Name: screening and identification of small peptides targeting fibroblast growth factor receptor2 using a phage display peptide library
Uploaded: 2019-09-30T15:00:00
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Este trabalho foi apoiado pelo programa de ciência e tecnologia de Guangzhou (n º 2016201604030039).

1. preparação do reagente
<ol><li>LB (caldo lysogeny) médio: dissolver 1 g de triptona, 0,5 g de extrato de levedura, e 0,5 g de NaCl em 100 mL de H2O. autoclave e armazenar a 4 ° c.</li>
	<li>Estoque de tetraciclina: Prepare 20 mg/mL em 1:1 etanol: H2O. Armazene em-20 ° c, e Vortex antes de usar.</li>
	<li>Solução de IPTG/X-GAL: misture 0,5 g de IPTG (isopropyl β-D-1-tiogalactopyranoside) e 0,4 g de X-GAL (5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactoside) em 10 mL de DMF (dimetil formamida). A...

<ol>
	<li>Eswarakumar, V. P., Lax, I., Schlessinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+signaling+by+fibroblast+growth+factor+receptors.">Cellular signaling by fibroblast growth factor receptors.</a> Cytokine &amp; Growth Factor Reviews. 16 (2), 139-149 (2005).</li><li>Turner, N., Grose, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+signaling:+from+development+to+cancer.">Fibroblast growth factor signaling: from development to cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 10 (2), 116-129 (2010).</li><li>Cancer Genome Atlas Network. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+molecular+portraits+of+human+breast+tumors.">Comprehensive molecular portraits of human breast tumors.</a> Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).</li><li>Matsumoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGFR2+gene+amplification+and+clinicopathological+features+in+gastric+cancer.">FGFR2 gene amplification and clinicopathological features in gastric cancer.</a> British Journal of Cancer. 106 (4), 727-732 (2012).</li><li>Weiss, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequent+and+focal+FGFR1+amplification+associates+with+therapeutically+tractable+FGFR1+dependency+in+squamous+cell+lung+cancer.">Frequent and focal FGFR1 amplification associates with therapeutically tractable FGFR1 dependency in squamous cell lung cancer.</a> Science Translational Medicine. 2 (62), 62ra93 (2010).</li><li>Babina, I. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I/IIa+study+evaluating+the+safety,+efficacy,+pharmacokinetics,+and+pharmacodynamics+of+lucitanib+in+advanced+solid+tumors.">Phase I/IIa study evaluating the safety, efficacy, pharmacokinetics, and pharmacodynamics of lucitanib in advanced solid tumors.</a> Annals of Oncology. 25 (11), 2244-2251 (2014).</li><li>French, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+FGFR4+inhibits+hepatocellular+carcinoma+in+preclinical+mouse+models.">Targeting FGFR4 inhibits hepatocellular carcinoma in preclinical mouse models.</a> PLoS ONE. 7 (5), e36713 (2012).</li><li>Martinez-Torrecuadrada, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+extracellular+domain+of+fibroblast+growth+factor+receptor+3+with+human+single-chain+Fv+antibodies+inhibits+bladder+carcinoma+cell+line+proliferation.">Targeting the extracellular domain of fibroblast growth factor receptor 3 with human single-chain Fv antibodies inhibits bladder carcinoma cell line proliferation.</a> Clinical Cancer Research. 11 (17), 6280-6290 (2005).</li><li>Palamakumbura, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysyl+oxidase+propeptide+inhibits+prostate+cancer+cell+growth+by+mechanisms+that+target+FGF-2-cell+binding+and+signaling.">Lysyl oxidase propeptide inhibits prostate cancer cell growth by mechanisms that target FGF-2-cell binding and signaling.</a> Oncogene. 28 (38), 3390-3400 (2009).</li><li>Ladner, R. C., Sato, A. K., Gorzelany, J., de Souza, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+display-derived+peptides+as+therapeutic+alternatives+to+antibodies.">Phage display-derived peptides as therapeutic alternatives to antibodies.</a> Drug Discovery Today. 9 (12), 525-529 (2004).</li><li>Wu, C. H., Liu, I. J., Lu, R. M., Wu, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancement+and+applications+of+peptide+phage+display+technology+in+biomedical+science.">Advancement and applications of peptide phage display technology in biomedical science.</a> Journal of Biomedical Science. 23, 8 (2016).</li><li>Kay, B. K., Kasanov, J., Yamabhai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+phage-displayed+combinatorial+peptide+libraries.">Screening phage-displayed combinatorial peptide libraries.</a> Methods. 24 (3), 240-246 (2001).</li><li>Rodi, D. J., Makowski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage-display+technology+-+Finding+a+needle+in+a+vast+molecular+haystack.">Phage-display technology - Finding a needle in a vast molecular haystack.