Name: luminescence lifetime imaging of o2 with a frequency-domain-based camera system
Uploaded: 2019-12-16T14:00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Luminescence Lifetime Imaging of O2 with a Frequency-Domain-Based Camera System at JoVE.com

Vi takker Sofie Lindegaard Jakobsen (Københavns Universitet) og Lars Borregaard Pedersen (Aarhus Universitet) for teknisk assistance. Finansieringen af denne undersøgelse blev hentet fra et avanceret tilskud fra Sapere-Aude fra den uafhængige forskningsfond Danmark (DFF-1323-00065B; MK), projekttilskud fra den uafhængige forskningsfond Danmark | Naturvidenskab (DFF-8021-00308B; MK) & tekniske og produktionsteknikker (DFF-8022-00301B og DFF-4184-00515B; ), Danmarks National Research Foundation (DNRF136) og Poul Due Jensen Foundation (KK).

1. fabrikation af planar O2 optode
<ol><li>1,5 mg af det luminescerende O2 -indikatorfarve stof platin (II)-5 opløses, 10, 15, 20-tetrakis-(2, 3, 4, 5, 6-pentafluorphenyl)-Porphyrin (PtTFPP) og 100 mg POLYSTYREN (PS) i 1 g chloroform for at få den såkaldte ' sensor cocktail '. Bemærk: cocktailen kan opbevares i et lukket, gastæt hætteglas i et par timer i køleskab og mørke indtil videre brug.</li>
	<li>Fastgør en ren, støvfri polyethylenterephthalat (PET) folie (størrelse afhængig af applikationen) på en renset glasplade ved hjælp af et vand eller ethanol (70%) film (figur 1A).</li>
	<li>Anbring den rensede kniv belægnings anordning (120 μm) på folien, og Anvend en linje af sensor cocktailen foran enheden med en glas pipette (figur 1B). Træk derefter kniv-belægnings anordningen langsomt og ensartet over PET-folien for at sprede cocktailen jævnt. Bemærk: alle materialer og værktøjer skal rengøres grundigt, og fremstillingen skal ske i et støvfrit miljø, såsom en stinkhætte, flow bænk eller under en punkt sugeanordning. For at undgå forskelligartethed i den endelige sensor folie skal trinene efter påføring af sensor cocktail på folien ske hurtigt, da chloroform fordamper hurtigt.</li>
	<li>Tør det færdige planar O2-følsomme optode i luften i 1 time og derefter over natten i et varme kabinet ved 50-60 °c, hvilket resulterer i en sidste lagtykkelse efter opløsningsmiddel fordampning på ~ 12 μm. Opbevar de fremstillede optoder i mørke (f. eks. i en papir konvolut) indtil videre brug (figur 1C). Bemærk: planar O2 optodes kan opbevares tørt og i mørke i flere måneder til år før brug. En sidste lagtykkelse, der spænder fra 1-20 μm, har vist sig at give gode resultater med tilstrækkeligt luminescens signal og passende responstider.</li>
</ol>2. rhizo-sandwich kammer
<ol><li>Rengør to glasplader (24,5 x 14 cm2, tykkelse: 4 mm) med 96% ethanol.</li>
	<li>Brug let-helbredelig, akryl-baseret instant klæbemiddel (Se tabel over materialer) til at lime mikroskop slides (76 x 26 mm2, tykkelse: 1 mm) langs kanterne af den første glasplade (dvs. den bageste kammer side), mens efterlader en lang kant åben. Brug en glasscutter til at afkorte mikroskop slides efter behov. Forsigtig: skæring glas kan forårsage skarpe kanter og bør håndteres med omhu. Bemærk: mikroskop diasene fungerer som afstandsstykker mellem forsiden og bagsiden, og afhængigt af tykkelsen af rødderne og anlæggets størrelse kan flere lag mikroskop slides Limes oven på hinanden.</li>
	<li>Skær planar optode i den ønskede form og størrelse for at passe ind i rummet mellem de limede mikroskop slides. Placer den på indersiden af den forreste glasplade med den coatede side opad for at give mulighed for kontakt med prøven af interesse, når den presses mod den.</li>
	<li>Tape den ene kant af optode-folien på glaspladen og tilsæt nogle få dråber vand mellem glaspladen og optode-folien (figur 2a). Langsomt sænke folien på disse vanddråber gør det muligt at rette sig ud på glasoverfladen.</li>
