Name: luminescence lifetime imaging of o2 with a frequency-domain-based camera system
Uploaded: 2019-12-16T14:00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Luminescence Lifetime Imaging of O2 with a Frequency-Domain-Based Camera System at JoVE.com

ونشكر صوفي ليندغارد جاكوبسن (جامعه كوبنهاغن) ولارس بورغغارد بيدرسن (جامعه ارهوس) علي المساعدة التقنية. تم الحصول علي تمويل لهذه الدراسة من منحه سابير-Aude المتقدمة من صندوق البحوث المستقلة الدنمارك (الأمر الأمر-1323-00065B ؛ MK) ، منح المشاريع من صندوق البحوث المستقلة الدنمارك | العلوم الطبيعية (قوات ال8021-00308B ؛ MK) & العلوم التقنية والانتاجيه (قوات ال8022-00301B وال4184-00515B ؛ MK) ، ومؤسسه البحوث الوطنية الدنماركية (DNRF136) ، ومؤسسه بول بسبب جنسن (KK).

وصاحب البلاغ غيرهارد هولست موظف في الشبكة التي تصنع نظام الكاميرا المستخدمة في هذه المادة. وساهمت الشبكة ماليا في نشر هذه المادة وفي تكاليف النفاذ المفتوح.

في هذا البروتوكول ، يتم تغطيه كامل تدفق العمل من اعداد أوبتودي إلى O2 تحليل الصور. باتباع هذا البروتوكول ، يمكن الحصول علي الصور الكيميائية باستخدام الرواية التي تعتمد علي النطاق الترددي المصابيح مدي الحياة التلالؤ. اعتمادا علي التطبيق ، يمكن ان تكون ملفقه أوبتوديس مستو في مختلف الاحجام وسمك طبقه من طبقه الاستشعار تتراوح بين قويه 50-100 μm أوبتوديس مستو سميكه من عده أعشار من سنتيمتر مربع لتغطيه المجهر ينزلق مع < 1 μm طبقات الاستشعار سميكه6،40. وقد تم التدليل علي إمكانات هذا الأسلوب مع تطبيق معين ، ولكن لا يقتصر فقط علي O2 التصوير في النبات رهيزوسفيريس12،28.
هذه الطريقة لديها العديد من الفوائد بالمقارنة مع التلالؤ النقي القائم علي كثافة التصوير الكيميائي المستندة إلى الأساليب. التصوير مدي الحياة التلالؤ ليست ، أو علي الأقل اقل بكثير ، تتاثر الاضاءه غير المتساوية ، سماكه أوبتودي متفاوتة ، والصورة تبيض25. أيضا ، هذا الأسلوب يتجنب استخدام صبغه مرجعيه اضافيه مشتركه في التصويرالإشعاعي 17 ،37. بالمقارنة مع أنظمه الكاميرا الأخرى القائمة علي مدي الحياة ، مثل الكاميرات ذات النطاق الزمني المستخدمة بشكل شائع ،8،26، يمكن لنظام الكاميرا الجديد والبروتوكول المعروض هنا ان يحقق نتائج قابله للمقارنة. وفي منشور صدر مؤخرا ، تمت مقارنه الخصائص التحليلية لهذين النظامين ، ووجد ان نظام الكاميرا مدي الحياة القائم علي الترددات القائمة علي النطاق الترددي هو علي الأقل قابل للمقارنة مع السلفة السابقة التي تستند إلى النطاق الزمني والتي توقفت8.
لقد قدمنا ابسط O2 أوبتودي تتكون فقط من مؤشر في مصفوفة البوليمر. والي جانب العديد من المؤشرات الأخرى الممكنة O2 يمكن تضمين20 التي يمكن ان تستخدم إضافات ، اي عوامل نثر مثل تيو2 أو مسحوق الماس2 لزيادة اشاره الاستشعار مع الحد من الشفافية لأوبتودي. كما يمكن استخدام اصباغ اضافيه لتعزيز كثافة الاشاره عن طريق نقل الطاقة41.
لتلفيق أوبتودي مستو ، ونحن نوصي باستخدام الفجوة في جهاز طلاء سكين من 75-120 μm لتسفر عن سماكه طبقه الاستشعار النهائي من حوالي 7.5 إلى 12 ميكرومتر بعد تبخر المذيبات (حوالي 10 ٪ من الفجوة المستخدمة) ، عند استخدام الاستشعار وصفها تكوين كوكتيل. هذا هو حل وسط جيد بين كثافة الاشاره ، والتي يمكن تعديلها من قبل اعلي التحميل صبغ ، أو عن طريق اختيار المؤشرات والاصباغ المرجعية لسطوع اعلي ، ووقت الاستجابة. وتؤدي الزيادة في سماكه الطبقة إلى زيادة في وقت الاستجابة ، حيث ان الفترة الزمنيه اللازمة للتحليل للوصول إلى توازن دينامي حراري في طبقه الاستشعار مع الوسائل الاعلاميه المحيطة تزيد12.
أوبتوديس ، كما هو موضح هنا ، تتفاعل مع التغيرات في O2 تركيز في غضون ثوان قليله17 في حين لا تزال لديها اشاره التلالؤ قويه بما فيه الكفاية. ويمكن تحقيق الطلاء الاستشعار ultrathin مع أوقات الاستجابة الثانية الفرعية مع الطلاء الدوار6. إذا كان الدعم أو الجهاز طلاء سكين ليست جيده التنظيف ، فانه قد يؤدي إلى طبقات الاستشعار غير متجانسة. أيضا ، عندما الكوكتيل ليس متجانسا تماما أو تطبيقها بسرعة كبيره بعد الانتشار امام جهاز الطلاء مثل هذه النتيجة غير المرغوب فيها يمكن ملاحظتها. لذلك ، قد تحتاج إلى بعض الممارسة لاعداد الأوبتوديس الأمثل.
ويمكن استخدام هذه الطريقة لعينات الصورة التي يمكن وضعها في اتصال وثيق لأوبتودي ، مثل بعضال42البحرية الحيوانية ، والاغشيه البيولوجية6 والتربة31 فقط علي سبيل المثال لا الحصر. نقدم الاعداد مستقل باستخدام هدف ، ومع ذلك ، يمكن بسهوله ان يقترن الكاميرا إلى المجهر لاعلي دقه التصوير الكيميائي43.
في حين ان المجال الزمني القائم علي الاناره الضوئية مدي الحياة تمكين قمع الخلفية الفلورية26، وهذا هو مشكله عند استخدام نظام الكاميرا الجديدة التي تعتمد علي مجال التردد8. ونظرا لاكتساب الصورة المستمرة ، فان هذه الكاميرا سوف تسجل اي مضان الخلفية من العينة التي يمكن ان تكون متحمسة لل LED المحددة وتنبعث في النافذة الطيفية المحددة كما هو محدد من قبل فلتر الانبعاثات علي هدف الكاميرا. وهذا سيؤدي إلى انخفاض العمر علي ما يبدو ، التالي في قراءات كاذبه. في حال كنت تعمل مع عينات مع الفلورية الجوهرية متداخلة مع الاثاره O2 الاستشعار والانبعاثات ، فمن الضروري لتطبيق العزلة البصرية اضافيه علي راس أوبتودي ، من خلال طلاء طبقه اضافيه تحتوي علي الكربون الأسود2،17. وهكذا ، فقط التلالؤ المنبعثة من أوبتودي مستو سوف تصل إلى الكاميرا. من أجل التحقق من الخلفية التلالؤ صوره دون أوبتودي يمكن اتخاذها ، والتي من شانها ان تظهر بشكل حصري التلالؤ الجوهري للعينه. ومن الممكن أيضا أضافه عوامل نثر مثل تيو2 أو مسحوق الماس2،44، إلى كوكتيل الاستشعار ، لزيادة كثافة التلالؤ من صبغ المؤشر. ومع ذلك ، وهذا يمكن ان يؤدي أيضا إلى أسرع تبييض الصور و TiO2 هو الصورة المعروفة محفز ، والتي يمكن ان تضعف الثبات الضوئي لصبغه41. وهناك جانب آخر للنظر هو ضوء الخلفية. عند التصوير عمر التلالؤ ، يجب تجنب ضوء الخلفية بأكبر قدر ممكن من الكفاءة. ولذلك ، فان طريقه التصوير هذه تتطلب وضع الاعداد في بيئة مظلمة ويجب إيقاف اي مصدر ضوء خارجي مؤقتا اثناء الحصول علي الصورة.
باختصار ، التصوير مدي الحياة التلالؤ هو أسلوب التصوير الكيميائي قويه التي يمكن تكييفها مع العديد من التطبيقات المختلفة. يغطي هذا البروتوكول (انظر القسم 1-5) جميع الخطوات الاساسيه لتوليد صوره O2 ويستخدم نظام التصوير مدي الحياة الأكثر مرونة حاليا في مجال الترددات ، والذي يمكن ان يحل محل كاميرا النطاق الزمني المتوقفة المغلقة للتصوير ثنائي الابعاد O2 مع أوبتوديس مستو.