</a> Current Opinion in Biotechnology. 10, 87-93 (1999).</li><li>Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+M13+for+phage+display.">Engineering M13 for phage display.</a> Biomolecular Engineering. 18, 57-63 (2002).</li><li>Hamzeh-Mivehroud, M., Mahmoudpour, A., Dastmalchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+new+peptide+ligands+for+epidermal+growth+factor+receptor+using+phage+display+and+computationally+modeling+their+mode+of+binding.">Identification of new peptide ligands for epidermal growth factor receptor using phage display and computationally modeling their mode of binding.</a> Chemical Biology &amp; Drug Design. 79 (3), 246-259 (2012).</li><li>Askoxylakis, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide-based+targeting+of+the+platelet-derived+growth+factor+receptor+beta.">Peptide-based targeting of the platelet-derived growth factor receptor beta.</a> Molecular Imaging and Biology. 15 (2), 212-221 (2013).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transdermal+protein+delivery+by+a+coadministered+peptide+identified+via+phage+display.">Transdermal protein delivery by a coadministered peptide identified via phage display.</a> Nature Biotechnology. 24 (4), 455-460 (2006).</li><li>Azzazy, H. M., Highsmith, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+display+technology:+clinical+applications+and+recent+innovations.">Phage display technology: clinical applications and recent innovations.</a> Clinical Biochemistry. 35, 425-445 (2002).</li><li>Pasqualini, R., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+targeting+In+vivo+using+phage+display+peptide+libraries.">Organ targeting In vivo using phage display peptide libraries.</a> Nature. 380 (6572), 364-366 (1996).</li><li>Liu, R., Li, X., Xiao, W., Lam, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-targeting+peptides+from+combinatorial+libraries.">Tumor-targeting peptides from combinatorial libraries.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 110-111, 13-37 (2017).</li><li>Binetruy-Tournaire, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+peptide+blocking+vascular+endothelial+growth+factor+(VEGF)-mediated+angiogenesis.">Identification of a peptide blocking vascular endothelial growth factor (VEGF)-mediated angiogenesis.</a> The EMBO Journal. 19, 1525-1533 (2000).</li><li>Peng, Y., Zhang, Y., Mitchell, W. J., Zhang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Lipopolysaccharide-Targeted+Peptide+Mimic+Vaccine+against+Q+Fever.">Development of a Lipopolysaccharide-Targeted Peptide Mimic Vaccine against Q Fever.</a> Journal of Immunology. 189, 4909-4920 (2012).</li><li>Lamichhane, T. N., Abeydeera, N. D., Duc, A. C., Cunningham, P. R., Chow, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+Peptides+Targeting+Helix+31+of+Bacterial+16S+Ribosomal+RNA+by+Screening+M13+Phage-Display+Libraries.">Selection of Peptides Targeting Helix 31 of Bacterial 16S Ribosomal RNA by Screening M13 Phage-Display Libraries.</a> Molecules. 16, 1211-1239 (2011).</li><li>Sahin, D., Taflan, S. O., Yartas, G., Ashktorab, H., Smoot, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+Identification+of+Peptides+Specifically+Targeted+to+Gastric+Cancer+Cells+from+a+Phage+Display+Peptide+Library.+Asian+Pacific.">Screening and Identification of Peptides Specifically Targeted to Gastric Cancer Cells from a Phage Display Peptide Library. Asian Pacific.</a> Journal of Cancer Prevention. 19 (4), 927-932 (2018).</li><li>Kelly, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+nanoparticles+for+imaging+incipient+pancreatic+ductal+adenocarcinoma.">Targeted nanoparticles for imaging incipient pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> PLOS Medicine. 5 (4), e85 (2008).</li><li>Sugihara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+pro-apoptotic+peptides+as+potential+therapy+for+peritoneal+endometriosis.">Development of pro-apoptotic peptides as potential therapy for peritoneal endometriosis.</a> Nature Communications. 5, 4478 (2014).</li><li>Rafii, S., Avecilla, S. T., Jin, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+vasculature+address+book:+Identification+of+stage-specific+tumor+vessel+zip+codes+by+phage+display.">Tumor vasculature address book: Identification of stage-specific tumor vessel zip codes by phage display.</a> Cancer Cell. 4, 331-333 (2003).</li><li>Arap, W., Pasqualini, R., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+Treatment+by+Targeted+Drug+Delivery+to+Tumor+Vasculature+in+a+Mouse+Model.">Cancer Treatment by Targeted Drug Delivery to Tumor Vasculature in a Mouse Model.</a> Science. 279, 377-390 (1997).</li></ol>

