Name: screening and identification of small peptides targeting fibroblast growth factor receptor2 using a phage display peptide library
Uploaded: 2019-09-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library at JoVE.com

Эта работа была поддержана Научно-технической программой Гуанчжоу (No 2016201604030039).

1. Подготовка реагента
<ol><li>LB (лисогенный бульон) средний: Растворите 1 г триптона, 0,5 г дрожжевого экстракта и 0,5 г NaCl в 100 мл H2O. Autoclave и храните при 4 градусах Цельсия.</li>
	<li>Тетрациклин запас: Подготовка 20 мг/мл в 1:1 этанол: H2O. Хранить при -20 градусов по Цельсию, и вихрь перед испол?...

<ol>
	<li>Eswarakumar, V. P., Lax, I., Schlessinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+signaling+by+fibroblast+growth+factor+receptors.">Cellular signaling by fibroblast growth factor receptors.</a> Cytokine &amp; Growth Factor Reviews. 16 (2), 139-149 (2005).</li><li>Turner, N., Grose, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+signaling:+from+development+to+cancer.">Fibroblast growth factor signaling: from development to cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 10 (2), 116-129 (2010).</li><li>Cancer Genome Atlas Network. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+molecular+portraits+of+human+breast+tumors.">Comprehensive molecular portraits of human breast tumors.</a> Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).</li><li>Matsumoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGFR2+gene+amplification+and+clinicopathological+features+in+gastric+cancer.">FGFR2 gene amplification and clinicopathological features in gastric cancer.</a> British Journal of Cancer. 106 (4), 727-732 (2012).</li><li>Weiss, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequent+and+focal+FGFR1+amplification+associates+with+therapeutically+tractable+FGFR1+dependency+in+squamous+cell+lung+cancer.">Frequent and focal FGFR1 amplification associates with therapeutically tractable FGFR1 dependency in squamous cell lung cancer.</a> Science Translational Medicine. 2 (62), 62ra93 (2010).</li><li>Babina, I. S., Turner, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+challenges+in+targeting+FGFR+signaling+in+cancer.">Advances and challenges in targeting FGFR signaling in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (5), 318-322 (2017).</li><li>Katoh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+receptors+as+treatment+targets+in+clinical+oncology.">Fibroblast growth factor receptors as treatment targets in clinical oncology.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 16 (2), 105-122 (2019).</li><li>Soria, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I/IIa+study+evaluating+the+safety,+efficacy,+pharmacokinetics,+and+pharmacodynamics+of+lucitanib+in+advanced+solid+tumors.">Phase I/IIa study evaluating the safety, efficacy, pharmacokinetics, and pharmacodynamics of lucitanib in advanced solid tumors.</a> Annals of Oncology. 25 (11), 2244-2251 (2014).</li><li>French, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+FGFR4+inhibits+hepatocellular+carcinoma+in+preclinical+mouse+models.">Targeting FGFR4 inhibits hepatocellular carcinoma in preclinical mouse models.</a> PLoS ONE. 7 (5), e36713 (2012).</li><li>Martinez-Torrecuadrada, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+extracellular+domain+of+fibroblast+growth+factor+receptor+3+with+human+single-chain+Fv+antibodies+inhibits+bladder+carcinoma+cell+line+proliferation.">Targeting the extracellular domain of fibroblast growth factor receptor 3 with human single-chain Fv antibodies inhibits bladder carcinoma cell line proliferation.</a> Clinical Cancer Research. 11 (17), 6280-6290 (2005).</li><li>Palamakumbura, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysyl+oxidase+propeptide+inhibits+prostate+cancer+cell+growth+by+mechanisms+that+target+FGF-2-cell+binding+and+signaling.">Lysyl oxidase propeptide inhibits prostate cancer cell growth by mechanisms that target FGF-2-cell binding and signaling.</a> Oncogene. 28 (38), 3390-3400 (2009).</li><li>Ladner, R. C., Sato, A. K., Gorzelany, J., de Souza, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+display-derived+peptides+as+therapeutic+alternatives+to+antibodies.">Phage display-derived peptides as therapeutic alternatives to antibodies.</a> Drug Discovery Today. 9 (12), 525-529 (2004).</li><li>Wu, C. H., Liu, I. J., Lu, R. M., Wu, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancement+and+applications+of+peptide+phage+display+technology+in+biomedical+science.">Advancement and applications of peptide phage display technology in biomedical science.</a> Journal of Biomedical Science. 23, 8 (2016).</li><li>Kay, B. K., Kasanov, J., Yamabhai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+phage-displayed+combinatorial+peptide+libraries.">Screening phage-displayed combinatorial peptide libraries.</a> Methods. 