitchell, W. J., Zhang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Lipopolysaccharide-Targeted+Peptide+Mimic+Vaccine+against+Q+Fever.">Development of a Lipopolysaccharide-Targeted Peptide Mimic Vaccine against Q Fever.</a> Journal of Immunology. 189, 4909-4920 (2012).</li><li>Lamichhane, T. N., Abeydeera, N. D., Duc, A. C., Cunningham, P. R., Chow, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+Peptides+Targeting+Helix+31+of+Bacterial+16S+Ribosomal+RNA+by+Screening+M13+Phage-Display+Libraries.">Selection of Peptides Targeting Helix 31 of Bacterial 16S Ribosomal RNA by Screening M13 Phage-Display Libraries.</a> Molecules. 16, 1211-1239 (2011).</li><li>Sahin, D., Taflan, S. O., Yartas, G., Ashktorab, H., Smoot, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+Identification+of+Peptides+Specifically+Targeted+to+Gastric+Cancer+Cells+from+a+Phage+Display+Peptide+Library.+Asian+Pacific.">Screening and Identification of Peptides Specifically Targeted to Gastric Cancer Cells from a Phage Display Peptide Library. Asian Pacific.</a> Journal of Cancer Prevention. 19 (4), 927-932 (2018).</li><li>Kelly, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+nanoparticles+for+imaging+incipient+pancreatic+ductal+adenocarcinoma.">Targeted nanoparticles for imaging incipient pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> PLOS Medicine. 5 (4), e85 (2008).</li><li>Sugihara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+pro-apoptotic+peptides+as+potential+therapy+for+peritoneal+endometriosis.">Development of pro-apoptotic peptides as potential therapy for peritoneal endometriosis.</a> Nature Communications. 5, 4478 (2014).</li><li>Rafii, S., Avecilla, S. T., Jin, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+vasculature+address+book:+Identification+of+stage-specific+tumor+vessel+zip+codes+by+phage+display.">Tumor vasculature address book: Identification of stage-specific tumor vessel zip codes by phage display.</a> Cancer Cell. 4, 331-333 (2003).</li><li>Arap, W., Pasqualini, R., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+Treatment+by+Targeted+Drug+Delivery+to+Tumor+Vasculature+in+a+Mouse+Model.">Cancer Treatment by Targeted Drug Delivery to Tumor Vasculature in a Mouse Model.</a> Science. 279, 377-390 (1997).</li></ol>

조합 파지 라이브러리는 표적 분자를 결합하고 그들의 기능을 조절할 수 있는 새로운 펩티드의 높은 처리량 스크리닝을 위한 강력하고 효과적인 공구입니다13. 현재 파지 디스플레이 펩타이드 라이브러리는 광범위한 응용 을 가지고 있다. 예를 들어, 수용체단백질(23)및 비단백질 표적24,25,질병 특이적 항원 모방<sup cl...

