Name: screening and identification of small peptides targeting fibroblast growth factor receptor2 using a phage display peptide library
Uploaded: 2019-09-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por el Programa de Ciencia y Tecnología de Guangzhou (No. 2016201604030039).

1. Preparación de reactivos
<ol><li>LB (caldo de lisogenia) medio: Disolver 1 g de triptona, 0,5 g de extracto de levadura y 0,5 g de NaCl en 100 ml de H2O. Autoclave y almacenar a 4 oC.</li>
	<li>Material de tetraciclina: Preparar 20 mg/ml en 1:1 etanol:H2O. Almacenar a -20 oC, y vórtice antes de usar.</li>
	<li>Solución IPTG/X-gal: Mezcla 0,5 g de IPTG (isopropilo-D-1-tiogalactopyranoside) y 0,4 g de X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolyl-D-galactoside) en 10 mL de DMF (dimetil formamida). La soluc...

<ol>
	<li>Eswarakumar, V. P., Lax, I., Schlessinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+signaling+by+fibroblast+growth+factor+receptors.">Cellular signaling by fibroblast growth factor receptors.</a> Cytokine &amp; Growth Factor Reviews. 16 (2), 139-149 (2005).</li><li>Turner, N., Grose, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+signaling:+from+development+to+cancer.">Fibroblast growth factor signaling: from development to cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 10 (2), 116-129 (2010).</li><li>Cancer Genome Atlas Network. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+molecular+portraits+of+human+breast+tumors.">Comprehensive molecular portraits of human breast tumors.</a> Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).</li><li>Matsumoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGFR2+gene+amplification+and+clinicopathological+features+in+gastric+cancer.">FGFR2 gene amplification and clinicopathological features in gastric cancer.</a> British Journal of Cancer. 106 (4), 727-732 (2012).</li><li>Weiss, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequent+and+focal+FGFR1+amplification+associates+with+therapeutically+tractable+FGFR1+dependency+in+squamous+cell+lung+cancer.">Frequent and focal FGFR1 amplification associates with therapeutically tractable FGFR1 dependency in squamous cell lung cancer.</a> Science Translational Medicine. 2 (62), 62ra93 (2010).</li><li>Babina, I. S., Turner, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+challenges+in+targeting+FGFR+signaling+in+cancer.">Advances and challenges in targeting FGFR signaling in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (5), 318-322 (2017).</li><li>Katoh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+receptors+as+treatment+targets+in+clinical+oncology.">Fibroblast growth factor receptors as treatment targets in clinical oncology.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 16 (2), 105-122 (2019).</li><li>Soria, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I/IIa+study+evaluating+the+safety,+efficacy,+pharmacokinetics,+and+pharmacodynamics+of+lucitanib+in+advanced+solid+tumors.">Phase I/IIa study evaluating the safety, efficacy, pharmacokinetics, and pharmacodynamics of lucitanib in advanced solid tumors.</a> Annals of Oncology. 25 (11), 2244-2251 (2014).</li><li>French, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+FGFR4+inhibits+hepatocellular+carcinoma+in+preclinical+mouse+models.">Targeting FGFR4 inhibits hepatocellular carcinoma in preclinical mouse models.</a> PLoS ONE. 7 (5), e36713 (2012).</li><li>Martinez-Torrecuadrada, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+extracellular+domain+of+fibroblast+growth+factor+receptor+3+with+human+single-chain+Fv+antibodies+inhibits+bladder+carcinoma+cell+line+proliferation.">Targeting the extracellular domain of fibroblast growth factor receptor 3 with human single-chain Fv antibodies inhibits bladder carcinoma cell line proliferation.</a> Clinical Cancer Research. 11 (17), 6280-6290 (2005).</li><li>Palamakumbura, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysyl+oxidase+propeptide+inhibits+prostate+cancer+cell+growth+by+mechanisms+that+target+FGF-2-cell+binding+and+signaling.">Lysyl oxidase propeptide inhibits prostate cancer cell growth by mechanisms that target FGF-2-cell binding and signaling.</a> Oncogene. 28 (38), 3390-3400 (2009).</li><li>Ladner, R. C., Sato, A. K., Gorzelany, J., de Souza, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+display-derived+peptides+as+therapeutic+alternatives+to+antibodies.">Phage display-derived peptides as therapeutic alternatives to antibodies.</a> Drug Discovery Today. 9 (12), 525-529 (2004).</li><li>Wu, C. H., Liu, I. J., Lu, R. M., Wu, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancement+and+applications+of+peptide+phage+display+technology+in+biomedical+science.">Advancement and applications of peptide phage display technology in biomedical science.</a> Journal of Biomedical Science. 23, 8 (2016).</li><li>Kay, B. K., Kasanov, J., Yamabhai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+phage-displayed+combinatorial+peptide+libraries.">Screening phage-displayed combinatorial peptide libraries.