24 (3), 240-246 (2001).</li><li>Rodi, D. J., Makowski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage-display+technology+-+Finding+a+needle+in+a+vast+molecular+haystack.">Phage-display technology - Finding a needle in a vast molecular haystack.</a> Current Opinion in Biotechnology. 10, 87-93 (1999).</li><li>Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+M13+for+phage+display.">Engineering M13 for phage display.</a> Biomolecular Engineering. 18, 57-63 (2002).</li><li>Hamzeh-Mivehroud, M., Mahmoudpour, A., Dastmalchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+new+peptide+ligands+for+epidermal+growth+factor+receptor+using+phage+display+and+computationally+modeling+their+mode+of+binding.">Identification of new peptide ligands for epidermal growth factor receptor using phage display and computationally modeling their mode of binding.</a> Chemical Biology &amp; Drug Design. 79 (3), 246-259 (2012).</li><li>Askoxylakis, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide-based+targeting+of+the+platelet-derived+growth+factor+receptor+beta.">Peptide-based targeting of the platelet-derived growth factor receptor beta.</a> Molecular Imaging and Biology. 15 (2), 212-221 (2013).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transdermal+protein+delivery+by+a+coadministered+peptide+identified+via+phage+display.">Transdermal protein delivery by a coadministered peptide identified via phage display.</a> Nature Biotechnology. 24 (4), 455-460 (2006).</li><li>Azzazy, H. M., Highsmith, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+display+technology:+clinical+applications+and+recent+innovations.">Phage display technology: clinical applications and recent innovations.</a> Clinical Biochemistry. 35, 425-445 (2002).</li><li>Pasqualini, R., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+targeting+In+vivo+using+phage+display+peptide+libraries.">Organ targeting In vivo using phage display peptide libraries.</a> Nature. 380 (6572), 364-366 (1996).</li><li>Liu, R., Li, X., Xiao, W., Lam, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-targeting+peptides+from+combinatorial+libraries.">Tumor-targeting peptides from combinatorial libraries.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 110-111, 13-37 (2017).</li><li>Binetruy-Tournaire, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+peptide+blocking+vascular+endothelial+growth+factor+(VEGF)-mediated+angiogenesis.">Identification of a peptide blocking vascular endothelial growth factor (VEGF)-mediated angiogenesis.</a> The EMBO Journal. 19, 1525-1533 (2000).</li><li>Peng, Y., Zhang, Y., Mitchell, W. J., Zhang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Lipopolysaccharide-Targeted+Peptide+Mimic+Vaccine+against+Q+Fever.">Development of a Lipopolysaccharide-Targeted Peptide Mimic Vaccine against Q Fever.</a> Journal of Immunology. 189, 4909-4920 (2012).</li><li>Lamichhane, T. N., Abeydeera, N. D., Duc, A. C., Cunningham, P. R., Chow, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+Peptides+Targeting+Helix+31+of+Bacterial+16S+Ribosomal+RNA+by+Screening+M13+Phage-Display+Libraries.">Selection of Peptides Targeting Helix 31 of Bacterial 16S Ribosomal RNA by Screening M13 Phage-Display Libraries.</a> Molecules. 16, 1211-1239 (2011).</li><li>Sahin, D., Taflan, S. O., Yartas, G., Ashktorab, H., Smoot, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+Identification+of+Peptides+Specifically+Targeted+to+Gastric+Cancer+Cells+from+a+Phage+Display+Peptide+Library.+Asian+Pacific.">Screening and Identification of Peptides Specifically Targeted to Gastric Cancer Cells from a Phage Display Peptide Library. Asian Pacific.</a> Journal of Cancer Prevention. 19 (4), 927-932 (2018).</li><li>Kelly, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+nanoparticles+for+imaging+incipient+pancreatic+ductal+adenocarcinoma.">Targeted nanoparticles for imaging incipient pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> PLOS Medicine. 5 (4), e85 (2008).</li><li>Sugihara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+pro-apoptotic+peptides+as+potential+therapy+for+peritoneal+endometriosis.">Development of pro-apoptotic peptides as potential therapy for peritoneal endometriosis.</a> Nature Communications. 5, 4478 (2014).</li><li>Rafii, S., Avecilla, S. T., Jin, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+vasculature+address+book:+Identification+of+stage-specific+tumor+vessel+zip+codes+by+phage+display.">Tumor vasculature address book: Identification of stage-specific tumor vessel zip codes by phage display.</a> Cancer Cell. 4, 331-333 (2003).</li><li>Arap, W., Pasqualini, R., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+Treatment+by+Targeted+Drug+Delivery+to+Tumor+Vasculature+in+a+Mouse+Model.">Cancer Treatment by Targeted Drug Delivery to Tumor Vasculature in a Mouse Model.</a> Science. 279, 377-390 (1997).</li></ol>