Uma biblioteca de fago combinatória é uma ferramenta poderosa e eficaz para a seleção da elevado-produção de peptídeos novos que podem ligar moléculas do alvo e regular sua função13. Atualmente, as bibliotecas do peptide do indicador do fago têm uma escala larga das aplicações. Por exemplo, eles podem ser usados para selecionar peptídeos bioativos vinculados a proteínas do receptor23, alvos não proteicos24,<sup class="xref"...

Os receptores do fator de crescimento de fibroblastos (FGFRs) desempenham papéis-chave na proliferação celular, cicatrização de feridas e angiogênese in vivo1. A ativação aberrante da sinalização de FGFR observada em uma variedade de tumores2,3,4,5 inclui amplificação genética, mutações genéticas, aberrações cromossômicas e secreção excessiva de ligante6 . Muitos inibidores que visam o FGFRs mostraram efeitos terapêuticos promissores em ensaios clínicos e são principalmente classificados em três tipos: (1) inibidores da pequena molécula quinase, que se ligam ao domínio intracelular de FGFR, (2) antagonistas que visam a segmento extracelular e (3) armadilhas de ligantes FGF6. Embora diversos dos inibidores pequenos da quinase da molécula tenham bons efeitos terapêuticos in vitro e in vivo7, a maioria deles têm a especificidade pobre do alvo e mostram efeitos adversos tais como a hipertensão8. A maioria dos antagonistas são anticorpos monoclonais9,10 e polipeptídeos11. Peptídeos têm vantagens sobre pequenas moléculas devido à sua especificidade e efeitos colaterais inferiores. Eles também mantêm a permeabilidade celular e não se acumulam em órgãos específicos, em comparação com as drogas proteicas12. Assim, os pequenos peptídeos direcionados são agentes terapêuticos efetivos e prospectivos.
A tecnologia de display phage é uma ferramenta fácil, mas poderosa,para identificar pequenos peptídeos que podem se vincular a uma determinada molécula13,14,15. Nós usamos uma biblioteca do peptide da exposição do fago que seja baseada em um fago simples de M13 com sobre 109 seqüências diferentes do peptide indicadas na cauda para ligar à molécula do alvo (veja a tabela dos materiais)16. Devido à afinidade elevada dos fagos para a molécula dada, os fagos desligados podem ser lavados afastado, e somente os fagos firmemente limitados com os peptídeos curtos desejados são retidos. As metas moleculares dadas podem ser imobilizadas proteínas17,18, carboidratos, células cultivadas, ou até mesmo materiais inorgânicos19,20. Um caso emocionante foi relatado onde os peptídeos órgão-específicos foram selecionados in vivo usando a tecnologia da exposição do fago21. As vantagens da tecnologia da exposição do fago incluem a taxa de transferência elevada, a facilidade de operação, o baixo custo e uma escala larga das aplicações22.
Neste estudo, fornecemos um protocolo detalhado de triagem de peptídeos pequenos que ligam a proteína imobilizada (FGFR2) usando uma biblioteca de exibição de fago. A eficácia da tecnologia é examinada igualmente medindo a afinidade do peptide obtido para FGFR2 pela calorimetria de titulação isothermal (ITC), e pela atividade biológica por um ensaio da proliferação de pilha. O método pode ser estendido para a triagem de pequenos peptídeos que se ligam a carboidratos, células cultivadas, ou até mesmo materiais inorgânicos.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m Filter</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MPGP002A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 cm2 Small dish</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>150460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Guangzhou chemical reagent factory</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-96 gIII sequencing primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Synthesis from Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Nest</td>
			<td>701001-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST004D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto-Tryptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>L0037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c 3T3 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-&#173;6587</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Biodragon</td>
			<td>BD-M10110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCK-8 kit</td>
			<td>DOJINDO</td>
			<td>CK04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>sh30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMF</td>
			<td>Newprobe</td>
			<td>PB10247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15576028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2 Protein</td>
			<td>Sino Biological Inc.</td>
			<td>10014-HNAE</td>
			<td>Purity &#62;95%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITC200 system</td>
			<td>MicroCal Omega</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Guangzhou chemical reagent factory</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaI</td>
			<td>Bidepharm</td>
			<td>BD40879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Guangzhou chemical reagent factory</td>
			<td>1310-73-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG&#8211;8000</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2139-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ph.D.-7 phage display peptide library kit</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E8100S</td>
			<td>Containing the Ph.D.-7 phage library, E. coli ER2738 host strain and M13KE control phage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant FGFR2 extracellular domain proteins</td>
			<td>Sino Biological Inc.</td>
			<td>10824-H08H</td>
			<td>Purity &#62; 97%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small peptide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Synthesis from GL Biochem Ltd. (Shanghai, China)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-SHS-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SLF-T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

