Name: screening and identification of small peptides targeting fibroblast growth factor receptor2 using a phage display peptide library
Uploaded: 2019-09-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Science and Technology program of Guangzhou (nr. 2016201604030039).

1. forberedelse av reagens
<ol><li>LB (lysogeny buljong) medium: oppløse 1 g av tryptone, 0,5 g av gjærekstrakt, og 0,5 g NaCl i 100 mL av H2O. autoklav og oppbevares ved 4 ° c.</li>
	<li>Tetracycline lager: Forbered 20 mg/mL i 1:1 etanol: H2O. lagre ved-20 ° c, og Vortex før bruk.</li>
	<li>IPTH/X-gal løsning: Mix 0,5 g av IPTH (isopropylalkohol β-D-1-thiogalactopyranoside) og 0,4 g av X-gal (5-bromo-4-klor-3-indolyl β-D-galactoside) i 10 mL DMF (dimethyl formamid). Oppløsningen kan oppb...

<ol>
	<li>Eswarakumar, V. P., Lax, I., Schlessinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+signaling+by+fibroblast+growth+factor+receptors.">Cellular signaling by fibroblast growth factor receptors.</a> Cytokine &amp; Growth Factor Reviews. 16 (2), 139-149 (2005).</li><li>Turner, N., Grose, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+signaling:+from+development+to+cancer.">Fibroblast growth factor signaling: from development to cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 10 (2), 116-129 (2010).</li><li>Cancer Genome Atlas Network. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+molecular+portraits+of+human+breast+tumors.">Comprehensive molecular portraits of human breast tumors.</a> Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).</li><li>Matsumoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGFR2+gene+amplification+and+clinicopathological+features+in+gastric+cancer.">FGFR2 gene amplification and clinicopathological features in gastric cancer.</a> British Journal of Cancer. 106 (4), 727-732 (2012).</li><li>Weiss, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequent+and+focal+FGFR1+amplification+associates+with+therapeutically+tractable+FGFR1+dependency+in+squamous+cell+lung+cancer.">Frequent and focal FGFR1 amplification associates with therapeutically tractable FGFR1 dependency in squamous cell lung cancer.</a> Science Translational Medicine. 2 (62), 62ra93 (2010).</li><li>Babina, I. S., Turner, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+challenges+in+targeting+FGFR+signaling+in+cancer.">Advances and challenges in targeting FGFR signaling in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (5), 318-322 (2017).</li><li>Katoh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+receptors+as+treatment+targets+in+clinical+oncology.">Fibroblast growth factor receptors as treatment targets in clinical oncology.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 16 (2), 105-122 (2019).</li><li>Soria, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I/IIa+study+evaluating+the+safety,+efficacy,+pharmacokinetics,+and+pharmacodynamics+of+lucitanib+in+advanced+solid+tumors.">Phase I/IIa study evaluating the safety, efficacy, pharmacokinetics, and pharmacodynamics of lucitanib in advanced solid tumors.</a> Annals of Oncology. 25 (11), 2244-2251 (2014).</li><li>French, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+FGFR4+inhibits+hepatocellular+carcinoma+in+preclinical+mouse+models.">Targeting FGFR4 inhibits hepatocellular carcinoma in preclinical mouse models.</a> PLoS ONE. 7 (5), e36713 (2012).</li><li>Martinez-Torrecuadrada, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+extracellular+domain+of+fibroblast+growth+factor+receptor+3+with+human+single-chain+Fv+antibodies+inhibits+bladder+carcinoma+cell+line+proliferation.">Targeting the extracellular domain of fibroblast growth factor receptor 3 with human single-chain Fv antibodies inhibits bladder carcinoma cell line proliferation.</a> Clinical Cancer Research. 11 (17), 6280-6290 (2005).</li><li>Palamakumbura, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysyl+oxidase+propeptide+inhibits+prostate+cancer+cell+growth+by+mechanisms+that+target+FGF-2-cell+binding+and+signaling.">Lysyl oxidase propeptide inhibits prostate cancer cell growth by mechanisms that target FGF-2-cell binding and signaling.</a> Oncogene. 28 (38), 3390-3400 (2009).</li><li>Ladner, R. C., Sato, A. K., Gorzelany, J., de Souza, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+display-derived+peptides+as+therapeutic+alternatives+to+antibodies.">Phage display-derived peptides as therapeutic alternatives to antibodies.</a> Drug Discovery Today. 9 (12), 525-529 (2004).</li><li>Wu, C. H., Liu, I. J., Lu, R. M., Wu, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancement+and+applications+of+peptide+phage+display+technology+in+biomedical+science.">Advancement and applications of peptide phage display technology in biomedical science.</a> Journal of Biomedical Science. 23, 8 (2016).</li><li>Kay, B. K., Kasanov, J., Yamabhai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+phage-displayed+combinatorial+peptide+libraries.">Screening phage-displayed combinatorial peptide libraries.