Комбинаторная фагная библиотека является мощным и эффективным инструментом для высокой пропускной связи скрининга новых пептидов, которые могут связывать молекулы мишени и регулировать их функцию13. В настоящее время, фаговык пептид библиотеки имеют широкий спектр приме...

Рецепторы фактора роста фибробластов (FGFRs) играют ключевую роль в пролиферации клеток, заживлении ран и ангиогенезе in vivo1. Аномальная активация FGFR сигнализации наблюдается в различных опухолей2,3,4,5включает в себя усилениегенов, генные мутации, хромосомные аберрации, и чрезмерной лиганд секреции6 . Многие ингибиторы, нацеленные на FGFR, показали многообещающее терапевтическое воздействие в клинических испытаниях и в основном классифицируются на три типа: (1) малые ингибиторы киназы молекулы, которые связываются с внутриклеточной областью FGFR, (2) антагонисты ориентации внеклеточного сегмента, и (3) FGF лиганд ловушки6. Хотя некоторые из небольших ингибиторов киназы молекулы имеют хорошие терапевтические эффекты как in vitro, так и in vivo7,большинство из них имеют плохую целевую специфичность и показывают неблагоприятные эффекты, такие как гипертония8. Большинство антагонистов являются моноклональные антитела9,10 и полипептиды11. Пептиды имеют преимущества перед небольшими молекулами из-за их специфичности и более низких побочных эффектов. Они также сохраняют проницаемость клеток и не накапливаются в определенных органах по сравнению с белковыми препаратами12. Таким образом, целевые небольшие пептиды являются как эффективными, так и перспективными терапевтическими агентами.
Технология отображения фагов является простым, но мощным инструментом для выявления небольших пептидов, которые могут связываться с данной молекулой13,14,15. Мы использовали фаговык пептид библиотеки, которая основана на простой m13 фаг с более чем 109 различных пептидных последовательностей отображается на хвосте для связывания с целевой молекулы (см. Таблица материалов)16. Из-за высокой сродства фагов к данной молекуле, несвязанные фаги могут быть смыты, и сохраняются только плотно связанные фаги с желаемыми короткими пептидами. Данные молекулярные цели могут быть обездвижены белки17,18,углеводы, культивированные клетки, или даже неорганические материалы19,20. Захватывающий случай был зарегистрирован, где орган конкретных пептидов были выбраны in vivo с использованием технологии фагового дисплея21. Преимущества технологии фагового дисплея включают высокую пропускную плату, простоту работы, низкую стоимость и широкий спектр приложений22.
В этом исследовании мы предоставляем подробный протокол скрининга малых пептидов, связывающихся с обездвиженным белком (FGFR2) с помощью библиотеки фагового дисплея. Эффективность технологии также изучена путем измерения сродства полученного пептида к FGFR2 по истермальной калорийности титрации (ITC), и биологической активности путем исследования пролиферации клеток. Метод может быть расширен для скрининга небольших пептидов, которые связываются с углеводами, культивированными клетками или даже неорганическими материалами.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m Filter</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MPGP002A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 cm2 Small dish</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>150460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Guangzhou chemical reagent factory</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-96 gIII sequencing primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Synthesis from Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Nest</td>
			<td>701001-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST004D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto-Tryptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>L0037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c 3T3 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-&#173;6587</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Biodragon</td>
			<td>BD-M10110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCK-8 kit</td>
			<td>DOJINDO</td>
			<td>CK04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>sh30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMF</td>
			<td>Newprobe</td>
			<td>PB10247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15576028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2 Protein</td>
			<td>Sino Biological Inc.</td>
			<td>10014-HNAE</td>
			<td>Purity &#62;95%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITC200 system</td>
			<td>MicroCal Omega</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Guangzhou chemical reagent factory</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaI</td>
			<td>Bidepharm</td>
			<td>BD40879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Guangzhou chemical reagent factory</td>
			<td>1310-73-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG&#8211;8000</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2139-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ph.D.-7 phage display peptide library kit</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E8100S</td>
			<td>Containing the Ph.D.-7 phage library, E. coli ER2738 host strain and M13KE control phage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant FGFR2 extracellular domain proteins</td>
			<td>Sino Biological Inc.</td>
			<td>10824-H08H</td>
			<td>Purity &#62; 97%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small peptide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Synthesis from GL Biochem Ltd. (Shanghai, China)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-SHS-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SLF-T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