ويوفر توزيع وديناميات الغازات والأيونات الذائبة في الرواسب والتربة معلوماتأساسيه عنالعمليات البيوجيوكيميائيه مثل التنفس الميكروبي1أو2أو فقدان الأكسجين الشعاعي من جذور النبات3و4و5والبيئة الكيميائية المجهرية للميكروبات6و7و رهيزوسفيريس5و8و9 11و12. ويمكن للنشاط البيولوجي والكيميائي في هذه البيئات المحدودة الانتشار ان يخلق تدرجات شديده من الركائز الكيميائية أو منتجات العمليات البيوجيوكيميائيه. علي وجه الخصوص ، O2 التوافر له تاثير كبير علي العمليات البيوجيوكيميائيه التالي بيولوجيا وإيكولوجيا نظام13. ولذلك ، فان تحليل التركيزات O2 في الاستبانة المكانية والزمانيه العالية له اهميه قصوى في العلوم المائية والارضيه. الاولي ، تم تطوير الكهروكيميائية والضوئية ميكرونسيرس14،15 لقياس هذا التحلل الهامه. في وقت لاحق ، تم إدخال 2 الابعاد (2d) التصوير من O2 مع مستو أوبتوديس12،16،17،18،19، والتي مكنت التصور والتقدير الكمي للتوزيع غير المتجانسة O2 في التربة والرواسب.
مستو O2 أوبتوديس تتكون من o2-الحساسة صبغ المؤشر20، الذي يذوب في البوليمر مناسبه21. الصبغة المؤشر هو متحمس في موجات بصريه محدده وتنبعث الضوء الأحمر تحولت علي الاسترخاء في شكل التلالؤ. في وجود O2، يمكن لصبغ مؤشر متحمس نقل طاقتها إلى o2 جزيء عند الاصطدام ، والذي يشار إلى الاصطدام القائم علي التلالؤ التبريد22. لذلك ، يتم تقليل كثافة التلالؤ وكذلك عمر التلالؤ مع زيادة O2 تركيز23. في حاله مثاليه التغيير في كثافة والعمر يتبع معادله ستيرن فولمر (المعادلة 1) باستخدام اما كثافة التلالؤ أو العمر في غياب (I0؛ τ0) أو وجود (i, τ) من O2 في تركيز معين [Q]. [ستيرن-فولمر] ثابته ([ك] [سف]) مقياس للحساسية من ال أوبتودي نحو [أو]2; يعتمد KSV علي المتغيرات البيئية مثل درجه الحرارة والضغط.
1<img align="center" src="/files/ftp_upload/60191/60191eq1.jpg">
يمكن استخدام تسجيل هذه التغييرات في التلالؤ علي رقاقه استشعار مستو مع نظام الكاميرا لتصور التغييرات المقابلة في O2 التوزيع. في البداية ، واستخدمت بسيطه التلالؤ القائم علي كثافة O2 التصوير18. ومع ذلك ، فان هذه المنهجية حساسة جدا للتدخلات الخارجية ، والتي تعرض للخطر موثوقيه النتائج بسبب الاضاءه غير المتجانسة ، والتقلبات في مصدر الاثاره أو الكاميرا ، فضلا عن التوزيع غير المتساوي لصبغه المؤشر داخل الأوبتودي المستو.
ويمكن التخفيف من بعض هذه القيود باستخدام الأوبتوديس المستو للتصوير الإشعاعي17،24، حيث يتم تعبئة المؤشر o2-الحساسة في طبقه البوليمر من الأوبتودي مستو مع صبغ مرجع غير حساس ينبعث منه في نطاق طيفي مختلف عن o2-المؤشر. واستنادا إلى صور الانبعاثات المكتسبة في إطارين طيفيين ، تقسم اشاره الانبعاثات الحساسة O2إلى اشاره مرجعيه ، مما يولد صوره نسبه اقل عرضه للتدخلات المذكورة أعلاه5و17. الأسلوب يتطلب استخدام صبغه ثانيه ، والتي من الناحية المثالية يمكن ان تكون متحمسة من قبل نفس مصدر الاثاره ، ولكن تنبعث علي طول موجي مختلف (دون تداخل طيفي كبير) ، في نافذه طيفيه أخرى من الكاميرا (علي سبيل المثال ، في قناه لون آخر من كاميرا RGB).
بدلا من ذلك ، O2 يمكن ان تستند التصوير علي تحديد كميه التغيير الذي يعتمد علي2في العمر التلالؤ لصبغه المؤشر ، والتي لا تتاثر الاضاءه متفاوتة أو تغاير في تركيز مؤشر25. وكانت التلالؤ الاولي التي تستند إلى مدي الحياة O2 نظم التصوير تستند إلى قياسات النطاق الزمني مع البوابة القادرة علي الجهاز المرتبط بنظام الكاميرا (CCD)26، حيث يتم استخدام مصدر الاثاره نابض وتؤخذ الصور التلالؤ علي فترات زمنيه محدده داخل الاثاره أو الانبعاثات من المؤشر8،23،27. من مثل هذه الصور ، يمكن تحديد عمر التلالؤ ويرتبط بالتركيز O2 المطابق في المعايرة. وفي وقت لاحق ، يمكن تحويل الصور مدي الحياة التلالؤ لعينه معينه الضغط علي أوبتودي مستو إلى صور للتوزيع 2D المقابلة من تركيز O2 . وقد استخدم هذا النظام في العديد من التطبيقات علي حد سواء في المختبر وفي الموقع16,28, ولكن الكاميرا الاساسيه CCD بوابه قادره لم تعد متاحه تجاريا.
في الاونه الاخيره ، تم الإفراج عن نظام الكاميرا مدي الحياة التلالؤ مختلفه ، والتي تكتسب الصور في مجال التردد8. يعتمد النظام علي مصدر ضوء التضمين بشكل مستمر للاثاره. يمكن ان يكون هذا اما الموجه الحلقية أو المربعة بدلا من الاثاره النبضي ، والذي يستخدم للحصول علي صوره في المجال الزمني. ينتج هذا التشكيل في انبعاث التلالؤ التضمين من O2 صبغ المؤشر ، والذي يتم أزاحه المرحلة من زاوية ، φ ، والذي يعتمد علي عمر التلالؤ من صبغ المؤشر (τ) (انظر المعادلة 2).
2<img align="center" src="/files/ftp_upload/60191/60191eq2.jpg">
التغير بين الاثاره والانبعاثات السعه (اي ما يسمي مؤشر التحوير أو العمق (السعه مقسوما علي جزء التلالؤ الثابت)) يعتمد أيضا علي عمر التلالؤ. لذلك ، من خلال تحديد تردد التشكيل المعروفة الاستشعار صوره المكمل الخاصة داخل الكاميرا قادره علي قياس عمر التلالؤ في ns إلى المدى μs كما هو موضح بالتفصيل في مكان آخر 8،29،30. ويمكن الاطلاع علي دليل عام علي مبدا العملية (باستخدام الرابط التالي <a href="https://www.youtube.com/watch?v=xPAB_eVWOr8" target="_blank">https://www.youtube.com/watch?v=xPAB_eVWOr8</a>).
في البروتوكول التالي ، ونحن نظهر استخدام نظام الكاميرا الرواية لتصوير توزيع O2 تركيز حول جذور المياه العذبة المائية نبات littorella اونيفلورا في 2d9،31. ونود ان نشدد علي ان هذه الطريقة لا تقتصر علي هذا التطبيق بأي حال من الأحوال. أوبتوديس حساسة للأكسجين أو جزيئات الاستشعار27 في تركيبه مع طرق التصوير المختلفة وقد استخدمت في البحوث الطبية32, في بيورينتينغ33, للضغط الحساسة الدهانات34,35, أو لدراسة أنظمه التصوير الضوئي2,36,37, فقط لتسميه بضعة مجالات أخرى من التطبيق.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Air pump with air stone and water pump</td>
			<td>Local aquarium store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>67-66-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC4 silicone compound</td>
			<td>Dow Corning GmbH</td>
			<td>2793695</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas mixer</td>
			<td>V&#246;gtlin Instruments GmbH</td>
			<td>red-y compact meter GCM</td>
			<td>This is just one possible instrument. Several companies offer gas mixing devices</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass plates and aquaria</td>
			<td>Local aquarium or hardware store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Freely available imaging software (imagej.nih.gov/ij/index.html)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knife-coating device</td>
			<td> 
			 
