Name: screening and identification of small peptides targeting fibroblast growth factor receptor2 using a phage display peptide library
Uploaded: 2019-09-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library at JoVE.com

Detta arbete stöddes av det vetenskapliga och tekniska programmet i Guangzhou (nr 2016201604030039).

1. beredning av reagens
<ol><li>LB (lysogeny buljong) medel: Lös upp 1 g Tryptone, 0,5 g jästextrakt, och 0,5 g NaCl i 100 mL av H2O. autoklav och förvara vid 4 ° c.</li>
	<li>Tetracyklin lager: Förbered 20 mg/mL i 1:1 etanol: H2O. Förvara vid-20 ° c, och Vortex före användning.</li>
	<li>IPTG/X-gal lösning: Blanda 0,5 g IPTG (isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) och 0,4 g X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactosid) i 10 mL DMF (dimetylformamid). Lösningen kan förvaras vid-20...

<ol>
	<li>Eswarakumar, V. P., Lax, I., Schlessinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+signaling+by+fibroblast+growth+factor+receptors.">Cellular signaling by fibroblast growth factor receptors.</a> Cytokine &amp; Growth Factor Reviews. 16 (2), 139-149 (2005).</li><li>Turner, N., Grose, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+signaling:+from+development+to+cancer.">Fibroblast growth factor signaling: from development to cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 10 (2), 116-129 (2010).</li><li>Cancer Genome Atlas Network. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+molecular+portraits+of+human+breast+tumors.">Comprehensive molecular portraits of human breast tumors.</a> Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).</li><li>Matsumoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGFR2+gene+amplification+and+clinicopathological+features+in+gastric+cancer.">FGFR2 gene amplification and clinicopathological features in gastric cancer.</a> British Journal of Cancer. 106 (4), 727-732 (2012).</li><li>Weiss, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequent+and+focal+FGFR1+amplification+associates+with+therapeutically+tractable+FGFR1+dependency+in+squamous+cell+lung+cancer.">Frequent and focal FGFR1 amplification associates with therapeutically tractable FGFR1 dependency in squamous cell lung cancer.</a> Science Translational Medicine. 2 (62), 62ra93 (2010).</li><li>Babina, I. S., Turner, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+challenges+in+targeting+FGFR+signaling+in+cancer.">Advances and challenges in targeting FGFR signaling in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (5), 318-322 (2017).</li><li>Katoh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+receptors+as+treatment+targets+in+clinical+oncology.">Fibroblast growth factor receptors as treatment targets in clinical oncology.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 16 (2), 105-122 (2019).</li><li>Soria, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I/IIa+study+evaluating+the+safety,+efficacy,+pharmacokinetics,+and+pharmacodynamics+of+lucitanib+in+advanced+solid+tumors.">Phase I/IIa study evaluating the safety, efficacy, pharmacokinetics, and pharmacodynamics of lucitanib in advanced solid tumors.</a> Annals of Oncology. 25 (11), 2244-2251 (2014).</li><li>French, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+FGFR4+inhibits+hepatocellular+carcinoma+in+preclinical+mouse+models.">Targeting FGFR4 inhibits hepatocellular carcinoma in preclinical mouse models.</a> PLoS ONE. 7 (5), e36713 (2012).</li><li>Martinez-Torrecuadrada, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+extracellular+domain+of+fibroblast+growth+factor+receptor+3+with+human+single-chain+Fv+antibodies+inhibits+bladder+carcinoma+cell+line+proliferation.">Targeting the extracellular domain of fibroblast growth factor receptor 3 with human single-chain Fv antibodies inhibits bladder carcinoma cell line proliferation.</a> Clinical Cancer Research. 11 (17), 6280-6290 (2005).</li><li>Palamakumbura, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysyl+oxidase+propeptide+inhibits+prostate+cancer+cell+growth+by+mechanisms+that+target+FGF-2-cell+binding+and+signaling.">Lysyl oxidase propeptide inhibits prostate cancer cell growth by mechanisms that target FGF-2-cell binding and signaling.</a> Oncogene. 28 (38), 3390-3400 (2009).</li><li>Ladner, R. C., Sato, A. K., Gorzelany, J., de Souza, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+display-derived+peptides+as+therapeutic+alternatives+to+antibodies.">Phage display-derived peptides as therapeutic alternatives to antibodies.</a> Drug Discovery Today. 9 (12), 525-529 (2004).</li><li>Wu, C. H., Liu, I. J., Lu, R. M., Wu, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancement+and+applications+of+peptide+phage+display+technology+in+biomedical+science.">Advancement and applications of peptide phage display technology in biomedical science.</a> Journal of Biomedical Science. 23, 8 (2016).</li><li>Kay, B. K., Kasanov, J., Yamabhai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+phage-displayed+combinatorial+peptide+libraries.">Screening phage-displayed combinatorial peptide libraries.