Name: screening and identification of small peptides targeting fibroblast growth factor receptor2 using a phage display peptide library
Uploaded: 2019-09-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library at JoVE.com

Bu çalışma Guangzhou Bilim ve Teknoloji Programı (No. 2016201604030039) tarafından desteklenmiştir.

1. Reaktif hazırlama
<ol><li>LB (lysogeny suyu) orta: 1 g tripton, 0,5 g maya özü ve 0,5 g NaCl 100 mL H2O. Otoklav ve 4 °C'de saklayın.</li>
	<li>Tetrasiklin stoğu: 20 mg/mL'yi 1:1 etanolde hazırlayın:H2O. -20 °C'de ve kullanmadan önce girdapta saklayın.</li>
	<li>IPTG/X-gal çözeltisi: 10 mL DMF (dimethylethylformaformide) içinde 0,5 g IPTG (izopropil β-D-1-thiogalactopyranoside) ve 0,4 g X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactoside) karıştırın. Çözelti karanlıkta bir ...

<ol>
	<li>Eswarakumar, V. P., Lax, I., Schlessinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+signaling+by+fibroblast+growth+factor+receptors.">Cellular signaling by fibroblast growth factor receptors.</a> Cytokine &amp; Growth Factor Reviews. 16 (2), 139-149 (2005).</li><li>Turner, N., Grose, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+signaling:+from+development+to+cancer.">Fibroblast growth factor signaling: from development to cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 10 (2), 116-129 (2010).</li><li>Cancer Genome Atlas Network. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+molecular+portraits+of+human+breast+tumors.">Comprehensive molecular portraits of human breast tumors.</a> Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).</li><li>Matsumoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGFR2+gene+amplification+and+clinicopathological+features+in+gastric+cancer.">FGFR2 gene amplification and clinicopathological features in gastric cancer.</a> British Journal of Cancer. 106 (4), 727-732 (2012).</li><li>Weiss, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequent+and+focal+FGFR1+amplification+associates+with+therapeutically+tractable+FGFR1+dependency+in+squamous+cell+lung+cancer.">Frequent and focal FGFR1 amplification associates with therapeutically tractable FGFR1 dependency in squamous cell lung cancer.</a> Science Translational Medicine. 2 (62), 62ra93 (2010).</li><li>Babina, I. S., Turner, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+challenges+in+targeting+FGFR+signaling+in+cancer.">Advances and challenges in targeting FGFR signaling in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (5), 318-322 (2017).</li><li>Katoh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+receptors+as+treatment+targets+in+clinical+oncology.">Fibroblast growth factor receptors as treatment targets in clinical oncology.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 16 (2), 105-122 (2019).</li><li>Soria, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I/IIa+study+evaluating+the+safety,+efficacy,+pharmacokinetics,+and+pharmacodynamics+of+lucitanib+in+advanced+solid+tumors.">Phase I/IIa study evaluating the safety, efficacy, pharmacokinetics, and pharmacodynamics of lucitanib in advanced solid tumors.</a> Annals of Oncology. 25 (11), 2244-2251 (2014).</li><li>French, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+FGFR4+inhibits+hepatocellular+carcinoma+in+preclinical+mouse+models.">Targeting FGFR4 inhibits hepatocellular carcinoma in preclinical mouse models.</a> PLoS ONE. 7 (5), e36713 (2012).</li><li>Martinez-Torrecuadrada, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+extracellular+domain+of+fibroblast+growth+factor+receptor+3+with+human+single-chain+Fv+antibodies+inhibits+bladder+carcinoma+cell+line+proliferation.">Targeting the extracellular domain of fibroblast growth factor receptor 3 with human single-chain Fv antibodies inhibits bladder carcinoma cell line proliferation.</a> Clinical Cancer Research. 11 (17), 6280-6290 (2005).</li><li>Palamakumbura, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysyl+oxidase+propeptide+inhibits+prostate+cancer+cell+growth+by+mechanisms+that+target+FGF-2-cell+binding+and+signaling.">Lysyl oxidase propeptide inhibits prostate cancer cell growth by mechanisms that target FGF-2-cell binding and signaling.</a> Oncogene. 28 (38), 3390-3400 (2009).</li><li>Ladner, R. C., Sato, A. K., Gorzelany, J., de Souza, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+display-derived+peptides+as+therapeutic+alternatives+to+antibodies.">Phage display-derived peptides as therapeutic alternatives to antibodies.</a> Drug Discovery Today. 9 (12), 525-529 (2004).</li><li>Wu, C. H., Liu, I. J., Lu, R. M., Wu, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancement+and+applications+of+peptide+phage+display+technology+in+biomedical+science.">Advancement and applications of peptide phage display technology in biomedical science.</a> Journal of Biomedical Science. 23, 8 (2016).</li><li>Kay, B. K., Kasanov, J., Yamabhai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+phage-displayed+combinatorial+peptide+libraries.">Screening phage-displayed combinatorial peptide libraries.