</a> Methods. 24 (3), 240-246 (2001).</li><li>Rodi, D. J., Makowski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage-display+technology+-+Finding+a+needle+in+a+vast+molecular+haystack.">Phage-display technology - Finding a needle in a vast molecular haystack.</a> Current Opinion in Biotechnology. 10, 87-93 (1999).</li><li>Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+M13+for+phage+display.">Engineering M13 for phage display.</a> Biomolecular Engineering. 18, 57-63 (2002).</li><li>Hamzeh-Mivehroud, M., Mahmoudpour, A., Dastmalchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+new+peptide+ligands+for+epidermal+growth+factor+receptor+using+phage+display+and+computationally+modeling+their+mode+of+binding.">Identification of new peptide ligands for epidermal growth factor receptor using phage display and computationally modeling their mode of binding.</a> Chemical Biology &amp; Drug Design. 79 (3), 246-259 (2012).</li><li>Askoxylakis, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide-based+targeting+of+the+platelet-derived+growth+factor+receptor+beta.">Peptide-based targeting of the platelet-derived growth factor receptor beta.</a> Molecular Imaging and Biology. 15 (2), 212-221 (2013).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transdermal+protein+delivery+by+a+coadministered+peptide+identified+via+phage+display.">Transdermal protein delivery by a coadministered peptide identified via phage display.</a> Nature Biotechnology. 24 (4), 455-460 (2006).</li><li>Azzazy, H. M., Highsmith, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+display+technology:+clinical+applications+and+recent+innovations.">Phage display technology: clinical applications and recent innovations.</a> Clinical Biochemistry. 35, 425-445 (2002).</li><li>Pasqualini, R., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+targeting+In+vivo+using+phage+display+peptide+libraries.">Organ targeting In vivo using phage display peptide libraries.</a> Nature. 380 (6572), 364-366 (1996).</li><li>Liu, R., Li, X., Xiao, W., Lam, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-targeting+peptides+from+combinatorial+libraries.">Tumor-targeting peptides from combinatorial libraries.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 110-111, 13-37 (2017).</li><li>Binetruy-Tournaire, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+peptide+blocking+vascular+endothelial+growth+factor+(VEGF)-mediated+angiogenesis.">Identification of a peptide blocking vascular endothelial growth factor (VEGF)-mediated angiogenesis.</a> The EMBO Journal. 19, 1525-1533 (2000).</li><li>Peng, Y., Zhang, Y., Mitchell, W. J., Zhang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Lipopolysaccharide-Targeted+Peptide+Mimic+Vaccine+against+Q+Fever.">Development of a Lipopolysaccharide-Targeted Peptide Mimic Vaccine against Q Fever.</a> Journal of Immunology. 189, 4909-4920 (2012).</li><li>Lamichhane, T. N., Abeydeera, N. D., Duc, A. C., Cunningham, P. R., Chow, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+Peptides+Targeting+Helix+31+of+Bacterial+16S+Ribosomal+RNA+by+Screening+M13+Phage-Display+Libraries.">Selection of Peptides Targeting Helix 31 of Bacterial 16S Ribosomal RNA by Screening M13 Phage-Display Libraries.</a> Molecules. 16, 1211-1239 (2011).</li><li>Sahin, D., Taflan, S. O., Yartas, G., Ashktorab, H., Smoot, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+Identification+of+Peptides+Specifically+Targeted+to+Gastric+Cancer+Cells+from+a+Phage+Display+Peptide+Library.+Asian+Pacific.">Screening and Identification of Peptides Specifically Targeted to Gastric Cancer Cells from a Phage Display Peptide Library. Asian Pacific.</a> Journal of Cancer Prevention. 19 (4), 927-932 (2018).</li><li>Kelly, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+nanoparticles+for+imaging+incipient+pancreatic+ductal+adenocarcinoma.">Targeted nanoparticles for imaging incipient pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> PLOS Medicine. 5 (4), e85 (2008).</li><li>Sugihara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+pro-apoptotic+peptides+as+potential+therapy+for+peritoneal+endometriosis.">Development of pro-apoptotic peptides as potential therapy for peritoneal endometriosis.</a> Nature Communications. 5, 4478 (2014).</li><li>Rafii, S., Avecilla, S. T., Jin, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+vasculature+address+book:+Identification+of+stage-specific+tumor+vessel+zip+codes+by+phage+display.">Tumor vasculature address book: Identification of stage-specific tumor vessel zip codes by phage display.</a> Cancer Cell. 4, 331-333 (2003).</li><li>Arap, W., Pasqualini, R., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+Treatment+by+Targeted+Drug+Delivery+to+Tumor+Vasculature+in+a+Mouse+Model.">Cancer Treatment by Targeted Drug Delivery to Tumor Vasculature in a Mouse Model.</a> Science. 279, 377-390 (1997).</li></ol>