</a> Methods. 24 (3), 240-246 (2001).</li><li>Rodi, D. J., Makowski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage-display+technology+-+Finding+a+needle+in+a+vast+molecular+haystack.">Phage-display technology - Finding a needle in a vast molecular haystack.</a> Current Opinion in Biotechnology. 10, 87-93 (1999).</li><li>Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+M13+for+phage+display.">Engineering M13 for phage display.</a> Biomolecular Engineering. 18, 57-63 (2002).</li><li>Hamzeh-Mivehroud, M., Mahmoudpour, A., Dastmalchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+new+peptide+ligands+for+epidermal+growth+factor+receptor+using+phage+display+and+computationally+modeling+their+mode+of+binding.">Identification of new peptide ligands for epidermal growth factor receptor using phage display and computationally modeling their mode of binding.</a> Chemical Biology &amp; Drug Design. 79 (3), 246-259 (2012).</li><li>Askoxylakis, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide-based+targeting+of+the+platelet-derived+growth+factor+receptor+beta.">Peptide-based targeting of the platelet-derived growth factor receptor beta.</a> Molecular Imaging and Biology. 15 (2), 212-221 (2013).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transdermal+protein+delivery+by+a+coadministered+peptide+identified+via+phage+display.">Transdermal protein delivery by a coadministered peptide identified via phage display.</a> Nature Biotechnology. 24 (4), 455-460 (2006).</li><li>Azzazy, H. M., Highsmith, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+display+technology:+clinical+applications+and+recent+innovations.">Phage display technology: clinical applications and recent innovations.</a> Clinical Biochemistry. 35, 425-445 (2002).</li><li>Pasqualini, R., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+targeting+In+vivo+using+phage+display+peptide+libraries.">Organ targeting In vivo using phage display peptide libraries.</a> Nature. 380 (6572), 364-366 (1996).</li><li>Liu, R., Li, X., Xiao, W., Lam, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-targeting+peptides+from+combinatorial+libraries.">Tumor-targeting peptides from combinatorial libraries.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 110-111, 13-37 (2017).</li><li>Binetruy-Tournaire, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+peptide+blocking+vascular+endothelial+growth+factor+(VEGF)-mediated+angiogenesis.">Identification of a peptide blocking vascular endothelial growth factor (VEGF)-mediated angiogenesis.</a> The EMBO Journal. 19, 1525-1533 (2000).</li><li>Peng, Y., Zhang, Y., Mitchell, W. J., Zhang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Lipopolysaccharide-Targeted+Peptide+Mimic+Vaccine+against+Q+Fever.">Development of a Lipopolysaccharide-Targeted Peptide Mimic Vaccine against Q Fever.</a> Journal of Immunology. 189, 4909-4920 (2012).</li><li>Lamichhane, T. N., Abeydeera, N. D., Duc, A. C., Cunningham, P. R., Chow, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+Peptides+Targeting+Helix+31+of+Bacterial+16S+Ribosomal+RNA+by+Screening+M13+Phage-Display+Libraries.">Selection of Peptides Targeting Helix 31 of Bacterial 16S Ribosomal RNA by Screening M13 Phage-Display Libraries.</a> Molecules. 16, 1211-1239 (2011).</li><li>Sahin, D., Taflan, S. O., Yartas, G., Ashktorab, H., Smoot, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+Identification+of+Peptides+Specifically+Targeted+to+Gastric+Cancer+Cells+from+a+Phage+Display+Peptide+Library.+Asian+Pacific.">Screening and Identification of Peptides Specifically Targeted to Gastric Cancer Cells from a Phage Display Peptide Library. Asian Pacific.</a> Journal of Cancer Prevention. 19 (4), 927-932 (2018).</li><li>Kelly, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+nanoparticles+for+imaging+incipient+pancreatic+ductal+adenocarcinoma.">Targeted nanoparticles for imaging incipient pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> PLOS Medicine. 5 (4), e85 (2008).</li><li>Sugihara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+pro-apoptotic+peptides+as+potential+therapy+for+peritoneal+endometriosis.">Development of pro-apoptotic peptides as potential therapy for peritoneal endometriosis.</a> Nature Communications. 5, 4478 (2014).</li><li>Rafii, S., Avecilla, S. T., Jin, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+vasculature+address+book:+Identification+of+stage-specific+tumor+vessel+zip+codes+by+phage+display.">Tumor vasculature address book: Identification of stage-specific tumor vessel zip codes by phage display.</a> Cancer Cell. 4, 331-333 (2003).</li><li>Arap, W., Pasqualini, R., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+Treatment+by+Targeted+Drug+Delivery+to+Tumor+Vasculature+in+a+Mouse+Model.">Cancer Treatment by Targeted Drug Delivery to Tumor Vasculature in a Mouse Model.</a> Science. 279, 377-390 (1997).</li></ol>