</a> Methods. 24 (3), 240-246 (2001).</li><li>Rodi, D. J., Makowski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage-display+technology+-+Finding+a+needle+in+a+vast+molecular+haystack.">Phage-display technology - Finding a needle in a vast molecular haystack.</a> Current Opinion in Biotechnology. 10, 87-93 (1999).</li><li>Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+M13+for+phage+display.">Engineering M13 for phage display.</a> Biomolecular Engineering. 18, 57-63 (2002).</li><li>Hamzeh-Mivehroud, M., Mahmoudpour, A., Dastmalchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+new+peptide+ligands+for+epidermal+growth+factor+receptor+using+phage+display+and+computationally+modeling+their+mode+of+binding.">Identification of new peptide ligands for epidermal growth factor receptor using phage display and computationally modeling their mode of binding.</a> Chemical Biology &amp; Drug Design. 79 (3), 246-259 (2012).</li><li>Askoxylakis, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide-based+targeting+of+the+platelet-derived+growth+factor+receptor+beta.">Peptide-based targeting of the platelet-derived growth factor receptor beta.</a> Molecular Imaging and Biology. 15 (2), 212-221 (2013).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transdermal+protein+delivery+by+a+coadministered+peptide+identified+via+phage+display.">Transdermal protein delivery by a coadministered peptide identified via phage display.</a> Nature Biotechnology. 24 (4), 455-460 (2006).</li><li>Azzazy, H. M., Highsmith, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+display+technology:+clinical+applications+and+recent+innovations.">Phage display technology: clinical applications and recent innovations.</a> Clinical Biochemistry. 35, 425-445 (2002).</li><li>Pasqualini, R., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+targeting+In+vivo+using+phage+display+peptide+libraries.">Organ targeting In vivo using phage display peptide libraries.</a> Nature. 380 (6572), 364-366 (1996).</li><li>Liu, R., Li, X., Xiao, W., Lam, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-targeting+peptides+from+combinatorial+libraries.">Tumor-targeting peptides from combinatorial libraries.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 110-111, 13-37 (2017).</li><li>Binetruy-Tournaire, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+peptide+blocking+vascular+endothelial+growth+factor+(VEGF)-mediated+angiogenesis.">Identification of a peptide blocking vascular endothelial growth factor (VEGF)-mediated angiogenesis.</a> The EMBO Journal. 19, 1525-1533 (2000).</li><li>Peng, Y., Zhang, Y., Mitchell, W. J., Zhang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Lipopolysaccharide-Targeted+Peptide+Mimic+Vaccine+against+Q+Fever.">Development of a Lipopolysaccharide-Targeted Peptide Mimic Vaccine against Q Fever.</a> Journal of Immunology. 189, 4909-4920 (2012).</li><li>Lamichhane, T. N., Abeydeera, N. D., Duc, A. C., Cunningham, P. R., Chow, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+Peptides+Targeting+Helix+31+of+Bacterial+16S+Ribosomal+RNA+by+Screening+M13+Phage-Display+Libraries.">Selection of Peptides Targeting Helix 31 of Bacterial 16S Ribosomal RNA by Screening M13 Phage-Display Libraries.</a> Molecules. 16, 1211-1239 (2011).</li><li>Sahin, D., Taflan, S. O., Yartas, G., Ashktorab, H., Smoot, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+Identification+of+Peptides+Specifically+Targeted+to+Gastric+Cancer+Cells+from+a+Phage+Display+Peptide+Library.+Asian+Pacific.">Screening and Identification of Peptides Specifically Targeted to Gastric Cancer Cells from a Phage Display Peptide Library. Asian Pacific.</a> Journal of Cancer Prevention. 19 (4), 927-932 (2018).</li><li>Kelly, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+nanoparticles+for+imaging+incipient+pancreatic+ductal+adenocarcinoma.">Targeted nanoparticles for imaging incipient pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> PLOS Medicine. 5 (4), e85 (2008).</li><li>Sugihara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+pro-apoptotic+peptides+as+potential+therapy+for+peritoneal+endometriosis.">Development of pro-apoptotic peptides as potential therapy for peritoneal endometriosis.</a> Nature Communications. 5, 4478 (2014).</li><li>Rafii, S., Avecilla, S. T., Jin, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+vasculature+address+book:+Identification+of+stage-specific+tumor+vessel+zip+codes+by+phage+display.">Tumor vasculature address book: Identification of stage-specific tumor vessel zip codes by phage display.</a> Cancer Cell. 4, 331-333 (2003).</li><li>Arap, W., Pasqualini, R., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+Treatment+by+Targeted+Drug+Delivery+to+Tumor+Vasculature+in+a+Mouse+Model.">Cancer Treatment by Targeted Drug Delivery to Tumor Vasculature in a Mouse Model.</a> Science. 279, 377-390 (1997).</li></ol>