screening and identification of small peptides targeting fibroblast growth factor receptor2 using a phage display peptide library

A família humana do receptor do fator de crescimento do fibroblasto (FGFR) compreende quatro membros, a saber, FGFR1, FGFR2, FGFR3, e FGFR4, que são involvidos em várias atividades biológicas que incluem a proliferação, a sobrevivência, a migração e a diferenciação da pilha. Várias aberrações na via de sinalização FGFR, devido a mutações ou eventos de amplificação genética, foram identificadas em vários tipos de cânceres. Assim, pesquisas recentes têm focado no desenvolvimento de estratégias envolvendo direcionamento terapêutico de FGFRs. os inibidores atuais de FGFR em vários estágios de desenvolvimento pré-clínico e clínico incluem inibidores da molécula pequena de tirosina cinases ou anticorpos monoclonais, com apenas alguns inibidores à base de peptídeos no gasoduto. Aqui, fornecemos um protocolo usando a tecnologia de exibição de fago para triagem de pequenos peptídeos como antagonistas de FGFR2. Resumidamente, uma biblioteca de peptídeos exibidos com fago foi incubada em uma placa revestida com FGFR2. Subseqüentemente, o fago não acoplado foi lavado fora por TBST (TBS + 0,1% [v/v] Tween-20), e o fago encadernado foi eluída com tampão de 0,2 M Glycine-HCl (pH 2,2). O fago eluída foi amplificado mais e usado como a entrada para a próxima rodada de biopanning. Depois de três círculos de biopanning, as seqüências do peptide de clones individuais do fago foram identificadas pelo sequenciamento do ADN. Finalmente, os peptídeos selecionados foram sintetizados e analisados quanto à afinidade e atividade biológica.

Obtendo um pequeno peptídeo de alta afinidade visando FGFR2.
Para a tela de fagos visando FGFR2, uma biblioteca de pH.D.-7 foi usada neste estudo. Uma representação esquemática do fluxo de trabalho é mostrada na Figura 1. Neste processo, o número de entrada do fago (PFU) foi mantido inalterado, visto que a concentração de revestimento da proteína FGFR2 foi reduzida gradualmente. Os resultados do Titer do fago sugeriram que o número de fa...