	<li>Fjern forsigtigt luftbobler fanget i-mellem planar optode og glaspladen ved hjælp af et blødt væv, og undgå ridser af sensor belægningen. Aftør glaspladen tørt, og tape de resterende kanter af optode-folien på glaspladen (figur 2B). Bemærk: der skal vælges et bånd med passende vedhæftning under vand.</li>
	<li>Sedimentet med en maskestørrelse på 0,5 mm. Anbring en ske med vådt sediment på den første glasplade (figur 2C). Bemærk: maskestørrelsen må ikke være større end halvdelen af afstands tykkelsen.</li>
	<li>Fordel sedimentet jævnt og Juster det til samme tykkelse som mikroskop glide afstandsstykker ved hjælp af en flad glasplade. Rengør forsigtigt den øvre overflade på mikroskop gliderne for at sikre, at den anden glasplade forsegler kammeret korrekt.</li>
	<li>Anvend silicium fedt på mikroskop slide overfladen. Dæk sedimentet med en tynd vand folie, mens du forsigtigt undgår dannelsen af luftbobler.</li>
	<li>Vask forsigtigt et enkelt skud af Littorella uniflora og Placer det på sedimentet, med planten blade stikker ud fra den øvre åbne side (figur 2D).</li>
	<li>Den anden glasplade placeres med optode fastgjort på sedimentet, og der påføres et forsigtigt Tryk for at bringe optode i tæt kontakt med planterødderne og det omgivende sediment. Bemærk: luftbobler, der er fanget i sedimentet, kan fjernes ved at vippe glaspladerne og samtidig samle dem.</li>
	<li>Fastgør glaspladerne sammen ved hjælp af klemmer (figur 2E). Tør de ydre kanter med silkepapir. Hold bladene fugtet i hele samlingen af rhizo-sandwich (f. eks. ved hyppig tilsætning af et par dråber vand).</li>
	<li>Stram rhizo-sandwich kammer ved hjælp af vinyl elektrisk tape. Forsegle kanterne med modellering ler og derudover tape dem med vinyl elektrisk tape (figur 2F). Bemærk: Hvis der er mange luftbobler i sedimentet eller sedimentkerner mellem spacer mikroskopet og den anden glasplade, skal kammeret samles igen, da porevand kan sive ud (Gentag trin 2,4-2,8).</li>
	<li>Brug en uigennemsigtig plastik til at dække rhizo-sandwich, men lad en slids i folien for planten blade til at holde ud. Skær et vindue i plastikfolie, så det kan åbnes for eksperimenter ved at udfolde sig. Luk vinduet under akklimatiserings tider ved hjælp af elastikker (figur 2G) for at beskytte optode mod foto blegning, mens planten inkuberet. Bemærk: da algevækst potentielt kan forstyrre O2 koncentrationer målt, anbefaler vi at forsøge at minimere det ved hjælp af filtreret vand, forrenset eksperimentelt udstyr og fjernelse af alger ved dannelse.</li>
</ol>3. rhizo-sandwich kammer inkubation
<ol><li>Placer rhizo-sandwich kammeret i en vandtank (32 x 7 x 28 cm3) i en lidt skrå position for at tilskynde til rodvækst mod planar optode.</li>
	<li>Fyld vandbeholderen med nok vand til helt at nedsænkes plante bladene.</li>
	<li>Etablere en 14 h lys, 10 h mørk cyklus for akklimatisering af planten ved hjælp af en tids kontrolleret lampe. Placer en luft-sten eller en vandpumpe i tanken for at sikre beluftning og blanding af vandet (figur 2H).</li>
</ol>4. billeddannelse
<ol><li>Opsætning af Imaging
	<ol>
<li>Fjern plastfolie, der dækker planar optode i rhizo-sandwich kammeret. Placer kammeret med glasvæggen med optode opretstående mod akvariet væggen. Brug en spacer til at trykke rhizo-sandwich kammer mod akvariet væggen. Bemærk: den samlede tykkelse af akvariet væggen plus rhizo-sandwich kammer væggen bør ikke blive for tyk, dog, glastykkelser til Aquaria vægge for luminescens billeddannelse anbefales med > 1 cm, for at reducere rumlig Cross-Talk ved at øge dæmpningen af scattered lys. Det er vigtigt, at bruge det samme materiale til begge glasvægge (samme ildfaste indeks), for at minimere lysspredning på materialets grænseflade; da dette ville føre til et sløret billede samt12.</li>