</a> Methods. 24 (3), 240-246 (2001).</li><li>Rodi, D. J., Makowski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage-display+technology+-+Finding+a+needle+in+a+vast+molecular+haystack.">Phage-display technology - Finding a needle in a vast molecular haystack.</a> Current Opinion in Biotechnology. 10, 87-93 (1999).</li><li>Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+M13+for+phage+display.">Engineering M13 for phage display.</a> Biomolecular Engineering. 18, 57-63 (2002).</li><li>Hamzeh-Mivehroud, M., Mahmoudpour, A., Dastmalchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+new+peptide+ligands+for+epidermal+growth+factor+receptor+using+phage+display+and+computationally+modeling+their+mode+of+binding.">Identification of new peptide ligands for epidermal growth factor receptor using phage display and computationally modeling their mode of binding.</a> Chemical Biology &amp; Drug Design. 79 (3), 246-259 (2012).</li><li>Askoxylakis, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide-based+targeting+of+the+platelet-derived+growth+factor+receptor+beta.">Peptide-based targeting of the platelet-derived growth factor receptor beta.</a> Molecular Imaging and Biology. 15 (2), 212-221 (2013).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transdermal+protein+delivery+by+a+coadministered+peptide+identified+via+phage+display.">Transdermal protein delivery by a coadministered peptide identified via phage display.</a> Nature Biotechnology. 24 (4), 455-460 (2006).</li><li>Azzazy, H. M., Highsmith, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+display+technology:+clinical+applications+and+recent+innovations.">Phage display technology: clinical applications and recent innovations.</a> Clinical Biochemistry. 35, 425-445 (2002).</li><li>Pasqualini, R., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+targeting+In+vivo+using+phage+display+peptide+libraries.">Organ targeting In vivo using phage display peptide libraries.</a> Nature. 380 (6572), 364-366 (1996).</li><li>Liu, R., Li, X., Xiao, W., Lam, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-targeting+peptides+from+combinatorial+libraries.">Tumor-targeting peptides from combinatorial libraries.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 110-111, 13-37 (2017).</li><li>Binetruy-Tournaire, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+peptide+blocking+vascular+endothelial+growth+factor+(VEGF)-mediated+angiogenesis.">Identification of a peptide blocking vascular endothelial growth factor (VEGF)-mediated angiogenesis.</a> The EMBO Journal. 19, 1525-1533 (2000).</li><li>Peng, Y., Zhang, Y., Mitchell, W. J., Zhang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Lipopolysaccharide-Targeted+Peptide+Mimic+Vaccine+against+Q+Fever.">Development of a Lipopolysaccharide-Targeted Peptide Mimic Vaccine against Q Fever.</a> Journal of Immunology. 189, 4909-4920 (2012).</li><li>Lamichhane, T. N., Abeydeera, N. D., Duc, A. C., Cunningham, P. R., Chow, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+Peptides+Targeting+Helix+31+of+Bacterial+16S+Ribosomal+RNA+by+Screening+M13+Phage-Display+Libraries.">Selection of Peptides Targeting Helix 31 of Bacterial 16S Ribosomal RNA by Screening M13 Phage-Display Libraries.</a> Molecules. 16, 1211-1239 (2011).</li><li>Sahin, D., Taflan, S. O., Yartas, G., Ashktorab, H., Smoot, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+Identification+of+Peptides+Specifically+Targeted+to+Gastric+Cancer+Cells+from+a+Phage+Display+Peptide+Library.+Asian+Pacific.">Screening and Identification of Peptides Specifically Targeted to Gastric Cancer Cells from a Phage Display Peptide Library. Asian Pacific.</a> Journal of Cancer Prevention. 19 (4), 927-932 (2018).</li><li>Kelly, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+nanoparticles+for+imaging+incipient+pancreatic+ductal+adenocarcinoma.">Targeted nanoparticles for imaging incipient pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> PLOS Medicine. 5 (4), e85 (2008).</li><li>Sugihara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+pro-apoptotic+peptides+as+potential+therapy+for+peritoneal+endometriosis.">Development of pro-apoptotic peptides as potential therapy for peritoneal endometriosis.</a> Nature Communications. 5, 4478 (2014).</li><li>Rafii, S., Avecilla, S. T., Jin, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+vasculature+address+book:+Identification+of+stage-specific+tumor+vessel+zip+codes+by+phage+display.">Tumor vasculature address book: Identification of stage-specific tumor vessel zip codes by phage display.</a> Cancer Cell. 4, 331-333 (2003).</li><li>Arap, W., Pasqualini, R., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+Treatment+by+Targeted+Drug+Delivery+to+Tumor+Vasculature+in+a+Mouse+Model.">Cancer Treatment by Targeted Drug Delivery to Tumor Vasculature in a Mouse Model.</a> Science. 279, 377-390 (1997).</li></ol>