Una biblioteca combinatorial de fagos es una herramienta poderosa y eficaz para el cribado de alto rendimiento de péptidos novedosos que pueden unir moléculas diana y regular su función13. Actualmente, las bibliotecas de péptidos de pantalla de fago tienen una amplia gama de aplicaciones. Por ejemplo, se pueden utilizar para seleccionar péptidos bioactivos unidos a proteínas receptoras23, objetivos no proteicos24,25...

Los receptores del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR) desempeñan un papel clave en la proliferación celular, la cicatrización de heridas y la angiogénesis in vivo1. Activación aberrante de señalización FGFR observada en una variedad de tumores2,3,4,5 incluye amplificación de genes, mutaciones genéticas, aberraciones cromosómicas, y secreción excesiva de ligando6 . Muchos inhibidores dirigidos a los FFRBR han demostrado efectos terapéuticos prometedores en ensayos clínicos y se clasifican principalmente en tres tipos: (1) inhibidores de la quinasa de moléculas pequeñas, que se unen al dominio intracelular de FGFR, (2) antagonistas dirigidos a los segmento extracelular, y (3) ligando según el FGF6. Aunque varios de los inhibidores de la quinasa de moléculas pequeñas tienen buenos efectos terapéuticos tanto in vitro como in vivo7, la mayoría de ellos tienen mala especificidad objetivo y muestran efectos adversos como la hipertensión8. La mayoría de los antagonistas son anticuerpos monoclonales9,10 y polipéptidos11. Los péptidos tienen ventajas sobre moléculas pequeñas debido a su especificidad y efectos secundarios más bajos. También conservan la permeabilidad celular y no se acumulan en órganos específicos en comparación con los fármacos proteicos12. Por lo tanto, los péptidos pequeños dirigidos son agentes terapéuticos eficaces y prospectivos.
La tecnología de visualización Phage es una herramienta fácil pero poderosa para identificar pequeños péptidos que pueden unirse a una moléculadada 13,14,15. Utilizamos una biblioteca de péptidos de exhibición de fago que se basa en un simple fago M13 con más de 109 secuencias de péptidos diferentes que se muestran en la cola para la unión a la molécula objetivo (ver Tabla de Materiales)16. Debido a la alta afinidad de los fagos hacia la molécula dada, los fagos no unidos se pueden lavar, y sólo se conservan los fagos estrechamente unidos con los péptidos cortos deseados. Las dianas moleculares dadas pueden ser proteínas inmovilizadas17,18, carbohidratos, células cultivadas, o incluso materiales inorgánicos19,20. Se informó de un caso emocionante en el que se seleccionaron péptidos específicos de órganos in vivo utilizando la tecnología de visualización defagos 21. Las ventajas de la tecnología de visualización de fago sin embargo incluyen alto rendimiento, facilidad de operación, bajo costo y una amplia gama de aplicaciones22.
En este estudio, proporcionamos un protocolo detallado de cribado de pequeños péptidos que se unen a la proteína inmovilizada (FGFR2) utilizando una biblioteca de visualización de fagos. La eficacia de la tecnología también se examina midiendo la afinidad del péptido obtenido hacia FGFR2 por Calorimetría de valoración isotérmica (ITC), y la actividad biológica mediante un ensayo de proliferación celular. El método puede extenderse para el cribado de pequeños péptidos que se unen a carbohidratos, células cultivadas, o incluso materiales inorgánicos.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m Filter</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MPGP002A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 cm2 Small dish</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>150460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Guangzhou chemical reagent factory</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-96 gIII sequencing primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Synthesis from Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Nest</td>
			<td>701001-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST004D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto-Tryptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>L0037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c 3T3 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-&#173;6587</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Biodragon</td>
			<td>BD-M10110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCK-8 kit</td>
			<td>DOJINDO</td>
			<td>CK04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>sh30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMF</td>
			<td>Newprobe</td>
			<td>PB10247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15576028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2 Protein</td>
			<td>Sino Biological Inc.</td>
			<td>10014-HNAE</td>
			<td>Purity &#62;95%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITC200 system</td>
			<td>MicroCal Omega</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Guangzhou chemical reagent factory</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaI</td>
			<td>Bidepharm</td>
			<td>BD40879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Guangzhou chemical reagent factory</td>
			<td>1310-73-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG&#8211;8000</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2139-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ph.D.-7 phage display peptide library kit</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E8100S</td>
			<td>Containing the Ph.D.-7 phage library, E. coli ER2738 host strain and M13KE control phage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant FGFR2 extracellular domain proteins</td>
			<td>Sino Biological Inc.</td>
			<td>10824-H08H</td>
			<td>Purity &#62; 97%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small peptide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Synthesis from GL Biochem Ltd. (Shanghai, China)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-SHS-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SLF-T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