			BYK-GARDNER GMBH byk.com</td>
			<td>2021</td>
			<td>This is a four sided film applicator enabling easy variation of the film thickness. Other versions are also available. We recommend a thickness of the applied film between 75-120 &#181;m, which yields a final sensor layer thickness of ~10% of the applied thickness before solvent evaporation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED lamp, Reflector PAR38</td>
			<td>Megaman</td>
			<td>MM17572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED LEDHUB</td>
			<td>Omicon Laserage, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Can be configured with a variety of LEDs. For the presented example, the green LED (528 nm) is essential</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LOCTITE AA 3494</td>
			<td>Henkel AG &#38; Co. KGaA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Acrylic-based instant adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements AR Software</td>
			<td>Nikon Inc</td>
			<td></td>
			<td>Software package used for image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pco.flim</td>
			<td>PCO AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Frequency domain based luminescence lifetime camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>platinum(II)-5,10,15,20-tetrakis-(2,3,4,5,6-pentafluorphenyl)-porphyrin (PtTFPP)</td>
			<td>Frontier Scientific</td>
			<td>PtT975</td>
			<td>O2 indicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene terephthalate (PET) foil</td>
			<td>Goodfellow</td>
			<td>320-992-72</td>
			<td>Such foils might also be found from other providers and serve as solid support</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene (PS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9003-53-6</td>
			<td>Polymer matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schott RG610 filter</td>
			<td>www.uviroptics.com</td>
			<td></td>
			<td>Here 52mm screw on Filters can obtained. Other sources offer square glass filters from Schott glass that can be fixed in front of the objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl electrical tape</td>
			<td>Scotch, Super 33+</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Makro Planar 2/100 with Hama C for Nikon adaptor</td>
			<td>delivered with the camera</td>
			<td></td>
			<td>Here any other objective might also be used in combination with an adaptor if the objective does not have a C-mount</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