섬유아세포 성장 인자 수용체(FGFRs)는 생체 내 세포 증식, 상처 치유 및 혈관신생에 중요한 역할을한다. 다양한 종양에서 관찰되는 FGFR 신호의 비정상적인 활성화2,3,4,5는 유전자 증폭, 유전자 돌연변이, 염색체 수차 및 과도한 리간드 분비를 포함한다6 . FGFRs를 표적으로 하는 많은 억제제는 임상 시험에서 유망한 치료 효과를 보여주었으며 주로 세 가지 유형으로 분류됩니다: (1) FGFR의 세포내 도메인에 결합하는 소분자 키나아제 억제제, (2) 길항제를 표적으로 하는 길항제 세포 외 세그먼트, 및 (3) FGF 리간드 트랩6. 몇몇 소분자 키나아제 억제제는 시험관내 및 생체내 모두 좋은 치료 효과를 가지고 있지만7,그들 대부분은 표적 특이성이 좋지 않으며 고혈압8과같은 부작용을 나타낸다. 길항제의 대다수는 단일클론 항체9,10 및 폴리펩티드11이다. 펩티드는 특이성과 낮은 부작용으로 인해 작은 분자에 비해 장점이 있습니다. 그(것)들은 또한 세포 투과성을 유지하고 단백질 약12에비교된 특정 기관에 축적되지 않습니다. 따라서, 표적된 작은 펩티드는 모두 효과적이고 장래치료제이다.
파지 디스플레이 기술은 주어진 분자13,14,15에결합 할 수있는 작은 펩티드를 식별하기위한 쉽고 강력한 도구입니다. 표적 분자에 결합하기 위해 꼬리에 표시된 10개 이상의9개 상이한 펩타이드 서열을 가진 간단한 M13 파지를 기반으로 하는 파지 디스플레이 펩타이드 라이브러리를 사용하였다(재료표 참조)16. 주어진 분자를 향한 파지의 높은 친화도 로 인해, 언바운드 파지는 멀리 세척 될 수 있으며, 원하는 짧은 펩티드와 단단히 결합 된 파지만 유지됩니다. 주어진 분자 표적은 단백질17,18,탄수화물, 배양 세포, 또는 무기 물질19,20을고정화시킬 수 있다. 파지 디스플레이기술(21)을이용하여 생체 내에서 장기 특이적 펩타이드가 선택된 곳에서 흥미로운 사례가 보고되었다. 파지 디스플레이 기술의 장점은 높은 처리량, 작동 용이성, 저렴한 비용 및 광범위한 응용 분야22를포함한다.
본 연구에서, 우리는 파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 고정화 단백질(FGFR2)에 결합하는 작은 펩티드를 스크리닝하는 상세한 프로토콜을 제공한다. 기술의 효능은 또한 등소말 적정 열량계(ITC)에 의해 FGFR2를 향하여 얻어진 펩티드의 친화도 및 세포 증식 분석에 의한 생물학적 활성을 측정함으로써 조사된다. 상기 방법은 탄수화물, 배양세포, 또는 무기물질에 결합하는 작은 펩티드를 스크리닝하기 위해 확장될 수 있다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m Filter</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MPGP002A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 cm2 Small dish</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>150460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Guangzhou chemical reagent factory</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-96 gIII sequencing primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Synthesis from Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Nest</td>
			<td>701001-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST004D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto-Tryptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>L0037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c 3T3 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-&#173;6587</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Biodragon</td>
			<td>BD-M10110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCK-8 kit</td>
			<td>DOJINDO</td>
			<td>CK04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>sh30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMF</td>
			<td>Newprobe</td>
			<td>PB10247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15576028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2 Protein</td>
			<td>Sino Biological Inc.</td>
			<td>10014-HNAE</td>
			<td>Purity &#62;95%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITC200 system</td>
			<td>MicroCal Omega</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Guangzhou chemical reagent factory</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaI</td>
			<td>Bidepharm</td>
			<td>BD40879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Guangzhou chemical reagent factory</td>
			<td>1310-73-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG&#8211;8000</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2139-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ph.D.-7 phage display peptide library kit</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E8100S</td>
			<td>Containing the Ph.D.-7 phage library, E. coli ER2738 host strain and M13KE control phage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant FGFR2 extracellular domain proteins</td>
			<td>Sino Biological Inc.</td>
			<td>10824-H08H</td>
			<td>Purity &#62; 97%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small peptide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Synthesis from GL Biochem Ltd. (Shanghai, China)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-SHS-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SLF-T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

screening and identification of small peptides targeting fibroblast growth factor receptor2 using a phage display peptide library

인간 섬유아세포 성장 인자 수용체(FGFR) 패밀리는 세포 증식, 생존, 이동 및 분화를 포함한 다양한 생물학적 활동에 관여하는 4개의 멤버, 즉 FGFR1, FGFR2, FGFR3 및 FGFR4를 포함한다. 돌연변이 또는 유전자 증폭 사건으로 인해 FGFR 신호 통로에 있는 몇몇 수차는, 암의 각종 모형에서 확인되었습니다. 따라서, 최근 연구는 FGFRs의 치료 표적화와 관련된 전략 개발에 초점을 맞추고있다. 단클론 항체, 파이프 라인에 몇 펩티드 기반 억제제. 여기서, 우리는 FGFR2의 길항제로 작은 펩티드를 스크리밍하는 파지 디스플레이 기술을 이용한 프로토콜을 제공한다. 간략하게, 파지-디스플레이 펩티드라이브러리를 FGFR2로 코팅된 플레이트에 배양하였다. 이어서, 언바운드 파지를 TBST(TBS + 0.1% [v/v] 트웬-20)에 의해 세척하고, 결합된 파지를 0.2 M 글리신-HCl 완충액(pH 2.2)으로 용출하였다. 용출된 파지는 더욱 증폭되었고 다음 바이오패닝 라운드에 대한 입력으로서 사용되었다. 바이오패닝의 3라운드에 이어, 개별 파지 클론의 펩티드 서열은 DNA 염기서열 분석으로 확인되었다. 마지막으로, 스크리마한 펩티드를 합성하고 친화성 및 생물학적 활성을 분석하였다.

FGFR2표적화하는 고친화성 소형 펩티드를 획득한다.
FGFR2를 대상으로 하는 파지를 스크리플하기 위해 이 연구에서 박사-7 라이브러리를 사용했습니다. 워크플로의 개략적 표현은 그림 1에나와 있습니다. 이 과정에서, 파지 입력(PFU)의 수는 변하지 않은 반면, FGFR2 단백질의 코팅 농도는 점차 감소하였다. 파지 역가의 결과는 회수된 파지의 수가...