Bir kombinatoryal faj kütüphane hedef molekülleri bağlamak ve fonksiyonlarını düzenleyen yeni peptidlerin yüksek iş letiyet tarama için güçlü ve etkili bir araçtır13. Şu anda, faj ekran peptid kütüphaneleri uygulamaları geniş bir yelpazede var. Örneğin, onlar reseptör proteinlerine bağlı biyoaktif peptidler seçmek için kullanılabilir23, non-protein hedefleri24,25, hastalığa özgü antij...

Fibroblast büyüme faktörü reseptörleri (FGVR) hücre çoğalmasında, yara iyileşmesinde ve in vivo1'deanjiyogenezde kilit rol oynar. Çeşitli tümörlerde gözlenen FGFR sinyallerinin anormal aktivasyonu2,3,4,5 gen amplifikasyonu, gen mutasyonları, kromozom salamanasyonları ve aşırı ligand salgılanması6 . FGFR'leri hedef alan birçok inhibitör klinik çalışmalarda umut verici terapötik etkiler göstermiştir ve esas olarak üç tipe ayrılır: (1) fgfr hücre içi etki alanına bağlanan küçük molekül kinaz inhibitörleri, (2) antagonistleri hücre dışı segment ve (3) FGF ligand tuzakları6. Küçük molekül kiazaz inhibitörleri birkaç in vitro ve in vivo7hem de iyi terapötik etkileri olmasına rağmen, bunların çoğu kötü hedef özgüllüğü var ve hipertansiyon gibi yan etkiler göstermektedir8. Antagonistlerin çoğunluğu monoklonal antikorlar9,10 ve polipeptidler11. Peptidler özgüllük leri ve düşük yan etkileri nedeniyle küçük moleküllere göre avantajlıdır. Ayrıca hücre geçirgenliğini korurlar ve protein ilaçlarına göre belirli organlarda birikmezler12. Bu nedenle, hedeflenen küçük peptidler hem etkili ve prospektif terapötik ajanlardır.
Faj ekran teknolojisi belirli birmolekül13,14,15bağlanabilir küçük peptidler tanımlamak için kolay ama güçlü bir araçtır. Biz hedef moleküle bağlanmak için kuyruk görüntülenen 109 farklı peptid dizileri ile basit bir M13 faj dayalı bir faj ekran peptid kütüphane kullanılır (Malzeme Tablosubakınız )16. Verilen moleküle fajların yüksek yakınlığı nedeniyle, bağlanmamış fajlar yıkanabilir ve sadece istenilen kısa peptidler ile sıkıca bağlanmış fajlar korunur. Verilen moleküler hedefler immobilize proteinler olabilir17,18, karbonhidratlar, kültürlü hücreler, hatta inorganik maddeler19,20. Heyecan verici bir durumda nerede organa özgü peptidler faj ekran teknolojisi kullanılarak in vivo seçildibildirilmiştir 21. Faj görüntüleme teknolojisinin avantajları arasında yüksek iş gücü, çalışma kolaylığı, düşük maliyet ve çok çeşitli uygulamalar22bulunmaktadır.
Bu çalışmada, faj görüntüleme kitaplığı kullanılarak immobilize proteine (FGFR2) bağlanan küçük peptidlerin taranması için ayrıntılı bir protokol sunuz. Teknolojinin etkinliği, elde edilen peptidin FGFR2'ye olan yakınlığı nın Izothermal Titrasyon Kalorimetresi (ITC) ile ölçülmesi ve hücre çoğalması tahkikatı ile biyolojik aktivite ile de incelenir. Yöntem karbonhidratlar, kültürlü hücreler, hatta inorganik maddelere bağlanan küçük peptidlerin taranması için uzatılabilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m Filter</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MPGP002A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 cm2 Small dish</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>150460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Guangzhou chemical reagent factory</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-96 gIII sequencing primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Synthesis from Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Nest</td>
			<td>701001-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST004D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto-Tryptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>L0037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c 3T3 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-&#173;6587</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Biodragon</td>
			<td>BD-M10110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCK-8 kit</td>
			<td>DOJINDO</td>
			<td>CK04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>sh30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMF</td>
			<td>Newprobe</td>
			<td>PB10247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15576028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2 Protein</td>
			<td>Sino Biological Inc.</td>
			<td>10014-HNAE</td>
			<td>Purity &#62;95%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITC200 system</td>
			<td>MicroCal Omega</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Guangzhou chemical reagent factory</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaI</td>
			<td>Bidepharm</td>
			<td>BD40879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Guangzhou chemical reagent factory</td>
			<td>1310-73-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG&#8211;8000</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2139-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ph.D.-7 phage display peptide library kit</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E8100S</td>
			<td>Containing the Ph.D.-7 phage library, E. coli ER2738 host strain and M13KE control phage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant FGFR2 extracellular domain proteins</td>
			<td>Sino Biological Inc.</td>
			<td>10824-H08H</td>
			<td>Purity &#62; 97%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small peptide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Synthesis from GL Biochem Ltd. (Shanghai, China)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-SHS-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SLF-T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