		<li>Placer det frekvens-domænebaserede luminescens livstids kamera, der er udstyret med en objektiv (Se tabel over materialer) foran akvariet og det område af interesse (rødder af vand planten littorella uniflora, som er i direkte kontakt med planar Optode) (figur 3). Bemærk: kameraet kan placeres på et laboratorie stativ for at give mulighed for nem højdejustering af kameraet. Placeringen af laboratoriet står skal mærkes og holdes fast. Derudover kan kameraet være tapede til laboratoriet stå for at undgå utilsigtet bevægelse af kameraet under eksperimentet.</li>
		<li>Skru et egnet emissions filter til billeddannelse PtTFPP som indikatorfarve (Se tabel over materialer) på kameraets mål for at fjerne slutninger fra excitation source. Bemærk: skrue-on filtre er ideelle, men firkantede filtre kan også anvendes med enten en passende adapter, eller ved omhyggelig tape dem til målet.</li>
		<li>Tilslut en LED excitation kilde (Se tabel over materialer) til modulation og Dark Gate output af kameraet. Bemærk: førstnævnte leverer modulations signalet til lyskilden, mens sidstnævnte slukker lyset under billedsensoren. Tilslut LED-excitation-kilden og kameraet til en computer. Baggrundslyset bør minimeres under billed udlæsningen ved enten at mørklægge hele lokalet eller sætte en tæt, sort klud over hele set-up. I sidstnævnte tilfælde er det vigtigt at sikre tilstrækkelig ventilation for at undgå opvarmning af kameraet.</li>
		<li>Fastgør lysguiden i LED-excitation-kilden, og Placer den for jævnt at belyse planar optode-folien, der dækker området af interesse. Bemærk: i den anvendte LED-excitation-kilde er det muligt at skifte mellem 3 forskellige lysdioder (460 nm, 528 nm, 625 nm), hvis intensitet kan justeres via kontrol softwaren.</li>
	</ol></li>
	<li>Indstillinger og kamera betjening Bemærk: for de beskrevne eksperimenter brugte vi et frekvens-domæne-baseret Lifetime-kamera i kombination med et dedikeret modul til livstids scanning i en kommercielt tilgængelig softwarepakke (Se tabel over materialer).<ol>
<li>Vælg kameraet i den valgte software før brug. Bemærk: software-og kamera driverne skal installeres før billeddannelse efter producentens retningslinjer.</li>
		<li>Åbn LED-styringssoftwaren (igen installeret før eksperimentet påbegyndes), og vælg den passende lysdiode (her: 528 nm) ved at afkryde standby. Indstil LED-intensiteten efter behov (her til 30%). Sørg for, at LYSDIODEN udløses af den eksterne TTL; Dette gøres ved at afkryde analog og Sync for lysdioden. Bemærk: LED-intensiteten skal justeres individuelt, da for høj laser effekt kan føre til accelereret billed blegning af indikatoren eller reference farve.</li>
		<li>Fokuser kameraet og Juster blændens blænde manuelt (i den nuværende undersøgelse anvendes f = 2,8). Bemærk: det er vigtigt at fokusere kameraet på planar optode og ikke på akvariet glas; Dette kan sikres ved at tage et billede med en lineal for skalering, og fokusere på skyggen af linealen på optode, snarere end på den faktiske lineal.</li>
		<li>Angiv følgende parametre i softwarens kamera Kontrolpanel: intern modulations kilde; sinusbølge for output bølgeform; yderligere fase prøvetagning (ja) 8 fase prøver, faserækkefølge modsat, Tap på A + B udlæser; 5 kHz modulationsfrekvens. Bemærk: disse parametre påvirker billedkvaliteten og kan ændres, hvis det er nødvendigt. Producenten af kameraet giver retningslinjer for de enkelte parametre (kameraproducenten frigiver retningslinjer og opdateringer, når softwaren bliver opdateret).</li>
		<li>Tag et referencebillede før eksperimenter. Bemærk: Dette kan gøres enten ved at afbilde en kalibreringsstandard (et luminescerende farvestof med en kendt levetid (NS eller μs)) eller ved at bruge LED'S reflekterede lys. I sidstnævnte tilfælde skal emissions-Long Pass-filteret fjernes fra målsætningen, og den kendte levetid kan indstilles til 1 ns.</li>
		<li>Juster eksponeringstiden i kalibrerings afsnittet i den dedikerede billedbehandlingssoftware, indtil ROI-statistikken (i bunden af dette panel) for det normaliserede luminescens intensitets billede er i intervallet 0,68-0,72. Bemærk: nu er reference levetiden (f. eks. 1 NS) givet som input til softwaren.</li>