Ett kombinatoriskt phage-bibliotek är ett kraftfullt och effektivt verktyg för hög genomflöde av nya peptider som kan binda målmolekyler och reglera deras funktion13. För närvarande, phage display peptid bibliotek har ett brett spektrum av applikationer. Till exempel, de kan användas för att välja bioaktiva peptider bundna till receptor proteiner23, icke-proteinmål24,25, sjukdomsspecifika antigen härmar<...

Fibroblast tillväxtfaktor receptorer (FGFRs) spela viktiga roller i cellproliferation, sårläkning, och angiogenes in vivo1. Avvikande aktivering av FGFR-signalering observerades i en mängd olika tumörer2,3,4,5 inkluderar genamplifiering, genmutationer, kromosomala avvikelser, och överdriven ligand sekretion6 . Många hämmare som riktar sig mot FGFRs har visat lovande terapeutiska effekter i kliniska prövningar och är huvudsakligen indelade i tre typer: (1) små molekyl kinashämmare, som binder till den intracellulära domänen av FGFR, (2) antagonister riktade mot extracellulära segmentet och (3) FGF ligand-fällor6. Även om flera av de små molekylen kinashämmare har goda terapeutiska effekter både in vitro-och in vivo7, de flesta av dem har dålig mål specificitet och visar negativa effekter såsom hypertoni8. Majoriteten av antagonister är monoklonala antikroppar9,10 och polypeptider11. Peptider har fördelar jämfört med små molekyler på grund av deras specificitet och lägre biverkningar. De behåller också cellernas permeabilitet och ackumuleras inte i specifika organ jämfört med protein droger12. Därför riktade små peptider är både effektiva och prospektiva terapeutiska medel.
Phage displayteknik är ett enkelt men kraftfullt verktyg för att identifiera små peptider som kan binda till en given molekyl13,14,15. Vi använde en phage display peptid bibliotek som är baserad på en enkel M13 phage med över 109 olika peptid sekvenser visas på svansen för bindning till målmolekylen (se tabell över material)16. På grund av den höga affinitet av Fager mot den givna molekylen kan obundna Fager tvättas bort, och endast tätt bundna Fager med de önskade korta peptiderna behålls. De givna molekylära målen kan immobiliseras proteiner17,18, kolhydrater, odlade celler, eller till och med oorganiska material19,20. Ett spännande fall rapporterades där organspecifika peptider valdes in vivo med hjälp av phage displayteknik21. Fördelarna med phage displayteknik inkluderar hög genomströmning, enkel drift, låg kostnad och ett brett spektrum av applikationer22.
I denna studie ger vi ett detaljerat protokoll för screening små peptider bindning till immobiliserat protein (FGFR2) med hjälp av en fagdisplay bibliotek. Effekten av tekniken undersöks också genom att mäta Affiniteten hos den erhållna peptiden mot FGFR2 genom isotermisk titrering Calorimetri (ITC), och den biologiska aktiviteten genom en cell proliferation assay. Metoden kan förlängas för screening av små peptider som binder till kolhydrater, odlade celler, eller till och med oorganiska material.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m Filter</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MPGP002A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 cm2 Small dish</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>150460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Guangzhou chemical reagent factory</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-96 gIII sequencing primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Synthesis from Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Nest</td>
			<td>701001-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST004D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto-Tryptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>L0037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c 3T3 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-&#173;6587</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Biodragon</td>
			<td>BD-M10110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCK-8 kit</td>
			<td>DOJINDO</td>
			<td>CK04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>sh30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMF</td>
			<td>Newprobe</td>
			<td>PB10247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15576028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2 Protein</td>
			<td>Sino Biological Inc.</td>
			<td>10014-HNAE</td>
			<td>Purity &#62;95%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITC200 system</td>
			<td>MicroCal Omega</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Guangzhou chemical reagent factory</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaI</td>
			<td>Bidepharm</td>
			<td>BD40879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Guangzhou chemical reagent factory</td>
			<td>1310-73-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG&#8211;8000</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2139-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ph.D.-7 phage display peptide library kit</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E8100S</td>
			<td>Containing the Ph.D.-7 phage library, E. coli ER2738 host strain and M13KE control phage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant FGFR2 extracellular domain proteins</td>
			<td>Sino Biological Inc.</td>
			<td>10824-H08H</td>
			<td>Purity &#62; 97%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small peptide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Synthesis from GL Biochem Ltd. (Shanghai, China)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-SHS-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SLF-T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