screening and identification of small peptides targeting fibroblast growth factor receptor2 using a phage display peptide library

İnsan Fibroblast Büyüme Faktörü Reseptörü (FGFR) ailesi, hücre çoğalması, sağkalım, göç ve farklılaşma gibi çeşitli biyolojik faaliyetlerde bulunan FGFR1, FGFR2, FGFR2, FGFR3 ve FGFR4 olmak üzere dört üyeden oluşur. FGFR sinyal yolunda mutasyonlar veya gen amplifikasyon olayları nedeniyle çeşitli kanser türlerinde çeşitli sapmalar tespit edilmiştir. Bu nedenle, son araştırmalar FGFR'lerin terapötik hedeflemesini içeren stratejiler geliştirmeye odaklanmıştır. monoklonal antikorlar, boru hattında sadece birkaç peptit bazlı inhibitörleri vardır. Burada, FGFR2 antagonistleri olarak küçük peptidler görüntülemek için faj ekran teknolojisini kullanarak bir protokol sağlar. Kısaca, faj görüntülenen peptidler bir kütüphane FGFR2 ile kaplı bir tabak içinde kuluçka yada oldu. Daha sonra, bağlanmamış faj TBST tarafından yıkandı (TBS + 0.1% [v/v] Tween-20), ve bağlı faj 0.2 M glisin-HCl tampon (pH 2.2) ile eluted edildi. Eluted faj daha da güçlendirilmiş ve biopanning bir sonraki tur için giriş olarak kullanılmıştır. Üç tur biopanning sonrasında, bireysel faj klonların peptid dizileri DNA dizilimi ile tespit edildi. Son olarak, taranmış peptidler sentezlendi ve yakınlık ve biyolojik aktivite için analiz edildi.

FGFR2 hedefleyen yüksek bir afinite küçük peptid elde.
Bu çalışmada FGFR2'yi hedefleyen fajları taramak için doktora-7 kütüphanesi kullanılmıştır. İş akışının şematik gösterimi Şekil 1'degösterilmiştir. Bu süreçte faj girdisi (PFU) sayısı değişmeden tutulurken, FGFR2 proteininin kaplama konsantrasyonu kademeli olarak azaltıldı. Faj titresinin sonuçları, kurtarılan faj sayısının kademeli olarak arttığını ...

Watch this Scientific Journal Video about Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library at JoVE.com

Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library

Burada, faj görüntüleme peptid kütüphanesi kullanarak FGFR2'ye bağlanan küçük peptidlerin taranması için ayrıntılı bir protokol sayılmiyoruz. Seçilen peptidlerin FGFR2 in vitro'ya olan yakınlığını ve hücre çoğalmasını bastırma yeteneğini daha da analiz ediyoruz.

Faj Görüntüleme Peptid Kütüphanesi Kullanılarak Fibroblast Büyüme Faktörü Reseptörü 2'yi Hedefleyen Küçük Peptidlerin Taranması ve Tanımlanması

The human Fibroblast Growth Factor Receptor (FGFR) family comprises four members, namely, FGFR1, FGFR2, FGFR3, and FGFR4, that are involved in various ...

Diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu protokol, hidro-seyreltme yapısı ve hedef proteinoluşumunu bilmeden kantitatif ve niteliksel olarak yeni antagonisterler, agonisterler ve allosteric modülatörleri bulmak daha kolaydır. Bu protokol yüksek verimli, kullanımı kolay, ekonomik ve ticari olarak mevcuttur. ItC analizi ile bu yüksek iş elde tarama yöntemi birleştirin, fonksiyonel küçük peptidler nicel ve nitel elde edilebilir.Prosedürü gösteren Ying Zhao ve Qiang Wang, bizim laboratuvardan yüksek lisans öğrencileri olacaktır. Bu prosedüre başlamak için, mililitre başına 10 mikrogram konsantrasyonda kaplama tamponf2 bir çözüm hazırlamak. 35 santimetre karelik bir tabağa bir mililitre çözelti ekleyin ve yüzey tamamen ıslanana kadar tekrar tekrar girdap.Bir gece boyunca dört derece santigrat derecede titreyerek kuluçkaya yat. Ertesi gün, kaplama çözeltisini dökün ve hazırlanan bloklama solüsyonu ekleyin. En az bir saat boyunca dört santigrat derecede kuluçkaya yatın, ardından bloke solüsyonu atın ve tabağı TBST ile altı kez hızlıca yıkayın ve yemeğin kurumamasını önlayın.Orijinal faj kitaplığını bir mililitre TBST'de yeniden oluşturun ve bunu kaplamalı tabağa ekleyin. Yavaşça iki saat boyunca oda sıcaklığında bir shaker üzerinde plaka sallayın. Bundan sonra, supernatant atın ve TBST ile çanak 10 kez yıkayın.Çanağa bir mililitre 0.2 molar glisin HCL ekleyerek ve oda sıcaklığında 10 dakika hafifçe sallayarak bağlı fajı eleyin. Elüent'i sterilleştirilmiş mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve pH 9.1'de bir molar Tris-HCL'nin 100 mikrolitresi ile nötralize edin. İlk olarak, hazırLB ve IPTG X-Gal plakaları kullanmadan önce en az bir saat boyunca 37 santigrat derecede ısıtın.Filtre kartuşları ile pipet uçlarını kullanarak, LB'deki eluentin 10 kat seyreltmelerini 100 mikrolitre hazırlayın. Hazırlanan E.coli kültürü orta log fazına ulaştıktan sonra, kültürün 200 mikrolitresini sterilize edilmiş mikrosantrifüj tüplere her elüent seyreltme için bir tane dağıtın. Enfeksiyonu başlatmak için, E.coli kültürünü içeren tüplere her seyreltmenin 50 mikrolitresini ekleyin. Girdap hızlı ve beş dakika oda sıcaklığında kuluçka.Daha sonra bu karışımın 90 mikrolitre ile LB ve IPTG X-GAL plakaları kaplamak için kaplama çubukları kullanın. Beş dakika sonra, plakaları ters çevirin ve bir gecede 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Plakları göründüklerinde say.Başlamak için, 250 mililitrelik Erlenmeyer şişesinde 20 mililitre LB gecede kültürü seyreltin. 4-1/2 saat boyunca güçlü sallayarak 37 santigrat derece de amplifikatsuz elüent ve kuluçka ekleyin. Sonra, 12, 000 kez G ve 10 dakika boyunca dört derece santigrat kültür santrifüj.Supernatant'ı yeni bir tüpe aktarın. Santrifüj tekrar aynı koşulları kullanarak ve pelet atın. Supernatantın üst %80'ini yeni bir tüpe aktarın ve %20 polietilen glikol ve 2,5 molar sodyum klorür 1/6th hacmine ekleyin.Fajın bir gecede dört santigrat derecede çökelmesine izin verin. Ertesi gün, 12, 000 kez G ve 15 dakika boyunca dört derece santigrat çökelmiş faj santrifüj. Aynı koşulları kullanarak supernatant ve santrifüj tekrar atın.Artık supernatant kaldırmak için bir pipet kullanın. TBS bir mililitre pelet resuspend ve bir mikrosantrifüj tüp için supernatant aktarın. Santrifüj 12, 000 kez G ve dört santigrat derece beş dakika.Süpernatant'ı taze bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve %20 polietilen glikol ve 2,5 molar sodyum klorür içeren 1/6th hacmi ni ekleyerek tekrar çökeltin. 15-60 dakika buzda kuluçkaya yat. Sonra, 12, 000 kez G ve 10 dakika boyunca dört santigrat derece santrifüj.Aynı koşulları kullanarak supernatant ve santrifüj tekrar atın. Artık supernatant kaldırmak için bir pipet kullanın. Kirleri gidermek için peleti 200 mikrolitre TBS ve santrifüjde bir dakika daha askıya alın.Sonra güçlendirilmiş elüent elde etmek için taze bir mikrosantrifüj tüp supernatant aktarın. Bu çalışmada faj girdisi sayısı değişmeden tutulurken, FGFR2 proteininin kaplama konsantrasyonu kademeli olarak azaltıldı. Faj titresinin sonuçları, kurtarılan faj sayısının kademeli olarak arttığını ve üç tur dan sonra ilk tura göre 65 kat artış olduğunu göstermektedir.Daha sonra küçük peptidin FGFR2'ye olan yakınlığını ölçmek için bir ITC deneyi yapılır. Sonuçlar, SP1 peptidin FGFR2'ye karşı yüksek afiniteye sahip olduğunu göstermektedir. Bu veriler, tarama protokolünün verimliliğini göstermektedir.SP1 peptidin biyolojik aktivitesini araştırmak için CCK-8 kiti kullanılarak fibroblast proliferasyon teşpisi yapılır. BALB/C3T3 farklı konsantrasyonlarda SP1 peptid ile inkübe edilir. Sonuçlar SP1 peptid hücrelerin büyümesini bastırır öneririz.Yabani tip fajların kirlenmesinden burada kaçınılmalıdır. Aerosole dayanıklı pipet uçları kullandığınızdan emin olun. Faj amplifikasyonu elde ederek büyüme sırasında.Bu işlem aynı zamanda karbonhidratlar, kültür hücreleri ve dokulara bağlamak küçük peptidler taramada kullanılabilir. Bu peptidler tanı üzerinde daha fazla amplifikasyon olabilir ve hedeflenen