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Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library

Nisto, nós apresentamos um protocolo detalhado para a seleção de peptídeos pequenos que se ligam a FGFR2 usando uma biblioteca de peptídeo de exibição de fago. Nós analisamos mais a afinidade dos peptídeos selecionados em direção a FGFR2 in vitro e sua capacidade de suprimir a proliferação celular.

Triagem e identificação de pequenos peptídeos visando o fator de crescimento de fibroblastos Receptor2 usando uma biblioteca de peptídeos de Phage display

The human Fibroblast Growth Factor Receptor (FGFR) family comprises four members, namely, FGFR1, FGFR2, FGFR3, and FGFR4, that are involved in various ...

Comparado com outros métodos, este protocolo é mais fácil de descobrir novos antagonistas, agonisteres e moduladores alésteres quantitativos e qualitativos sem conhecer a estrutura de diluição e formação da proteína alvo. Este protocolo é de alta eficiência, fácil de manusear, econômico e comercialmente disponível. Combine este método de triagem de alto rendimento com a análise itc, os pequenos peptídeos funcionais podem ser obtidos quantitativamente e qualitativamente.Demonstrando o procedimento estarão Ying Zhao e Qiang Wang, estudantes de pós-graduação do nosso laboratório. Para iniciar este procedimento, prepare uma solução de FGFR2 no tampão de revestimento a uma concentração de 10 microgramas por mililitro. Adicione um mililitro da solução a um prato de 35 centímetros quadrados e gire repetidamente até que a superfície esteja completamente molhada.Incubar durante a noite a quatro graus Celsius com agitação. No dia seguinte, despeje a solução de revestimento e adicione a solução de bloqueio preparada. Incubar a quatro graus Celsius por pelo menos uma hora, depois descartar a solução de bloqueio e lavar rapidamente a placa seis vezes com TBST, certificando-se de que o prato não secar.Reconstitua a biblioteca phage original em um mililitro de TBST e adicione isso ao prato revestido. Balance suavemente a placa em um shaker à temperatura ambiente por duas horas. Depois disso, descarte o supernaspe e lave o prato 10 vezes com TBST.Elute o phage vinculado adicionando um mililitro de 0,2 molar glycine HCL ao prato e balançando suavemente à temperatura ambiente por 10 minutos. Transfira o eluente para um tubo de microcentrifuuge esterilizado e neutralize-o com 100 microliters de um Tris-HCL molar em pH 9.1. Primeiro, pré-aquecimento as placas LB e IPTG X-Gal preparadas a 37 graus Celsius por pelo menos uma hora antes do uso.Usando pontas de pipeta com cartuchos de filtro, prepare 100 microliters de diluições dez vezes do eluente em LB. Depois que a cultura E.coli preparada chegar à fase de tronco médio, dispense 200 microliters da cultura em tubos de microcentrifuuuge esterilizados um para cada diluição eluente. Para iniciar a infecção, adicione 50 microliters de cada diluição aos tubos contendo a cultura E.coli. Vórtice rapidamente e incubar em temperatura ambiente por cinco minutos.Em seguida, use varas de revestimento para revestir as placas LB e IPTG X-GAL com 90 microliters desta mistura. Depois de cinco minutos, inverta as placas e incuba-as durante a noite a 37 graus Celsius. Conte placas quando elas aparecerem.Para começar, diluir a cultura da noite para o dia em 20 mililitros de LB em um frasco de Erlenmeyer de 250 mililitros. Adicione o eluent não amplificado e incubar a 37 graus Celsius com agitação vigorosa por 4-1/2 horas. Em seguida, centrifugar a cultura a 12.000 vezes G e quatro graus Celsius por 10 minutos.Transfira o supernatante para um tubo fresco. Centrifugar novamente usando as mesmas condições e descartar a pelota. Transfira os 80% superiores do supernascer para um tubo fresco e adicione-o ao 1/6º volume de 20% de polietileno glicol e 2,5 cloreto de sódio molar.Deixe o phage precipitar durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, centrifugar o phage precipitado a 12.000 vezes G e quatro graus Celsius por 15 minutos. Descarte o supernatante e a centrífuga novamente usando as mesmas condições.Use uma pipeta para remover o supernatante residual. Resuspenja a pelota em um mililitro de TBS e transfira o supernante para um tubo de microcentrifuge. Centrífuga a 12.000 vezes G e 4 graus Celsius por cinco minutos.Transfira o supernascer para um tubo de microcentrífuga fresco e precipitar novamente adicionando 1/6º volume de 20% de polietileno glicol e 2,5 cloreto de sódio molar. Incubar no gelo por 15 a 60 minutos. Em seguida, centrífuga a 12.000 vezes G e quatro graus Celsius por 10 minutos.Descarte o supernatante e a centrífuga novamente usando as mesmas condições. Use uma pipeta para remover o supernatante residual. Resuspenja a pelota em 200 microlitadores de TBS e centrífuga por mais um minuto para remover impurezas.Em seguida, transfira o supernatante para um tubo de microcentrifuuge fresco para obter o eluent amplificado. Neste estudo, o número de insumos de phage é mantido inalterado, enquanto a concentração de revestimento da proteína FGFR2 é gradualmente reduzida. Os resultados do phage titer sugerem que o número de phages recuperados aumenta gradualmente e que após três rodadas, há um aumento de 65 vezes em relação ao do primeiro turno.Um experimento itc é então conduzido para medir a afinidade do pequeno peptídeo ao FGFR2. Os resultados indicam que o peptídeo SP1 tem alta afinidade com fGFR2. Esses dados demonstram a eficiência do protocolo de triagem.Para investigar a atividade biológica do peptídeo SP1, é realizado um ensaio de proliferação de fibroblastos utilizando-se um kit CCK-8. BALB/C3T3 são incubados com o peptídeo SP1 em diferentes concentrações. Os resultados sugerem que o peptídeo SP1 suprime o crescimento das células.A contaminação por phages do tipo selvagem tem que ser evitada aqui. Certifique-se de usar pontas de pipeta resistentes a aerossóis. Enquanto o crescimento por meio da obtenção de amplificação phage.Este procedimento também pode ser usado na triagem de pequenos peptídeos que se ligam a carboidratos, células culturais e tecidos. Esses peptídeos podem ser mais amplificados sobre o diagnóstico e direcionados