screening and identification of small peptides targeting fibroblast growth factor receptor2 using a phage display peptide library

Den mänskliga fibroblast tillväxtfaktor receptor (FGFR) familjen består av fyra medlemmar, nämligen, FGFR1, FGFR2, FGFR3, och FGFR4, som är involverade i olika biologiska aktiviteter inklusive cellproliferation, överlevnad, migration och differentiering. Flera avvikelser i FGFR signalvägen, på grund av mutationer eller genamplifiering händelser, har identifierats i olika typer av cancer. Den senaste forskningen har därför fokuserat på att utveckla strategier som involverar terapeutisk inriktning av FGFRs. aktuella FGFR-hämmare i olika stadier av preklinisk och klinisk utveckling omfattar antingen småmolekylära hämmare av tyrosinkinaser eller monoklonala antikroppar, med endast ett fåtal peptid-baserade hämmare i rörledningen. Här tillhandahåller vi ett protokoll som använder phage displayteknik för att avskärma små peptider som antagonister till FGFR2. Kortfattat, ett bibliotek med fagvisade peptider inkuberades i en tallrik belagd med FGFR2. Därefter spolades obunden phage av av TBST (TBS + 0,1% [v/v] Tween-20), och destinerad phage eluerades med 0,2 M Glycine-HCl buffert (pH 2,2). Den eluerade Fagen förstärkallades ytterligare och användes som indata för nästa omgång biopanning. Efter tre omgångar av biopanning identifierades peptidsekvenserna av enskilda fagkloner med DNA-sekvensering. Slutligen, de screening peptider syntetiseras och analyseras för affinitet och biologisk aktivitet.

Erhålla en hög affinitet liten peptid inriktning FGFR2.
För att avskärma Fager som riktar FGFR2, användes ett Ph.D.-7 Arkiv i denna studie. En schematisk representation av arbetsflödet visas i figur 1. I denna process, antalet fagindata (PFU) hölls oförändrad, medan beläggningen koncentrationen av FGFR2 protein reducerades gradvis. Resultaten av fagtiter föreslog att antalet återvunna Fager ökade gradvis, och efter 3 omgångar, det va...

Watch this Scientific Journal Video about Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library at JoVE.com

Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library

Häri presenterar vi ett detaljerat protokoll för screening av små peptider som binder till FGFR2 med hjälp av en fagdisplay peptid bibliotek. Vi analyserar vidare Affiniteten hos de utvalda peptiderna mot FGFR2 in vitro och dess förmåga att undertrycka cellproliferation.