En Kombinatorisk phage biblioteket er et kraftig og effektivt verktøy for høy gjennomstrømming screening av romanen peptider som kan binde målmolekyler og regulere deres funksjon13. Foreløpig phage display peptid bibliotekene har et bredt spekter av applikasjoner. For eksempel kan de brukes til å velge bioaktive peptider bundet til reseptor proteiner23, ikke-protein mål24,25, sykdom-spesifikke antigen etterli...

Fibroblast vekstfaktor reseptorer (FGFRs) spiller nøkkelroller i celle spredning, sår helbredelse, og angiogenese in vivo1. Avvikende aktivering av FGFR signalering observert i en rekke svulster2,3,4,5 inkluderer gen forsterkning, genmutasjoner, kromosomavvik, og overdreven ligand sekresjon6 . Mange hemmere målretting FGFRs har vist lovende terapeutiske effekter i kliniske studier og er i hovedsak klassifisert i tre typer: (1) små molekyl kinase hemmere, som binder seg til intracellulære domenet til FGFR, (2) motstandere rettet mot ekstracellulære segmentet, og (3) FGF ligand feller6. Selv om flere av de små molekylet kinase hemmere har gode terapeutiske effekter både in vitro og in vivo7, de fleste av dem har dårlig Target spesifisitet og vise bivirkninger som hypertensjon8. Flertallet av motstanderne er monoklonale antistoffer9,10 og polypeptider11. Peptider har fordeler fremfor små molekyler på grunn av spesifisitet og lavere bivirkninger. De har også beholde celle permeabilitet og akkumuleres ikke i bestemte organer i forhold til protein narkotika12. Derfor målrettede små peptider er både effektive og potensielle terapeutiske midler.
Phage display-teknologi er et enkelt, men kraftig verktøy for identifisering av små peptider som kan bindes til et gitt molekyl13,14,15. Vi brukte en phage display peptid bibliotek som er basert på en enkel M13 phage med over 109 forskjellige peptid sekvenser vises på halen for binding til målet molekylet (se tabell over materialer)16. På grunn av phages høye affinitet mot det gitte molekylet, kan ubundet phages vaskes bort, og bare tett bundet phages med de ønskede korte peptider beholdes. De gitte molekylære målene kan være immobilisert proteiner17,18, karbohydrater, kultivert celler, eller til og med uorganiske materialer19,20. En spennende sak ble rapportert der organ-spesifikke peptider ble valgt in vivo ved hjelp av phage display teknologi21. Fordelene med phage skjermteknologi inkluderer høy gjennomstrømning, enkel drift, lave kostnader og et bredt spekter av applikasjoner22.
I denne studien, gir vi en detaljert protokoll for screening små peptider binding til immobilisert protein (FGFR2) ved hjelp av en phage display biblioteket. Effekten av teknologien er også undersøkt ved å måle affinitet av den oppnådde peptid mot FGFR2 av isotermiske titrering Reaksjonskalorimetri (ITC), og den biologiske aktiviteten ved en celle spredning analysen. Metoden kan utvides for screening av små peptider som binder til karbohydrater, kultivert celler, eller til og med uorganiske materialer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m Filter</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MPGP002A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 cm2 Small dish</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>150460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Guangzhou chemical reagent factory</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-96 gIII sequencing primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Synthesis from Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Nest</td>
			<td>701001-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST004D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto-Tryptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>L0037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c 3T3 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-&#173;6587</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Biodragon</td>
			<td>BD-M10110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCK-8 kit</td>
			<td>DOJINDO</td>
			<td>CK04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>sh30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMF</td>
			<td>Newprobe</td>
			<td>PB10247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15576028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2 Protein</td>
			<td>Sino Biological Inc.</td>
			<td>10014-HNAE</td>
			<td>Purity &#62;95%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITC200 system</td>
			<td>MicroCal Omega</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Guangzhou chemical reagent factory</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaI</td>
			<td>Bidepharm</td>
			<td>BD40879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Guangzhou chemical reagent factory</td>
			<td>1310-73-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG&#8211;8000</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2139-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ph.D.-7 phage display peptide library kit</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E8100S</td>
			<td>Containing the Ph.D.-7 phage library, E. coli ER2738 host strain and M13KE control phage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant FGFR2 extracellular domain proteins</td>
			<td>Sino Biological Inc.</td>
			<td>10824-H08H</td>
			<td>Purity &#62; 97%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small peptide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Synthesis from GL Biochem Ltd. (Shanghai, China)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-SHS-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SLF-T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