screening and identification of small peptides targeting fibroblast growth factor receptor2 using a phage display peptide library

Человеческий рецептор фактора роста (FGFR) состоит из четырех членов, а именно, FGFR1, FGFR2, FGFR3 и FGFR4, которые участвуют в различных биологических деятельности, включая распространение клеток, выживание, миграцию и дифференциацию. Несколько аберраций в сигнальном пути FGFR, из-за мутаций или событий усиления генов, были выявлены в различных типах рака. Таким образом, последние исследования были сосредоточены на разработке стратегий, связанных с терапевтической ориентации FGFR. Текущие ингибиторы FGFR на различных стадиях доклинического и клинического развития включают либо небольшие молекулы ингибиторы тирозина киназы или моноклональных антител, с только несколько пептидных ингибиторов в трубопроводе. Здесь мы предоставляем протокол с использованием технологии фагового дисплея для проверки небольших пептидов в качестве антагонистов FGFR2. Короче говоря, библиотека фаговычных пептидов была инкубирована в тарелку, покрытую FGFR2. Впоследствии несвязанный фаг был смыт TBST (TBS - 0,1% "v/v" Tween-20), а связанный фаг был смыт с буфером 0,2 М глицин-HCl (pH 2.2). Элеттогенный фаг был дополнительно усилен и использован в качестве ввода для следующего раунда биопанирования. После трех раундов биопанирования пептидные последовательности отдельных фаговых клонов были идентифицированы по секвенированию ДНК. Наконец, экранированные пептиды были синтезированы и проанализированы на сродство и биологическую активность.

Получение высокого сродства небольшой пептид ориентации FGFR2.
Для проверки фагов, ориентированных на FGFR2, в этом исследовании была использована библиотека Ph.D.-7. Схематическое представление рабочего процесса показано на рисунке 1. При этом количес...

Watch this Scientific Journal Video about Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library at JoVE.com

Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library

В этом случае мы представляем подробный протокол для скрининга небольших пептидов, которые связываются с FGFR2 с помощью фаговычного дисплея пептидной библиотеки. Мы также анализируем сродство выбранных пептидов к FGFR2 in vitro и его способность подавлять пролиферацию клеток.