Screening och identifiering av små peptider riktade fibroblast tillväxtfaktor Receptor2 använda en phage display peptid bibliotek

The human Fibroblast Growth Factor Receptor (FGFR) family comprises four members, namely, FGFR1, FGFR2, FGFR3, and FGFR4, that are involved in various ...

Jämfört med andra metoder, detta protokoll är lättare att ta reda på nya antagonisters, agonisteres, och allosteric modulatorer kvantitativt och kvalitativt utan att känna till hydro-utspädning struktur och bildandet av målet protein. Detta protokoll är hög effektiv, lätt att hantera, ekonomisk, och kommersiellt tillgängliga. Kombinera denna höga genomströmning screeningmetod med ITC-analys, de funktionella små peptiderna kan erhållas kvantitativt och kvalitativt.Demonstrera förfarandet kommer att Ying Zhao och Qiang Wang, doktorander från vårt laboratorium. För att påbörja detta förfarande, förbereda en lösning av FGFR2 i beläggningsbuffert vid en koncentration av 10 mikrogram per milliliter. Tillsätt en milliliter av lösningen till en 35 kvadrat centimeter skålen och snurra upprepade gånger tills ytan är helt våt.Inkubera över natten vid fyra grader Celsius med skakningar. Nästa dag, häll av beläggningslösningen och tillsätt den förberedda blockeringslösningen. Inkubera vid fyra grader Celsius i minst en timme, kassera sedan blockeringslösningen och tvätta snabbt plattan sex gånger med TBST samtidigt som du ser till att skålen inte torkar ut.Rekonstituera den ursprungliga faben biblioteket i en milliliter av TBST och lägga till detta till belagda skålen. Gunga försiktigt plattan på en shaker i rumstemperatur i två timmar. Efter detta, kassera supernatanten och tvätta skålen 10 gånger med TBST.Elera den bundna genom att lägga till en milliliter av 0,2 molar glycin HCL till skålen och gunga försiktigt vid rumstemperatur i 10 minuter. Överför eluenten till ett steriliserat mikrocentrifugrör och neutralisera det med 100 mikroliter av en molar Tris-HCL vid pH 9.1. Först, förkrigstiden den beredda LB och IPTG X-Gal plattorna vid 37 grader Celsius i minst en timme före användning.Med hjälp av pipettspetsar med filterpatroner, preparera 100 mikroliter tiofaldiga utspädningar av eluenten i LB. Efter den beredda E.coli-kulturen når mitten av log fas, dispensera 200 mikroliter av kulturen i steriliserade mikrocentrifugrör en för varje eluent utspädning. För att initiera infektionen, tillsätt 50 mikroliter av varje spädning till de rör som innehåller E.coli-kulturen. Vortexa snabbt och inkubera i rumstemperatur i fem minuter.Använd sedan beläggningspinnar för att belägga LB- och IPTG X-GAL-plattorna med 90 mikroliter av denna blandning. Efter fem minuter, invertera plattorna och ruva dem över natten vid 37 grader Celsius. Räkna plack när de visas.Till att börja med späda ut övernattningskulturen i 20 milliliter LB i en 250 milliliter Erlenmeyerkolv. Tillsätt den oförbräskade eluent och inkubera vid 37 grader Celsius med kraftig skakning i 4-1/2 timmar. Därefter centrifug kulturen vid 12, 000 gånger G och fyra grader Celsius i 10 minuter.Överför supernatanten till ett nytt rör. Centrifugera igen med samma förhållanden och kassera pelleten. Överför de övre 80%av supernatanten till ett färskt rör och tillsätt den till 1/6th volym av 20%polyetylenglykol och 2,5 molar natriumklorid.Låt faset fällas ut över natten vid fyra grader Celsius. Nästa dag centrifug den utfällda fagen vid 12, 000 gånger G och fyra grader Celsius i 15 minuter. Kassera supernatanten och centrifugen igen med samma villkor.Använd en pipett för att ta bort den kvarvarande supernatanten. Resuspend pelleten i en milliliter av TBS och överföra supernatanten till ett mikrocentrifugrör. Centrifugera vid 12, 000 gånger G och fyra grader Celsius i fem minuter.Överför supernatanten till ett nytt mikrocentrifugrör och fäll fäll ut igen genom att tillsätta 1/6:e volym på 20%polyetylenglykol och 2,5 molar natriumklorid. Inkubera på is i 15 till 60 minuter. Därefter centrifug vid 12, 000 gånger G och fyra grader Celsius i 10 minuter.Kassera supernatanten och centrifugen igen med samma villkor. Använd en pipett för att ta bort den kvarvarande supernatanten. Resuspend pelleten i 200 mikroliter av TBS och centrifug i ytterligare en minut för att avlägsna föroreningar.Överför sedan supernatanten till ett nytt mikrocentrifugrör för att få fram den förstärkta eluenten. I denna studie hålls antalet famångstillförsel oförändrade medan beläggningskoncentrationen av FGFR2-protein gradvis minskas. Resultat av famtiteren tyder på att antalet återvunna fas gradvis ökar och att efter tre omgångar, det finns en 65-faldig ökning jämfört med den första omgången.Ett ITC-experiment genomförs sedan för att mäta samhörigheten hos den lilla peptiden till FGFR2. Resultaten indikerar att SP1-peptiden har hög affinitet mot FGFR2. Dessa data visar hur effektiv screeningprotokollet är.För att undersöka den biologiska aktiviteten hos SP1-peptiden utförs en fibroblast proliferationsanalys med hjälp av ett CCK-8-kit. BALB/C3T3 inkuberas med SP1-peptiden vid olika koncentrationer. Resultaten tyder på att SP1 peptiden dämpar tillväxten av cellerna.Föroreningen av vild-typ fas måste undvikas här. Se till att använda aerosolresistenta pipettspetsar. Medan tillväxt genom att erhålla fau förstärkning.Detta förfarande kan också användas vid screening små peptider som binder till kolhydrater, kulturceller, och vävnader. Dessa peptider kan vara ytterligare förstärkning över diagnostiska och riktade