screening and identification of small peptides targeting fibroblast growth factor receptor2 using a phage display peptide library

Den menneskelige Fibroblast Vekstfaktorreseptor (FGFR) familien består av fire medlemmer, nemlig FGFR1, FGFR2, FGFR3, og FGFR4, som er involvert i ulike biologiske aktiviteter inkludert celle spredning, overlevelse, migrasjon og differensiering. Flere avvik i FGFR signalering veien, på grunn av mutasjoner eller genet forsterkning hendelser, har blitt identifisert i ulike typer kreft. Derfor har nyere forskning fokusert på å utvikle strategier som involverer terapeutisk målretting av FGFRs. nåværende FGFR-hemmere på ulike stadier av pre-klinisk og klinisk utvikling inkluderer enten små molekyl hemmere av tyrosin kinaser eller monoklonale antistoffer, med bare noen få peptid-baserte hemmere i rørledningen. Her gir vi en protokoll som bruker phage skjermteknologi til skjerm små peptider som motstandere av FGFR2. Et kort, et bibliotek med phage-viste peptider ble inkubert i en plate belagt med FGFR2. Deretter ble ubundet phage vasket av av TBST (TBS + 0,1% [v/v] mellom-20), og bundet phage ble eluert med 0,2 M Glycine-HCl buffer (pH 2,2). Den eluert phage ble ytterligere forsterket og brukt som input for neste runde av biopanning. Etter tre runder med biopanning ble peptid sekvenser av individuelle phage kloner identifisert av DNA-sekvensering. Til slutt ble de skjermede peptider syntetisert og analysert for affinitet og biologisk aktivitet.

Få en høy affinitet liten peptid målretting FGFR2.
Til skjermen phages målretting FGFR2, en Ph.D.-7 biblioteket ble brukt i denne studien. En skjematisk fremstilling av arbeidsflyten vises i figur 1. I denne prosessen ble antall phage input (PFU) holdt uendret, mens belegget konsentrasjonen av FGFR2 protein ble redusert gradvis. Resultatene av phage titer antydet at antall gjenopprettede phages økte gradvis, og etter 3 runder, var det en 65-f...

Watch this Scientific Journal Video about Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library at JoVE.com

Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library

Heri presenterer vi en detaljert protokoll for screening av små peptider som binder til FGFR2 ved hjelp av et phage display peptid-bibliotek. Vi analyserer affinitet for de valgte peptider mot FGFR2 in vitro og dens evne til å undertrykke celle spredning.