Скрининг и идентификация малых пептидов Ориентация Фактор роста Фибробласты Рецептор2 с помощью Phage Дисплей Пептид библиотека

The human Fibroblast Growth Factor Receptor (FGFR) family comprises four members, namely, FGFR1, FGFR2, FGFR3, and FGFR4, that are involved in various ...

По сравнению с другими методами, этот протокол легче найти новые антагонисты, агонистеры и алостерические модуляторы количественно и качественно, не зная гидро-разбавления структуры и формирования целевого белка. Этот протокол является высокоэффективным, простым в обращении, экономичным и коммерчески доступным. Объедините этот метод скрининга высокой пропускной способности с анализом ITC, функциональные небольшие пептиды могут быть получены количественно и качественно.Демонстрацией процедуры будут Инь Чжао и Цян Ван, аспиранты нашей лаборатории. Для начала этой процедуры подготовьте раствор FGFR2 в буфере покрытия с концентрацией 10 микрограмм на миллилитр. Добавьте один миллилитр раствора в блюдо площадью 35 квадратных сантиметров и закружить несколько раз, пока поверхность не будет полностью влажной.Инкубировать на ночь при четырех градусах по Цельсию со тряской. На следующий день слейте раствор покрытия и добавьте подготовленный блокирующий раствор. Инкубировать при четырех градусах по Цельсию, по крайней мере один час, а затем отказаться от блокирующего раствора и быстро мыть пластину шесть раз с TBST, убедившись, что блюдо не высыхает.Восстановить оригинальную фаговую библиотеку в один миллилитр TBST и добавить это в блюдо с покрытием. Аккуратно раскачивайте тарелку на шейкере при комнатной температуре в течение двух часов. После этого отбросьте супернатант и помойте блюдо 10 раз с помощью TBST.Elute связанных фагом, добавив один миллилитр 0,2 молярного глицина HCL к блюду и качания мягко при комнатной температуре в течение 10 минут. Перенесите элуент в стерилизованную трубку микроцентрифуга и нейтрализуните его 100 микролитров одного моляра Tris-HCL при рН 9.1. Во-первых, довоить подготовленные пластины LB и IPTG X-Gal при 37 градусах по Цельсию, по крайней мере за час до использования.Используя наконечники пипеток с фильтром картриджей, приготовьте 100 микролитров десятикратного разбавления элюента в LB. После того, как подготовленная культура E.coli достигнет фазы среднего журнала, раздай 200 микролитров культуры в стерилизованные микроцентрифуговые трубки по одному для каждого разбавления элуента. Чтобы инициировать инфекцию, добавьте 50 микролитров каждого разбавления в трубки, содержащие культуру E.coli. Вихрь быстро и инкубировать при комнатной температуре в течение пяти минут.Затем используйте палочки для покрытия пластин LB и IPTG X-GAL с 90 микролитров этой смеси. Через пять минут переверните пластины и инкубировать их на ночь при 37 градусах по Цельсию. Подсчитайте таблички, когда они появятся.Для начала разбавьте ночную культуру в 20 миллилитров LB в колбе Erlenmeyer весом 250 миллилитров. Добавить неупомяненый элюент и инкубировать при 37 градусах по Цельсию с энергичной тряской в течение 4-1/2 часов. Далее, центрифуга культуры в 12000 раз G и четыре градуса по Цельсию в течение 10 минут.Перенесите супернатант в свежую трубку. Центрифуга снова с использованием тех же условий и отказаться от гранулы. Перенесите верхние 80% супернатанта в свежую трубку и добавьте его в 1/6-й том 20%полиэтиленгликоль и 2,5 молира хлорида натрия.Разрешить фаг осадков на ночь при четырех градусах по Цельсию. На следующий день центрифуга осаждается фагом в 12 000 раз G и 4 градуса по Цельсию в течение 15 минут. Откажитесь от супернатантов и центрифуг снова, используя те же условия.Используйте пипетку, чтобы удалить остаточный супернатант. Повторное производство гранул в один миллилитр TBS и передачи супернатанта в микроцентрифуг трубки. Центрифуга при 12 000 раз G и четыре градуса Цельсия в течение пяти минут.Перенесите супернатант в свежую микроцентрифугную трубку и снова осадите, добавив 1/6-й том 20%полиэтиленгликоль и 2,5 моларного хлорида натрия. Инкубировать на льду в течение 15 до 60 минут. Далее центрифуга при 12 000 раз G и четыре градуса Цельсия в течение 10 минут.Откажитесь от супернатантов и центрифуг снова, используя те же условия. Используйте пипетку, чтобы удалить остаточный супернатант. Повторное производство гранул в 200 микролитров TBS и центрифуги в течение дополнительной минуты, чтобы удалить примеси.Затем перенесите супернатант в свежую трубку микроцентрифуга, чтобы получить усиленный элуент. В этом исследовании количество фагов сохраняется неизменным, в то время как концентрация покрытия белка FGFR2 постепенно снижается. Результаты фагового titer свидетельствуют о том, что количество восстановленных фагов постепенно увеличивается и что после трех раундов, есть 65-кратное увеличение по сравнению с первым раундом.Затем проводится эксперимент ITC для измерения сродства небольшого пептида к FGFR2. Результаты показывают, что пептид SP1 имеет высокое сродство к FGFR2. Эти данные свидетельствуют об эффективности протокола скрининга.Для исследования биологической активности пептида SP1 проводится анализ распространения фибробластов с использованием комплекта CCK-8. BALB/C3T3 инкубируется пептидом SP1 в различных концентрациях. Результаты показывают, что пептид SP1 подавляет рост клеток.Загрязнения дикими фагов следует избегать здесь. Убедитесь в том, чтобы использовать аэрозольные наконечники пипетки. В то время как рост за счет получения фагов усиления.Эта процедура также может быть использована в скрининге небольших пептидов, которые связываются с углеводами, клетками культуры и тканями. Эти пептиды могут быть дальнейшим усилением по диагностическим и целевым