luminescence lifetime imaging of o2 with a frequency-domain-based camera system

نحن وصف طريقه لصوره الأكسجين المذاب (O2) ، في 2d في المكانية عاليه (< 50-100 μm) والزمنيه (< 10 ق) القرار. يستخدم الأسلوب O2 الحساسة الاناره رقائق الاستشعار (مستو أوبتوديس) في تركيبه مع نظام الكاميرا المتخصصة للتصوير العمر التلالؤ في مجال التردد. يتم اعداد أوبتوديس مستو عن طريق حل O2-الحساسة صبغ المؤشر في البوليمر ونشر الخليط علي دعم الصلبة في سمك محدده عن طريق طلاء سكين. بعد تبخر من المذيب, وضعت أوبتودي مستو في اتصال قريبه مع العينة الفائدة-هنا يبرهن مع الجذور من النبات مائية [ ليتوريا] [اونيفلور]. التغيير الذي يعتمد علي تركيز O2 في عمر التلالؤ لصبغه المؤشر داخل الأوبتودي المستوه يتم بواسطة المؤخر لرقاقه الحامل الشفافة وجدار حوض السمك باستخدام كاميرا خاصه. هذه الكاميرا يقيس عمر التلالؤ (μs) عن طريق التحول في زاوية المرحلة بين اشاره الاثاره التضمين واشاره الانبعاثات. هذه الطريقة متفوقة علي أساليب التصوير كثافة التلالؤ ، والاشاره مستقله عن تركيز الصبغة أو كثافة مصدر الاثاره ، ويعتمد فقط علي وقت تسوس التلالؤ ، وهو معلمه المشار اليها جوهريا. التالي ، لا حاجه إلى صبغه مرجعيه اضافيه أو وسائل أخرى للرجوع اليها. ونحن نظهر استخدام نظام التصوير المجهري O2 لرهيزوسفيريس النباتية ، ولكن يمكن أيضا بسهوله ان يقترن نظام الكاميرا إلى المجهر.