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

Entrega de genes e Transfection em células pancreáticas humanas Cancer usando Fator de Crescimento Epidérmico Receptor-alvo à base de gelatina Nanovectors Engineered

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

Bioengenharia

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

Bacteriana Detecção e Identificação Utilizando sensores eletroquímicos

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Generation and Recovery of ÃƒÅ½Ã‚Â²-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Geração e recuperação de β-esferóides de células a partir do passo de crescimento-PEG-péptido Hidrogéis

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional  microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for  ...

Observing and Quantifying Fibroblast-mediated Fibrin Gel Compaction

Observando e quantificando compactação de gel de fibrina mediada por fibroblasto

Cells embedded in collagen and fibrin gels attach and exert traction forces on the fibers of the gel. These forces can lead to local and global ...

Electrospinning Growth Factor Releasing Microspheres into Fibrous Scaffolds

Electrospinning Fator de Crescimento Releasing Microesferas em fibrosa Andaimes

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth.  This system incorporates mechanical, topographical, ...

Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

Entrega de proteínas, peptídeos ou célula-impermeável Pequenas moléculas em células vivas por incubação com o Endosomolytic Reagente dfTAT

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the ...

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Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

Complexo polielectrólito de ligação à heparina de entrega osteogénica Factor de Crescimento Domínio

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

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Avaliação inicial do anticorpo cojugado modificado com peptídeos virais-derivado para aumentar a acumulação celular e melhorando o direcionamento do Tumor

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