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

Доставка генов и Трансфекция в человеческий рак поджелудочной железы клетки, используя эпидермального фактора роста рецепторов ориентированных Желатин основе Engineered Nanovectors

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

Бактериальные обнаружения и идентификации с использованием электрохимических датчиков

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Generation and Recovery of ÃƒÅ½Ã‚Â²-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Создание и восстановление β-клетки сфероидов Из Шаг рост PEG-пептида Гидрогели

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional  microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for  ...

Observing and Quantifying Fibroblast-mediated Fibrin Gel Compaction

Наблюдение и количественная оценка Фибробластовой Фибрин Гель Компактион

Cells embedded in collagen and fibrin gels attach and exert traction forces on the fibers of the gel. These forces can lead to local and global ...

Electrospinning Growth Factor Releasing Microspheres into Fibrous Scaffolds

Электропрядения фактор роста Освобождение микросфер в волокнистых Строительные леса

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth.  This system incorporates mechanical, topographical, ...

Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

Доставка белки, пептиды или сотовых непроницаемый малых молекул в живых клетках при инкубации с эндосомолитического реагента dfTAT

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the ...

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

Изучение стехиометрии рецептор эпидермального фактора роста в интактных клетках, используя КОРРЕЛЯЦИОННЫМ микроскопия

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

A Rapid and Quantitative Fluorimetric Method for Protein-Targeting Small Molecule Drug Screening

Быстрое и количественный Флуориметрический Метод белка-таргетинга маленькая молекула наркотиками Скрининг

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold ...

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

Полиэлектролита Комплекс для гепаринсвязывающий домена Остеогенная фактор роста Доставка

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

Initial Evaluation of Antibody-conjugates Modified with Viral-derived Peptides for Increasing Cellular Accumulation and Improving Tumor Targeting

Первоначальная оценка антител конъюгаты изменения с пептидами вирусный производные для повышения сотовой накопления и ориентации опухоли

Antibody-conjugates (ACs) modified with virus-derived peptides are a potentially powerful class of tumor cell delivery agents for molecular payloads used ...