كمثال تطبيق لنظام التصوير الجديد ، ونحن نظهر 2d O2 التصوير من العينة البيولوجية المعقدة (اي ، جذور النباتات المائية littorella اونيفلورا).
أولا ، يصف الأسلوب تلفيق فيلم استشعار مستو ، ما يسمي أوبتودي مستو. وكما يتبين من الشكل 1، فان هذه الأوبتودي مصنوعة من طبقه رقيقه من المؤشر الضوئي في مصفوفة البوليمر التي تنتشر علي دعم شفاف. باتباع البروتوكول الموصوف ، يتم الحصول علي فيلم استشعار متجانسة مع سماكه موحده ، كما هو محدد من قبل الفجوة من جهاز طلاء سكين. إذا كان الأوبتودي المنتجة لديها توزيع المواد استشعار غير مكتمل (علي سبيل المثال ، ثقوب في الطلاء ، ويظهر المشارب ، أو صبغ المجاميع (وهذا يمكن تقييمها بصريا ، وبصريا مع مساعده من مصباح الاشعه فوق البنفسجية)) ، والبروتوكول يحتاج إلى تكرار وجميع المواد تحتاج إلى تنظيفها بدقه باستخدام الأسيتون.
وبمجرد ان يتم اعداد أوبتودي مستو ، يمكن جلب العينة في اتصال وثيق مع طبقه الاستشعار من الأوبتودي مستو ، كما هو مبين هنا مع الأوبتودي مستو متكاملة في غرفه جذور-ساندويتش ، حيث جذور النبات داخل مصفوفة الرواسب المحيطة يمكن وضعها في اتصال وثيق إلى الأوبتودي مستو (الشكل 2). إذا أعدت بشكل صحيح ، يجب ان تكون غرفه جذور-ساندويتش المنقولة بسهوله من حوض واحد (الحضانة) إلى أخرى (القياس). إذا لم يتم بناؤها بشكل صحيح ، قد تكون الغرفة الخاصة بالساندوتشات القابلة لتثبيت ، تفقد الرواسب أو تحتوي علي فقاعات الهواء. التالي يوصي بالفحص البصري للغرفة التي يتم فيها الساندوتش مباشره بعد التجميع.
ويتيح البروتوكول المعطي التصوير مدي الحياة القائم علي نطاق التردد للعينه في اتصال مع الأوبتودي المستو باستخدام كاميرا مدي الحياة المضيءه القائمة علي مجال التردد. مزيد من التفاصيل حول هذا النظام الكاميرا مثل وضع اكتساب الصورة والعلمية التكميلية المعادن أكسيد أشباه الموصلات (scmos) وترد خصائص الكاميرا في المنشورات الاخيره8,29.
الاعداد نفسه بسيط نوعا ما ويشمل فقط الكاميرا التي تتحكم في مصدر الضوء (في هذه الحالة ، مصدر أثاره الصمام) والعينة مع أوبتودي (الشكل 3). تاكد من ان جميع الأجزاء متصلة بشكل صحيح وان العينة مضيئه بتجانس. يجب تجنب ضوء الخلفية اثناء اجراء القياسات المسبقة.
قبل تصوير العينة ، يحتاج الأوبتودي إلى معايره. كما راينا في الشكل 4ا، ينخفض عمر التلالؤ المقاسه مع زيادة O2 التركيز بعد تسوس شبه اسي. ويمكن أيضا وصف هذه العلاقة باستخدام نموذج الموقعين المبسط (الشكل 4باء والمعادلة 3). وفي المثال المحدد ، كانت المعلمات اللازمة لحساب التركيز O2 علي النحو التالي ؛ τ0 = 56.26 μs ، KSv = 0.032 hPa-1 و f = 0.86.
يعد اجراء المعايرة أيضا طريقه مثاليه لاختبار ان النظام يعمل بشكل صحيح. إذا تم تثبيت كافة المكونات كما هو موضح هنا (أو ضمن إرشادات الشركات المصنعة) ، يجب ان تظهر العمر المقاسه نفس O2 التبعية كما هو مبين في الشكل 4. الاضافه إلى ذلك ، لنفس المزيج من المواد الاستشعار O2 (البوليمر والصبغة) ، يجب ان يكون قياس0 τ في نفس النطاق (± بضعة μs) كما يقاس هنا (تتاثر أساسا من درجه الحرارة التجريبية). إذا كان غير قادر علي الحصول علي منحني معايره مماثله ، تاكد من ان كافة الخطوات التي تم اتباعها بشكل صحيح. في بعض الأحيان يتم إصلاح أوبتودي بطريق الخطا مع الجانب الحساسة التي تواجه الجدار الزجاجي بدلا من العينة ، أو الصور المكتسبة هي الإفراط في أو المكشوف.
مع معلمات المعايرة ، من الممكن تحديد تركيز O2 عن طريق تصوير عمر التلالؤ (τ). ويتجلى هذا في الشكل 5ا ، ب، حيث كان توزيع التركيز O2 في الغلاف من النباتات littorella اونيفلورا في الظلام وبعد التعرض للضوء إلى 500 ميكرومول الفوتونات م-2 s-1 ل 12 h ، علي التوالي. بسبب النشاط الضوئي للمصنع ، زاد تركيز O2 في الجذور بعد التعرض للضوء. بالاضافه إلى صور مدي الحياة ، يمكن أيضا الحصول علي صور "هيكليه" تحت أضاءه خارجيه ، مع الحفاظ علي هندسه التصوير الثابتة. وبهذه الطريقة ، يمكن ان تكون الصور O2 مرتبطة بشكل دقيق بالصورة الهيكلية (الشكل 5ج) أو المقاطع المتقاطعة أو المناطق ذات الاهميه. وعلي سبيل المثال ، استخرجت ملامح التركيز O2 عبر جذر واحد من الصورة المكتسبة في الظلام والضوء ، علي التوالي (الشكل 5د).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60191/60191fig1a.jpg"> الشكل 1: تصنيع مستو O2 أوبتودي. (ا) يتم تثبيت إحباط أليفه علي لوحه زجاجيه ويتم وضع جهاز طلاء سكين علي إحباط. (ب) يتم نشر كوكتيل المستشعر المعد علي رقائق PET كخط رفيع امام جهاز طلاء السكاكين. (ج) يتم نقل الجهاز سكين الطلاء إلى أسفل لنشر كوكتيل الاستشعار كفيلم رقيقه علي إحباط PET ، والتي بعد المذيبات التبخر النتائج في استعداد لاستخدام مستو أوبتودي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60191/60191fig1alarge.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60191/60191fig2a.jpg"> الشكل 2: المجلس التجمع الغرفة مع التكامل من مستو O2 أوبتودي. (ا) يتم تثبيت أوبتودي علي واحده من لوحات زجاجيه باستخدام فيلم المياه. (B) يتم لصقها أوبتودي إلى لوحه مع الشريط الكهربائي. (ج) تملا الرواسب في اللوحة المتقابلة بالفواصل المرفقة (اي شرائح المجهر). (د) توضع جذور النبات علي الرواسب الموزعة بالتساوي. (ه) الغرفة التي تم إغلاقها وتثبيتها مؤقتا مع المشابك. (و) مغلقه بالبالكامل وتجميعها غرفه جذور-ساندويتش. (ز) لحماية الأوبتودي من التعرض الخفيف بواسطة مصباح الحضانة ولتجنب نمو الطحالب يوضع غطاء بلاستيكي فوق الغرفة المجمعة التي تضم ساندويتش. (ح) الغرفة التي تم احتضانها في حوض السمك. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60191/60191fig2alarge.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60191/60191fig3a.jpg"> الشكل 3: اعداد التصوير الذي يحتوي علي كاميرا مدي الحياة المضيءه التي تعتمد علي النطاق الترددي ، مع تركيز الهدف علي العينة مع الأوبتودي من الخلف عبر الحوض الشفاف وجدران الحجرات التي تحتوي علي الساندويتش. يتم وضع الدليل الضوئي لمصدر أثاره الصمام للقاء الضوء علي العينة بالتساوي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60191/60191fig3alarge.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60191/60191fig4a.jpg"> الشكل 4: منحنيات المعايرة لمستو O2 أوبتودي. (ا) المدةالمختلفة لتفسفر التي تقاس بتركيزات O2 الخاصة في غرفه المعايرة المملوءة بالمياه. (ب) مؤامرة ستيرن-فولمر لبيانات المعايرة المجهزة باستخدام نموذج الموقعين المبسط للتبريد الحركي الدينامي (المعادلة 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60191/60191fig4alarge.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60191/60191fig5a.jpg"> الشكل 5: التصوير مدي الحياة للتوزيع O2 في جذور النبات المائي littorella اونيفلورا. (ا) O2 التوزيع بعد الحفاظ علي المصنع تحت الضوء لمده 12 ساعة في حوالي 500 ميكرومول الفوتونات م-2 s-1. (ب) O2 التوزيع بعد الحفاظ علي النبات في الظلام ل 1 ح. (ج) الصورة الهيكلية لجذور النبات كما شوهدت من خلال الأوبتودي المستو. (د) المقطع العرضي O2 للتركيزات (يشار إلى الموقع بالخط الأصفر في اللوحة A و B) بعد 12 ساعة في الضوء (احمر) و 1 ساعة في الظلام (اسود). تكييفها مع اذن من (كورين ، ك. ، Moßhalm ، m. ، شولز ، v. V. ، بوريموف ، اس ام ، Holst ، g. ، كوهل ، m. التلالؤ التصوير مدي الحياة من أجهزه الاستشعار الكيميائية-مقارنه بين المجال الزمني والتردد المجال أنظمه الكاميرا القائمة. كيمياء تحليليه. 91 (5), 3233-3238, doi: 10.1021/acs. analchem. 8b05869 (2019)). حقوق التاليف والنشر (2019) الجمعية الكيميائية الامريكيه. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60191/60191fig5alarge.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Luminescence Lifetime Imaging of O2 with a Frequency-Domain-Based Camera System at JoVE.com