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Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library

본 명세서에서, 파지 디스플레이 펩티드 라이브러리를 사용하여 FGFR2에 결합하는 작은 펩티드를 스크리닝하기 위한 상세한 프로토콜을 제시한다. 우리는 시험관내에서 FGFR2를 향한 선택된 펩티드의 친화도 및 세포 증식을 억제하는 능력을 추가로 분석한다.

파지 디스플레이 펩타이드 라이브러리를 사용하여 섬유아세포 성장 인자 수용체2를 표적으로 하는 소형 펩타이드의 스크리닝 및 식별

The human Fibroblast Growth Factor Receptor (FGFR) family comprises four members, namely, FGFR1, FGFR2, FGFR3, and FGFR4, that are involved in various ...

다른 방법에 비해, 이 프로토콜은 표적 단백질의 수력 희석 구조 및 형성을 모르고 새로운 길항제, 고뇌, 알로스터 및 알로스터변조기를 정량적으로 그리고 질적으로 찾아내는 것이 더 쉽습니다. 이 프로토콜은 높은 효율적이고, 다루기 쉽고, 경제적이며, 상업적으로 사용할 수 있습니다. 이 높은 처리량 스크리닝 방법을 ITC 분석과 결합하면 기능성 소형 펩타이드를 정량적으로 그리고 질적으로 얻을 수 있다.이 절차를 시연하는 것은 우리 실험실대학원생인 잉자오와 치앙 왕입니다. 이 절차를 시작하려면 밀리리터당 10 마이크로그램의 농도로 코팅 버퍼에서 FGFR2 의 용액을 준비하십시오. 35 평방 센티미터 접시에 용액 의 1 밀리리터를 추가하고 표면이 완전히 젖을 때까지 반복적으로 소용돌이.흔들림과 함께 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 다음 날, 코팅 용액을 부어 준비 된 차단 용액을 추가합니다. 적어도 한 시간 동안 섭씨 4도에서 배양 한 다음 차단 용액을 버리고 접시가 건조하지 않도록하면서 TBST로 접시를 6 번 빠르게 씻으십시오.TBST의 1 밀리리터로 원래 파지 라이브러리를 재구성하고 코팅 된 접시에 추가합니다. 실온에서 2시간 동안 셰이커에 접시를 부드럽게 흔들어 줍니다. 그 후, 상체를 버리고 TBST로 접시를 10 번 씻으십시오.식기에 0.2 어금니 글리신 HCL의 1 밀리리터를 추가하고 10 분 동안 실온에서 부드럽게 흔들어 결합 된 파지를 엘테. 용액을 살균 된 미세 원심 분리기 튜브로 옮기고 pH 9.1에서 1 개의 어금니 Tris-HCL의 100 마이크로 리터로 중화하십시오. 먼저, 준비된 LB 및 IPTG X-Gal 플레이트를 사용 전 최소 한 시간 동안 섭씨 37도에서 미리 데우세요.필터 카트리지가 있는 파이펫 팁을 사용하여 LB에서 용액 희석제 100마이크로리터를 준비합니다. 준비된 대장균 배양이 중간 로그 단계에 도달하면 배양 200마이크로리터를 각 용출 희석에 대해 하나씩 살균된 미세원심분리기 튜브로 분배합니다. 감염을 개시하기 위하여는, E.coli 문화를 포함하는 관에 각 희석의 50 마이크로리터를 추가합니다. 소용돌이를 빠르게 하고 실온에서 5분간 배양합니다.그런 다음 코팅 스틱을 사용하여 이 혼합물의 90 마이크로리터로 LB 및 IPTG X-GAL 플레이트를 코팅합니다. 5 분 후, 접시를 반전하고 섭씨 37도에서 하룻밤 을 배양. 플라크가 나타날 때 계산합니다.우선, 250 밀리리터 에를렌마이어 플라스크에서 LB의 20 밀리리터에서 하룻밤 문화를 희석하십시오. 증폭되지 않은 용출물을 추가하고 섭씨 37도에서 4-1/2 시간 동안 격렬한 흔들림을 추가하십시오. 다음으로, 12, 000배, 섭씨 4도에서 10분간 원심분리합니다.상체를 신선한 튜브로 옮기. 원심분리기는 동일한 조건을 사용하여 다시 한 번 펠릿을 폐기합니다. 상류체의 80%를 신선한 튜브로 옮기고 20%의 폴리에틸렌 글리콜과 2.5 개의 어금니 나트륨염화의 1/6 부피에 추가합니다.파지는 섭씨 4도에서 하룻밤 사이에 침전되도록 합니다. 다음 날, 12, 000 배 G와 15 분 동안 섭씨 4도에서 침전 된 파지를 원심 분리합니다. 동일한 조건을 사용하여 상피및 원심분리기를 다시 폐기하십시오.파이펫을 사용하여 잔류 상수체를 제거합니다. TBS의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고 상체를 미세 원심 분리기 튜브로 옮기십시오. 원심분리기는 12, 000배, 섭씨 4도에서 5분간.상체를 신선한 미세 원심 분리기 튜브로 옮기고 20% 폴리에틸렌 글리콜과 2.5 개의 대구어 나트륨을 1/6 부피를 추가하여 다시 침전시합니다. 15~60분 동안 얼음에 배양합니다. 다음으로 원심분리기는 12, 000배, 섭씨 4도에서 10분 간.동일한 조건을 사용하여 상피및 원심분리기를 다시 폐기하십시오. 파이펫을 사용하여 잔류 상수체를 제거합니다. 불순물을 제거하기 위해 추가 분 동안 TBS와 원심 분리기의 200 마이크로 리터에서 펠릿을 다시 중단합니다.그런 다음 상체를 신선한 미세 원심 분리기 튜브로 이송하여 증폭 된 용출을 얻습니다. 본 연구에서는, FGFR2 단백질의 코팅 농도가 점차 감소되는 반면, 파지 입력의 수는 변하지 않고 유지된다. 파지 티터의 결과는 복구 된 파지의 수가 점차 증가하고 3 라운드 후, 첫 번째 라운드의 그것에 비해 65 배 증가가 있음을 시사한다.그런 다음 ITC 실험은 FGFR2에 작은 펩티드의 친화성을 측정하기 위해 실시된다. 결과는 SP1 펩티드가 FGFR2를 향한 높은 친화력을 가지고 있음을 나타낸다. 이 데이터는 스크리닝 프로토콜의 효율성을 보여줍니다.SP1 펩티드의 생물학적 활성을 조사하기 위해, 섬유아세포 증식 분석은 CCK-8 키트를 사용하여 수행된다. BALB/C3T3은 상이한 농도에서 SP1 펩타이드와 함께 배양된다. 결과는 SP1 펩티드가 세포의 성장을 억제한다는 것을 건의합니다.야생 식 파지의 오염은 여기에서 피해야합니다. 에어로졸 내성 파이펫 팁을 사용해야 합니다. 파지 증폭을 얻어 성장 하는 동안.이 절차는 또한 탄수화물, 배양 세포 및 조직에 결합하는 작은 펩티드를 선별하는 데 사용될 수 있습니다. 그 펩티드는 진단 및 표적에 추가 증폭 될 수 있습니다