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

İnsan Pankreas Kanseri Hücrelerinde Epidermal Büyüme Faktörü kullanarak Gen Teslimat ve Transfeksiyon Jelatin Tabanlı Engineered Nanovectors Reseptör-hedefli

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

Elektrokimyasal Sensörler kullanarak Bakteriyel Algılama ve Tanıma

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Generation and Recovery of ÃƒÅ½Ã‚Â²-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Adım büyüme PEG-peptid Hidrojeller kaynaktan β-hücre sferoidlerin Üretimi ve Kurtarma

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional  microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for  ...

Observing and Quantifying Fibroblast-mediated Fibrin Gel Compaction

Fibroblast aracılı Fibrin Jel Sıkıştırmayı Gözlemleme ve Ölçme

Cells embedded in collagen and fibrin gels attach and exert traction forces on the fibers of the gel. These forces can lead to local and global ...

Electrospinning Growth Factor Releasing Microspheres into Fibrous Scaffolds

Lifli iskelelerinin içine Microspheres ibra Elektroeğirme Büyüme Faktörü

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth.  This system incorporates mechanical, topographical, ...

Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

Endosomolitik Reaktif dfTAT ile kuluçkaya yatırılması ile Canlı hücreler içine proteinler, peptitler ya da hücre-geçirgen olmayan küçük moleküller teslimi

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the ...

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

Korelatif Mikroskopisi kullanılarak sağlam hücrelerde Epidermal Büyüme Faktörü Alıcısının stokiyometrisinden incelenmesi

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

A Rapid and Quantitative Fluorimetric Method for Protein-Targeting Small Molecule Drug Screening

Protein-Hedefleme Küçük Molekül İlaç Tarama için hızlı ve Nicel florimetrik Yöntemi

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold ...

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

Heparin Binding Domain osteojenik Büyüme Faktörü Teslim polielektrolit Kompleksi

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

Initial Evaluation of Antibody-conjugates Modified with Viral-derived Peptides for Increasing Cellular Accumulation and Improving Tumor Targeting

Antikor conjugates ilk değerlendirilmesi ile Viral kaynaklı peptidler hücresel birikimi artan ve tümör hedefleme artırmak için değiştirilmiş

Antibody-conjugates (ACs) modified with virus-derived peptides are a potentially powerful class of tumor cell delivery agents for molecular payloads used ...