Luminescence Lifetime Imaging of O2 with a Frequency-Domain-Based Camera System

ونحن نقدم وصفا لاستخدام الرواية ، والتردد-المجال التلالؤ كاميرا مدي الحياة لرسم الخرائط 2D O2 التوزيعات مع رقائق الاستشعار البصرية. يتم وصف نظام الكاميرا وإجراءات تحليل الصور إلى جانب اعداد ومعايره وتطبيق رقائق الاستشعار لتصور البيئة الدقيقة O2 في جذور النباتات المائية.

التلالؤ التصوير مدي الحياة من O2 مع تردد-نظام الكاميرا المستندة إلى المجال

We describe a method to image dissolved oxygen (O2), in 2D at high spatial (&#60; 50-100 &#181;m) and temporal (&#60; 10 s) resolution. The method employs ...

كما قبول أفضل الإلكترون، يلعب الأكسجين دورا حاسما في النظم البيولوجية. مع هذا البروتوكول، يمكنك صورة توزيع الأكسجين في 2D باستخدام optode. بالإضافة إلى دقة المكانية والزمانية العالية ، لا تتطلب هذه الطريقة صبغة مرجعية إضافية ، وهي قوية للغاية ، وتسمح بالحصول على صورة هيكلية.يمكن تطبيق هذه الطريقة على مختلف مجالات البحث التي يلعب فيها الأكسجين دوراً رئيسياً بما في ذلك علم البيئة والبحوث الطبية والطباعة الحيوية والطباعة الحساسة للضغط. يمكن أن يكون تلفيق optode تحدياً حيث أن كمية الكوكتيل المضافة إلى احباط الدعم وسرعة سحب جهاز طلاء السكين قد تتطلب التحسين والممارسة. مع هذا الفيديو المساهمة ، ونحن نريد أن تجعل هذه التقنية القوية في متناول الباحثين من مجالات أخرى للدراسة.لإعداد optode الأكسجين مُنطَع، استخدم أولاً فيلم من الماء أو 70٪ الإيثانول لإصلاح رقائق PET نظيفة خالية من الغبار على لوحة زجاجية نظيفة. ضع جهاز طلاء سكين 120 ميكرومتر نظيف على احباط واستخدام ماصة زجاجية لتطبيق خط كوكتيل الاستشعار أمام الجهاز. المقبل، اسحب جهاز طلاء سكين ببطء وبشكل موحد على احباط PET لنشر كوكتيل بالتساوي.ثم جفف optode الأكسجين المُنطَر المُنَهَج في الهواء المحيط لمدة ساعة واحدة قبل التجفيف بين عشية وضحاها في خزانة ساخنة عند 50 إلى 60 درجة مئوية. بحلول صباح اليوم التالي، سيكون قد تم الحصول على ما يقرب من 12 ميكرومتر طبقة سميكة. قم بتخزين optode المحمي من الضوء حتى الاستخدام الإضافي.لإعداد غرفة rhizo-sandwich، استخدم لاصقة فورية خفيفة تعتمد على الأكريليك للصق شرائح المجهر على طول حواف لوحة زجاجية تترك حافة طويلة مفتوحة. قطع optode planar في الشكل والحجم المطلوبة لتناسب في الفضاء بين شرائح المجهر لصقها ووضع optode على داخل لوحة الزجاج الأمامي مع الجانب المغلفة صعودا. الشريط حافة واحدة من احباط optode إلى لوحة زجاجية وإضافة ماء الصنبور بين لوحة الزجاج واحباط optode.خفض ببطء احباط على قطرات الماء مما يسمح لل optode لتصويب نفسها على سطح الزجاج واستخدام الأنسجة الرخوة لإزالة بعناية فقاعات الهواء المحاصرين بين optode واللوحة. ثم مسح لوحة زجاجية جافة وشريط حواف المتبقية من احباط لوحة. بعد ذلك، استخدم لوحة زجاجية مسطحة لتوزيع رواسب غربال 0.5 ملليمتر بالتساوي عبر اللوحة إلى نفس سمك تباعد شرائح المجهر.تنظيف بعناية السطح العلوي من الشريحة المجهر لضمان أن لوحة الزجاج الثاني الأختام الغرفة بشكل صحيح وتطبيق الشحوم سيليكون على سطح الشريحة المجهر. ثم تغطية الرواسب مع طبقة رقيقة من الماء مع تجنب بعناية تشكيل فقاعات الهواء. قبل وضع عينة على الرواسب، وغسل بعناية تبادل لاطلاق النار واحد من uniflora Littorella ووضع تبادل لاطلاق النار على الرواسب مع الأوراق الشائكة من الجانب المفتوح العلوي.عندما تكون العينة في مكانها، ضع اللوحة الزجاجية مع optode على الرواسب والضغط لطيف لجعل optode في اتصال وثيق مع جذور النبات والرواسب المحيطة بها. استخدم المشابك لربط اللوحات معًا وتجفيف الحواف الخارجية بورق الأنسجة. إضافة مرارا وتكرارا بضع قطرات من الماء إلى الأوراق للحفاظ على النبات رطب في جميع أنحاء الجمعية من ساندويش rhizo واستخدام الشريط الكهربائي الفينيل لتشد على غرفة rhizo ساندويتش.