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

Gene Delivery och Transfektion i mänskliga celler bukspottkörtelcancer med Epidermal Growth Factor Receptor-riktade Gelatin-Based Engineered Nanovectors

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

Bakteriell Detection &amp; identifiering med elektrokemiska sensorer

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Generation and Recovery of ÃƒÅ½Ã‚Â²-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Generering och återvinning av β-cell sfäroider från steg-tillväxt PEG-peptid Hydrogeler

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional  microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for  ...

Observing and Quantifying Fibroblast-mediated Fibrin Gel Compaction

Observera och kvantifiera Fibroblastmedierad Fibrin Gel Compaction

Cells embedded in collagen and fibrin gels attach and exert traction forces on the fibers of the gel. These forces can lead to local and global ...

Electrospinning Growth Factor Releasing Microspheres into Fibrous Scaffolds

Electro tillväxtfaktor Släpper mikrosfärer i Fiber Ställningar

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth.  This system incorporates mechanical, topographical, ...

Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

Leverans av proteiner, peptider eller cellimpermeabel Små molekyler i levande celler genom inkubation med Endosomolytic Reagens dfTAT

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the ...

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

Studie stökiometrin hos receptorn för epidermal tillväxtfaktor i intakta celler genom att använda Korrelat Mikroskopi

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

A Rapid and Quantitative Fluorimetric Method for Protein-Targeting Small Molecule Drug Screening

En snabb och kvantitativ Fluorimetrisk metod för Protein-inriktning Small Molecule drogundersökning

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold ...

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

Polyelektrolytkomplex för Heparin Binding Domain osteogent Growth Factor Leverans

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

Initial Evaluation of Antibody-conjugates Modified with Viral-derived Peptides for Increasing Cellular Accumulation and Improving Tumor Targeting

Första utvärdering av antikropp-konjugat modifierad med Viral-derived peptider för att öka cellulära ackumulering och förbättra tumör inriktning

Antibody-conjugates (ACs) modified with virus-derived peptides are a potentially powerful class of tumor cell delivery agents for molecular payloads used ...