screening and identification of small peptides targeting fibroblast growth factor receptor2 using a phage display peptide library

La familia humana Detensíto de Factor de Crecimiento de Fibroblastos (FGFR) está compuesta por cuatro miembros, a saber, FGFR1, FGFR2, FGFR3 y FGFR4, que participan en diversas actividades biológicas, incluyendo la proliferación celular, supervivencia, migración y diferenciación. Se han identificado varias aberraciones en la vía de señalización FGFR, debido a mutaciones o eventos de amplificación de genes, en varios tipos de cáncer. Por lo tanto, investigaciones recientes se han centrado en el desarrollo de estrategias que implican la focalización terapéutica de FFRRs. Inhibidores actuales de FGFR en varias etapas del desarrollo preclínico y clínico incluyen inhibidores de moléculas pequeñas de tirosina quinasas o anticuerpos monoclonales, con sólo unos pocos inhibidores a base de péptidos en la tubería. Aquí, proporcionamos un protocolo que utiliza la tecnología de visualización de fagos para detectar pequeños péptidos como antagonistas de FGFR2. Brevemente, se incubaba una biblioteca de péptidos expuestos con fago sin fago en una placa recubierta de FGFR2. Posteriormente, TBST (TBS + 0.1% [v/v] Tween-20 se laupagó el fago no unido y eluyó con un tampón de 0,2 M de glicina-HCl (pH 2.2). El fago eludado se amplificabó aún más y se utilizó como entrada para la siguiente ronda de biopanning. Después de tres rondas de bioparlante, las secuencias de péptidos de clones individuales de fago fueron identificadas por secuenciación del ADN. Finalmente, los péptidos examinados fueron sintetizados y analizados para la afinidad y la actividad biológica.

Obtención de un pequeño péptido de alta afinidad dirigido a FGFR2.
Para detectar fagos dirigidos a FGFR2, se utilizó una biblioteca Ph.D.-7 en este estudio. En la Figura 1se muestra una representación esquemática del flujo de trabajo. En este proceso, el número de entrada de fago (PFU) se mantuvo sin cambios, mientras que la concentración de recubrimiento de la proteína FGFR2 se redujo gradualmente. Los resultados del phage titer sugirier...