Screening og identifisering av små peptider målretting Fibroblast vekstfaktor Receptor2 ved hjelp av en Phage display peptid bibliotek

The human Fibroblast Growth Factor Receptor (FGFR) family comprises four members, namely, FGFR1, FGFR2, FGFR3, and FGFR4, that are involved in various ...

Sammenlignet med andre metoder, er denne protokollen lettere å finne ut nye antagonistere, agonisteres og allosteriske modulatorer kvantitativt og kvalitativt uten å vite hydro-fortynningsstrukturen og dannelsen av målproteinet. Denne protokollen er høy effektiv, enkel å håndtere, økonomisk og kommersielt tilgjengelig. Kombiner denne screeningmetoden med høy gjennomstrømning med ITC-analyse, og de funksjonelle små peptidene kan oppnås kvantitativt og kvalitativt.Demonstrere prosedyren vil være Ying Zhao og Qiang Wang, graduate studenter fra vårt laboratorium. For å starte denne prosedyren, forberede en løsning av FGFR2 i belegg buffer med en konsentrasjon på 10 mikrogram per milliliter. Tilsett en milliliter av løsningen til en 35 kvadratcentimeters tallerken og virvle gjentatte ganger til overflaten er helt våt.Inkuber over natten på fire grader Celsius med risting. Neste dag, hell av beleggoppløsningen og tilsett den tilberedte blokkeringsløsningen. Inkuber ved fire grader Celsius i minst en time, kast deretter blokkeringsløsningen og vask platen raskt seks ganger med TBST samtidig som den sørger for at parabolen ikke tørker ut.Rekonstituer det opprinnelige phage biblioteket i en milliliter TBST og legg dette til den bebelagte parabolen. Rock platen forsiktig på en shaker ved romtemperatur i to timer. Etter dette, kast supernatanten og vask parabolen 10 ganger med TBST.Elute den bundne phage ved å legge til en milliliter av 0,2 molar glycine HCL til parabolen og gynge forsiktig ved romtemperatur i 10 minutter. Overfør eluenten til et sterilisert mikrocentrifugerør og nøytraliser den med 100 mikroliter av en molar Tris-HCL ved pH 9.1. Først førvarm forberedt LB og IPTG X-Gal plater på 37 grader Celsius i minst en time før bruk.Bruk pipettespisser med filterpatroner til å klargjøre 100 mikroliter med tidoblet fortynning av eluent i LB. Etter at den forberedte E.coli-kulturen når midtloggfasen, dispenserer 200 mikroliter av kulturen i steriliserte mikrocentrifugerør en for hver eluent fortynning. For å initiere infeksjonen, tilsett 50 mikroliter av hver fortynning til rørene som inneholder E.coli-kulturen. Vortex raskt og inkubere ved romtemperatur i fem minutter.Bruk deretter beleggpinner til å belegge LB- og IPTG X-GAL-platene med 90 mikroliter av denne blandingen. Etter fem minutter, inverter platene og inkuber dem over natten ved 37 grader Celsius. Tell plaketter når de vises.Til å begynne med fortynner du nattkulturen i 20 milliliter LB i en 250 milliliter Erlenmeyer kolbe. Tilsett den uforenklede eluent og inkuber ved 37 grader Celsius med kraftig risting i 4-1/2 timer. Deretter sentrifugerer kulturen på 12,000 ganger G og fire grader Celsius i 10 minutter.Overfør det overnaturlige til et friskt rør. Sentrifuge igjen ved hjelp av de samme forholdene og kast pellet. Overfør de øvre 80% av supernatanten til et friskt rør og legg den til 1/6th volum av 20% polyetylenglykol og 2,5 molar natriumklorid.La phage å utløse over natten ved fire grader Celsius. Neste dag sentrifugerer den utfelte phage på 12,000 ganger G og fire grader Celsius i 15 minutter. Kast den overnaturlige og sentrifugen igjen ved hjelp av de samme forholdene.Bruk en pipette til å fjerne gjenværende supernatant. Resuspend pellet i en milliliter TBS og overføre supernatant til en microcentrifuge tube. Sentrifuge på 12, 000 ganger G og fire grader Celsius i fem minutter.Overfør supernatanten til et friskt mikrocentrifugerør og utfell igjen ved å legge til 1/6th volum på 20% polyetylenglykol og 2,5 molar natriumklorid. Inkuber på is i 15 til 60 minutter. Deretter sentrifuge på 12, 000 ganger G og fire grader Celsius i 10 minutter.Kast den overnaturlige og sentrifugen igjen ved hjelp av de samme forholdene. Bruk en pipette til å fjerne gjenværende supernatant. Resuspend pellet i 200 mikroliter tbs og sentrifuge i et ekstra minutt for å fjerne urenheter.Overfør deretter supernatanten til et friskt mikrocentrifugerør for å oppnå den forsterkede eluenten. I denne studien holdes antall phage input uendret, mens beleggkonsentrasjonen av FGFR2-protein gradvis reduseres. Resultatene av phage titer tyder på at antall gjenvunnet phages gradvis øker og at etter tre runder, er det en 65-ganger økning i forhold til den første runden.Et ITC-eksperiment utføres deretter for å måle affiniteten til det lille peptidet til FGFR2. Resultatene indikerer at SP1 peptid har høy affinitet mot FGFR2. Disse dataene viser effektiviteten til screeningprotokollen.For å undersøke den biologiske aktiviteten til SP1 peptid, utføres en fibroblast spredningsanalyse ved hjelp av et CCK-8-sett. BALB/C3T3 inkuberes med SP1 peptid ved ulike konsentrasjoner. Resultatene tyder på at SP1 peptid undertrykker veksten av cellene.Forurensningen av ville fagmenn må unngås her. Pass på at du bruker aerosolbestandige pipettespisser. Mens vekst ved å få phage forsterkning.Denne prosedyren kan også brukes til screening av små peptider som binder seg til karbohydrater, kulturceller og vev. Disse peptidene kan forsterkes ytterligere over diagnostiske og målrettede