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

표피 성장 인자를 사용하여 인간의 췌장 암 세포의 유전자 전달 및 Transfection은 다행 기반 엔지니어링된 Nanovectors를 수용체 타겟

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

연구

생체공학

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

전기 화학 센서를 사용하여 세균의 검출 및 식별

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Generation and Recovery of ÃƒÅ½Ã‚Â²-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

단계 성장 PEG-펩타이드 Hydrogels에서 β-세포 Spheroids의 생성 및 복구

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional  microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for  ...

Observing and Quantifying Fibroblast-mediated Fibrin Gel Compaction

섬유아세포 매개 피브린 겔 다짐 관찰 및 정량화

Cells embedded in collagen and fibrin gels attach and exert traction forces on the fibers of the gel. These forces can lead to local and global ...

Electrospinning Growth Factor Releasing Microspheres into Fibrous Scaffolds

섬유 공사장 공중 발판으로 마이크로 스피어를 해제 전기 방사의 성장 인자

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth.  This system incorporates mechanical, topographical, ...

Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

Endosomolytic 시약 dfTAT와 배양 라이브 세포에 단백질, 펩타이드 또는 세포 투과성 작은 ​​분자의 배달

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the ...

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

상호 현미경을 사용하여 본래 세포의 표피 성장 인자 수용체의 화학 양론을 공부

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

A Rapid and Quantitative Fluorimetric Method for Protein-Targeting Small Molecule Drug Screening

단백질 표적 소분자 약물 검사를위한 신속하고 정량적적인 형광 방법

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold ...

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

헤파린 결합 도메인 골 형성 성장 인자 전달을위한 고분자 전해질 복합

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

Initial Evaluation of Antibody-conjugates Modified with Viral-derived Peptides for Increasing Cellular Accumulation and Improving Tumor Targeting

세포 축적을 증가 하 고 종양을 대상으로 개선에 대 한 바이러스 성 파생 된 펩 티 드 항 체 어원이 같은 말의 초기 평가 수정

Antibody-conjugates (ACs) modified with virus-derived peptides are a potentially powerful class of tumor cell delivery agents for molecular payloads used ...