Watch this Scientific Journal Video about Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library at JoVE.com

Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library

En este documento, presentamos un protocolo detallado para la detección de pequeños péptidos que se unen a FGFR2 utilizando una biblioteca de péptidos de visualización de fagos. Analizamos más a fondo la afinidad de los péptidos seleccionados hacia FGFR2 in vitro y su capacidad para suprimir la proliferación celular.

Detección e identificación de pequeños péptidos dirigidos al receptor de factor de crecimiento de fibroblastos2 utilizando una biblioteca de péptidos de pantalla de fago

The human Fibroblast Growth Factor Receptor (FGFR) family comprises four members, namely, FGFR1, FGFR2, FGFR3, and FGFR4, that are involved in various ...

En comparación con otros métodos, este protocolo es más fácil de encontrar nuevos antagonistas, agonisteres y moduladores alotéricos cuantitativa y cualitativamente sin conocer la estructura hidro-dilución y la formación de la proteína diana. Este protocolo es altamente eficiente, fácil de manejar, económico y disponible comercialmente. Combinando este método de cribado de alto rendimiento con el análisis ITC, los pequeños péptidos funcionales se pueden obtener cuantitativa y cualitativamente.Demostrando el procedimiento serán Ying Zhao y Qiang Wang, estudiantes graduados de nuestro laboratorio. Para comenzar este procedimiento, prepare una solución de FGFR2 en tampón de recubrimiento a una concentración de 10 microgramos por mililitro. Añadir un mililitro de la solución a un plato de 35 centímetros cuadrados y girar repetidamente hasta que la superficie esté completamente húmeda.Incubar durante la noche a cuatro grados centígrados con temblores. Al día siguiente, vierta la solución de recubrimiento y agregue la solución de bloqueo preparada. Incubar a cuatro grados centígrados durante al menos una hora, luego desechar la solución de bloqueo y lavar rápidamente la placa seis veces con TBST mientras se asegura de que el plato no se seque.Reconstituir la biblioteca de fagos original en un mililitro de TBST y añadir esto al plato recubierto. Mece suavemente el plato en una coctelera a temperatura ambiente durante dos horas. Después de esto, deseche el sobrenadante y lave el plato 10 veces con TBST.Eluda el fago ligado añadiendo un mililitro de 0,2 molar glicina HCL al plato y balanceándose suavemente a temperatura ambiente durante 10 minutos. Transfiera el eluyente a un tubo de microcentrífuga esterilizado y neutralícelo con 100 microlitros de un Molar Tris-HCL a pH 9.1. En primer lugar, precalienta las placas PREPARADAs LB e IPTG X-Gal a 37 grados Celsius durante al menos una hora antes de su uso.Usando puntas de pipeta con cartuchos de filtro, prepare 100 microlitros de diluciones diez veces del eluyente en LB. Después de que el cultivo de E.coli preparado alcance la fase de registro medio, dispensar 200 microlitros del cultivo en tubos de microcentrífuga esterilizado uno para cada dilución eluente. Para iniciar la infección, añadir 50 microlitros de cada dilución a los tubos que contienen el cultivo de E.coli. Vortex rápidamente e incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos.A continuación, utilice varillas de recubrimiento para recubrir las placas LB e IPTG X-GAL con 90 microlitros de esta mezcla. Después de cinco minutos, invierta las placas e incubarlas durante la noche a 37 grados centígrados. Cuente las placas cuando aparezcan.Para empezar, diluir el cultivo nocturno en 20 mililitros de LB en un matraz Erlenmeyer de 250 mililitros. Añadir el eluyente no amplificado e incubar a 37 grados Celsius con agitación vigorosa durante 4-1/2 horas. A continuación, centrifugar la cultura a 12.000 veces G y cuatro grados centígrados durante 10 minutos.Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo. Centrifugar de nuevo utilizando las mismas condiciones y deseche el pellet. Transfiera el 80% superior del sobrenadante a un tubo fresco y agréguelo a 1/6o volumen de 20% polietilenglicol y 2,5 molar de cloruro sódico.Deje que el fago se precipite durante la noche a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, centrifugar el fago precipitado a 12.000 veces G y cuatro grados centígrados durante 15 minutos. Deseche el sobrenadante y la centrífuga de nuevo utilizando las mismas condiciones.Utilice una pipeta para eliminar el sobrenadante residual. Resuspender el pellet en un mililitro de TBS y transferir el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga. Centrifugar a 12.000 veces G y cuatro grados centígrados durante cinco minutos.Transfiera el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga fresco y precipite de nuevo añadiendo 1/6o volumen de 20% polietilenglicol y 2,5 molar de cloruro sódico. Incubar sobre hielo durante 15 a 60 minutos. A continuación, centrifugar a 12.000 veces G y cuatro grados centígrados durante 10 minutos.Deseche el sobrenadante y la centrífuga de nuevo utilizando las mismas condiciones. Utilice una pipeta para eliminar el sobrenadante residual. Resuspender el pellet en 200 microlitros de TBS y centrífuga durante un minuto adicional para eliminar las impurezas.A continuación, transfiera el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga fresco para obtener el eluyente amplificado. En este estudio, el número de aportes de fagos se mantiene sin cambios, mientras que la concentración de recubrimiento de la proteína FGFR2 se reduce gradualmente. Los resultados del título de fagos sugieren que el número de fagos recuperados aumenta gradualmente y que después de tres rondas, hay un aumento de 65 veces en comparación con el de la primera ronda.A continuación, se lleva a cabo un experimento de ITC para medir la afinidad del péptido pequeño con FGFR2. Los resultados indican que el péptido SP1 tiene una alta afinidad hacia FGFR2. Estos datos demuestran la eficacia del protocolo de cribado.Para investigar la actividad biológica del péptido SP1, se realiza un ensayo de proliferación de fibroblastos utilizando un kit CCK-8. BALB/C3T3 se incuban con el péptido SP1 a diferentes concentraciones. Los resultados sugieren que el péptido SP1 suprime el crecimiento de las células.La contaminación por fagos de tipo salvaje tiene que evitarse aquí. Asegúrese de utilizar puntas de pipeta resistentes a aerosoles. Mientras que el crecimiento mediante la obtención de amplificación de fagos.Este procedimiento también se puede utilizar en la detección de pequeños péptidos que se unen a los carbohidratos, células de cultivo y tejidos. Esos péptidos pueden ser más amplificados sobre el diagnóstico y