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

Gene Levering og Transfeksjon i Human kreft i bukspyttkjertelen celler ved hjelp av epidermal vekstfaktorreseptor målrettede Gelatin-Based Engineered Nanovectors

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

Bakteriell Detection &amp; Identification hjelp elektrokjemiske sensorer

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Generation and Recovery of ÃƒÅ½Ã‚Â²-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Produksjon og gjenoppretting av β-celle sfæroider Fra Step-vekst PEG-peptid Hydrogeler

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional  microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for  ...

Observing and Quantifying Fibroblast-mediated Fibrin Gel Compaction

Observere og kvantifisere Fibroblast-mediert Fibrin Gel Compaction

Cells embedded in collagen and fibrin gels attach and exert traction forces on the fibers of the gel. These forces can lead to local and global ...

Electrospinning Growth Factor Releasing Microspheres into Fibrous Scaffolds

Electro Growth Factor Releasing Microspheres inn i fibre Stillas

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth.  This system incorporates mechanical, topographical, ...

Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

Levering av proteiner, peptider eller celle-ugjennomtrengelig små molekyler inn i levende celler ved inkubasjon med den Endosomolytic Reagens dfTAT

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the ...

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

Studerer Støkiometrien av epidermal vekstfaktor reseptor i intakte celler bruker korrelative Mikros

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

A Rapid and Quantitative Fluorimetric Method for Protein-Targeting Small Molecule Drug Screening

En rask og kvantitativ fluorimetrisk Metode for Protein-Targeting lite molekyl narkotikaundersøkelser

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold ...

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

Polyelektrolytkompleks for Heparin Binding Domain osteogene Growth Factor Levering

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

Initial Evaluation of Antibody-conjugates Modified with Viral-derived Peptides for Increasing Cellular Accumulation and Improving Tumor Targeting

Innledende vurdering av antistoff-conjugates endret med Viral-avledet peptider for øke mobilnettet akkumulering og forbedre svulst målretting

Antibody-conjugates (ACs) modified with virus-derived peptides are a potentially powerful class of tumor cell delivery agents for molecular payloads used ...