ثم ختم حواف مع الطين النمذجة وشريط كهربائي إضافي. للتحضير للتصوير، وإزالة احباط تغطية من منطقة optode بعد الحضانة ووضع غرفة rhizo ساندويتش مع الجدار الزجاجي مع optode تستقيم ضد جدار الحوض. استخدام مُتباعدة للضغط على غرفة رهيزو ساندويتش ضد الجدار.ضع كاميرا مدى الحياة التي تستند إلى مجال التردد مزودة بهدف أمام الحوض ومنطقة الاهتمام. إرفاق مرشح الانبعاثات مناسبة لتصوير صبغة المؤشر إلى هدف الكاميرا وإصلاح دليل الضوء في مصدر الإثارة LED. ثم ضع الدليل بحيث يضيء بالتساوي احباط optode اللوحي الذي يغطي منطقة الاهتمام.في برنامج التصوير، حدد الكاميرا وحدد LED في برنامج التحكم في LED. تعيين كثافة LED حسب الحاجة ووضع علامة التناظرية والمزامنة لتأكيد أن يتم تشغيل LED من قبل منطق الترانزستور الخارجية. التركيز يدويا الكاميرا وضبط فتحة الهدف وتعيين مصدر التشكيل الداخلي، موجة جيبي للموجة الناتج، أخذ عينات المرحلة إضافية، عينات من ثماني مراحل، ترتيب المرحلة المعاكس، اضغط A B قراءات، وخمسة كيلو هرتز تردد التشكيل.ضبط وقت التعرض حتى منطقة منطقة اهتمام إحصاءات قراءة للصورة كثافة التاشين تطبيع في نطاق 0.68 إلى 0.72. ثم انقر فوق التقاط مرجع لبدء الحصول على سلسلة قياس مرجع. لمعايرة optode، استخدم جهاز خلط الغاز لطرد الماء في حوض السمك معايرة مع خليط غاز النيتروجين الهواء المحيط مع تركيز الأكسجين المعروفة رصد تركيز الأكسجين مع مسبار خارجي مع جهاز استشعار الأكسجين.ثم الحصول على سلسلة من الصور في تركيزات مختلفة من الأوكسجين في غرفة المعايرة للحصول على منحنى مناسب لمعطيات المعايرة المكتسبة. عندما يتم معايرة النظام، قم بإيقاف تشغيل الأضواء التي تطبق التشعيع على المصنع وجميع مصادر الضوء الأخرى وضبط وقت الاكتساب استنادًا إلى كثافة الصورة لضمان عدم تجاوز الإشارة أو ضعفها بشكل جيد بالنسبة لنسبة إشارة إلى ضوضاء في تحديد مدى الحياة. عندما تم الحصول على جميع الصور مدى الحياة الأكسجين، تشغيل الأضواء مرة أخرى للحصول على صورة هيكلية والحصول على صورة مع مسطرة في مجال الرؤية لتمكين التحجيم اللاحقة من الصور المكتسبة.قبل تصوير العينة، يجب معايرة optode. بعد انحلال شبه أسي، يقلل عمر الإنارة المقاس مع زيادة تركيز الأكسجين. يمكن أيضاً وصف هذه العلاقة باستخدام نموذج الموقعين المبسط.بمجرد معايرة optode ، من الممكن تحديد تركيز الأكسجين عن طريق تصوير عمر الإنارة كما لوحظ في هذه الصور التي تم فيها تصوير توزيع تركيز الأكسجين في رهيزوفير Littorella uniflora بعد التعرض للضوء 500 فوتونات ميكرومول لكل متر مربع في الثانية لمدة 12 ساعة وبعد 12 ساعة في الظلام. بالإضافة إلى الصور مدى الحياة، يمكن الحصول على الصور الهيكلية تحت الإضاءة الخارجية مع الحفاظ على هندسة التصوير ثابتة للسماح للتصوير الأكسجين أن تكون مرتبطة بدقة إلى الصورة الهيكلية. ويمكن بعد ذلك استخراج ملامح تركيز الأكسجين عبر جذر واحد على سبيل المثال من الصور المكتسبة في الظلام والضوء.من المهم أن يكون هناك اتصال جيد بين مصفوفة العينة و optode لتجنب القطع الأثرية غير الضرورية. إذا كنت في شك، إعادة تشكيل شطيرة. يتيح الحصول الفوري على صورة بطريقة غير تدميرية مراقبة بيئة الأكسجين.قد يكون الأسلوب كذلك جنبا إلى جنب مع optodes أخرى للhH أو غيرها من التحليلات. تأكد من تنفيذ تلفيق optode في غطاء الدخان كما يحتوي على كوكتيل استشعار الكلوروفورم. يمكن استخدام optodes بلانار لتحديد المجتمعات الميكروبية في الرواسب.وبعد التصوير، يمكن فتح الساندويتش لتذوق هذه النقاط الساخنة لتحليل المجتمع الميكروبي.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Luminescence Lifetime Imaging of O2 with a Frequency-Domain-Based Camera System