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

Entrega y transfección de genes en células humanas de cáncer de páncreas con factor de crecimiento epidérmico receptor dirigidos a base de gelatina Nanovectors Ingeniería

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

Investigación

Bioingeniería

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

Bacterial Detección e Identificación Usando sensores electroquímicos

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Generation and Recovery of ÃƒÅ½Ã‚Â²-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Generación y Recuperación de β-células esferoides de PEG-péptido de crecimiento Paso hidrogeles

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional  microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for  ...

Observing and Quantifying Fibroblast-mediated Fibrin Gel Compaction

Observación Y Cuantificación De Fibroblastos Mediada Por Fibrina Gel Compactamiento

Cells embedded in collagen and fibrin gels attach and exert traction forces on the fibers of the gel. These forces can lead to local and global ...

Electrospinning Growth Factor Releasing Microspheres into Fibrous Scaffolds

Factor de Crecimiento de electrospinning Liberar microesferas en Fibrosa andamios

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth.  This system incorporates mechanical, topographical, ...

Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

La entrega de proteínas, péptidos o impermeable a las células pequeñas moléculas en células vivas por incubación con el reactivo endosomolítico dfTAT

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the ...

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

El estudio de la estequiometría de factor de crecimiento epidérmico en células intactas utilizando microscopía correlativa

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

A Rapid and Quantitative Fluorimetric Method for Protein-Targeting Small Molecule Drug Screening

Una rápida y cuantitativa método fluorimétrico para la proteína-Targeting Pequeña Molécula De Drogas

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold ...

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

Complejo de polielectrolito para la unión a heparina de entrega osteogénico Factor de Crecimiento de dominio

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

Initial Evaluation of Antibody-conjugates Modified with Viral-derived Peptides for Increasing Cellular Accumulation and Improving Tumor Targeting

Evaluación inicial de los conjugados de anticuerpos modificados con péptidos virales derivados para aumentar la acumulación celular y mejorar Tumor Targeting

Antibody-conjugates (ACs) modified with virus-derived peptides are a potentially powerful class of tumor cell delivery agents for molecular payloads used ...