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

إعداد خلايا منتسب للتصوير الإسفار الأشعة السينية من قبل التثبيت الكيميائية

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Water in Oil Emulsions: A New System for Assembling Water-soluble Chlorophyll-binding Proteins with Hydrophobic Pigments

الماء في مستحلب النفط: نظام جديد لتجميع البروتينات ملزم الكلوروفيل المياه القابلة للذوبان مع أصباغ مسعور

Chlorophylls (Chls) and bacteriochlorophylls (BChls) are the primary cofactors that carry out photosynthetic light harvesting and electron transport. ...

Visualization of Ambient Mass Spectrometry with the Use of Schlieren Photography

تصور المحيطة الطيف الكتلي مع استخدام انعراجي التصوير الفوتوغرافي

This manuscript outlines how to visualize mass spectrometry ambient ionization sources using schlieren photography. In order to properly optimize the mass ...

A Simple, Low-cost, and Robust System to Measure the Volume of Hydrogen Evolved by Chemical Reactions with Aqueous Solutions

A، منخفضة التكلفة وبسيطة، ونظام دقيق لقياس حجم الهيدروجين المتصاعد من التفاعلات الكيميائية مع المحاليل المائية

There is a growing research interest in the development of portable systems which can deliver hydrogen on-demand to proton exchange membrane (PEM) ...

Measurements of Long-range Electronic Correlations During Femtosecond Diffraction Experiments Performed on Nanocrystals of Buckminsterfullerene

قياسات للارتباطات الإلكترونية البعيدة المدى خلال تجارب حيود Femtosecond على نانوكريستالس بوكمينستيرفوليريني

The precise details of the interaction of intense X-ray pulses with matter are a topic of intense interest to researchers attempting to interpret the ...

Time-resolved Photophysical Characterization of Triplet-harvesting Organic Compounds at an Oxygen-free Environment Using an iCCD Camera

حل وقت الحصاد "التوصيف الثلاثي فوتوفيسيكال المركبات العضوية" في خالية من الأكسجين "البيئة باستخدام" الوثيقة iCCD الكاميرا

Here, we present a sensible method of the acquisition and analysis of time-resolved photoluminescence using an ultrafast iCCD camera. This system enables ...

Regioselective O-Glycosylation of Nucleosides via the Temporary 2',3'-Diol Protection by a Boronic Ester for the Synthesis of Disaccharide Nucleosides

Regioselective O-Glycosylation of Nucleosides via the Temporary 2',3'-Diol Protection by a Boronic Ester for the Synthesis of Disaccharide Nucleosides

ريجيوسيليكتيفي س-جليكوسيليشن من نوكليوسدس عن طريق المؤقتة 2 '، 3'-ديول الحماية إستر برونك لتركيب نوكليوسدس ديساكهارايد

Disaccharide nucleosides, which consist of disaccharide and nucleobase moieties, have been known as a valuable group of natural products having ...

Synthesis and Structure Determination of &#181;-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities

Synthesis and Structure Determination of ÃƒÆ’Ã¢â‚¬Å¡Ãƒâ€šÃ‚Âµ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities

التوليف وتصميم هيكل الايزومرات بييا μ-كونوتوكسين مع Connectivities ثنائي كبريتيد مختلفة

Peptides with a high number of cysteines are usually influenced regarding the three-dimensional structure by their disulfide connectivity. It is thus ...

Automation of a Positron-emission Tomography (PET) Radiotracer Synthesis Protocol for Clinical Production

Automation of a Positron-emission Tomography PET Radiotracer Synthesis Protocol for Clinical Production

التشغيل الآلي لانبعاث البوزيترون الطبقي (PET) Radiotracer التوليف بروتوكول للإنتاج السريرية

The development of new positron-emission tomography (PET) tracers is enabling researchers and clinicians to image an increasingly wide array of biological ...

Solid Phase 11C-Methylation, Purification and Formulation for the Production of PET Tracers

Solid Phase 11C-Methylation, Purification and Formulation for the Production of PET Tracers

المرحلة الصلبة 11ج-ميثيل ، تنقيه وصياغة لإنتاج المتتبعين PET

Routine production of radiotracers used in positron emission tomography (PET) mostly relies on wet chemistry where the radioactive synthon reacts with a ...