		<li>Tryk på Capture reference for at starte købet af en reference måleserie. Bemærk: når du er færdig, lagres Referencedataene, og der kan foretages enten enkelt-eller tidsforskudt måling på prøverne.</li>
	</ol></li>
	<li>Kalibrering af O2 optode
	<ol>
<li>Placer et stykke af en planar O2-følsom optode i et (lille) glas akvarium. Fastgør planar optode på glasvæggen i kalibrerings kammeret som beskrevet tidligere (se punkt 2,3). Placer kalibrerings akvariet foran kameraet. Sørg for selv belysning ved LYSDIODEN, samt at optode fylder hele synsfeltet. Bemærk: planar optode skal være fra det samme stykke folie eller fremstillet af den samme sensor cocktail som den folie, der anvendes i det egentlige eksperiment.</li>
		<li>Fyld akvariet med det samme flydende medium som anvendt i forsøgene. Bemærk: brug af forskellige medier til kalibreringer og eksperimenter kan påvirke målingen (f. eks. ved at ændre sensor respons og/eller O2 opløselighed). Således bør kalibrering ske i samme medium, og ved samme temperatur som det egentlige eksperiment. Temperaturudsving vil påvirke luminescens signalet og bør undgås. Hvis temperaturen imidlertid ikke kan holdes stabil, skal der foretages en temperatur udligning ved at kalibrere den O2-følsomme optode (flere punkter) ved forskellige (relevante) temperaturer og efterfølgende genberegning af værdierne.</li>
		<li>Koncentrationen af O2 i kalibrerings akvariet justeres ved at skyllevandet med en luft/N2 -gasblanding af kendt O2 -koncentration ved hjælp af en gasblandings anordning. Sørg for, at vandet er godt ækvibreret med den brugte gasblanding ved at udluftning i tilstrækkelig lang tid (afhænger af strømningshastigheden og størrelsen af akvariet). Bemærk: Vi anbefaler, at du overvåger O2 -niveauet i kalibrerings akvariet med en ekstern, kalibreret o2 -sensor med temperaturkompensation (f. eks. ved hjælp af en fiberoptisk eller elektrokemisk O2 -sensor).</li>
		<li>Tag en række billeder ved forskellige O2 koncentrationer i kalibrerings kammeret. Bemærk: der skal måles mindst fem forskellige O2 -koncentrationer for at sikre en passende kurve, der passer til de erhvervede kalibreringsdata. Det er vigtigt at måle ved 0 hPa (anoxic betingelser), og derefter distribuere de andre værdier over det dynamiske område af din specifikke indikatorfarve. Her brugte vi PtTFPP som O2-følsom indikatorfarve immobiliseret i en polystyren matrix. Billeder blev taget ved 0, 48, 102, 156 og 207 hPa; 207 hPa svarer til 100% luft mætning ved den givne saltholdighed og tryk.</li>
	</ol></li>
	<li>Billedbehandling af prøven
	<ol>
<li>Placer prøven foran kameraet, og sørg for en jævn belysning.</li>
		<li>Sluk lyset, som forsyner anlægget med bestråling (og alle andre lyskilder), lige før det opkøber anlæggets luminescens levetids billede. Juster anskaffelses tiden baseret på intensitets billedet for at sikre, at signalet hverken er overmættet eller for svagt til et godt signal til støj (S/N)-forhold i livstids bestemmelsen.</li>
		<li>Udsætte anlægget for varierende lysforhold (f. eks lys/mørke) og erhverve et sæt af billeder.</li>
		<li>Tænd lyset i rummet for at erhverve et strukturelt billede. Bemærk: når baggrundslyset tændes, måler kameraet ikke et realistisk livstids billede. Dog viser intensitets billedet nu hele synsfeltet, som det ses gennem den halvgennemsigtig optode.</li>
		<li>Tag et billede med en lineal eller ens i synsfeltet for at muliggøre senere skalering af de erhvervede billeder.</li>
	</ol></li>
</ol>5. data analyse
<ol><li>Eksporter fase levetiden og intensitets billeder direkte fra den dedikerede billedbehandlingssoftware ved hjælp af den makro, der leveres af kameraproducenten.</li>
	<li>Udføre yderligere billedanalyse ved hjælp af en frit tilgængelig billedanalyse software (Se tabel over materialer).</li>
	<li>Åbn fase levetids billeder af kalibreringen i billedanalyse softwaren, og bestem middelværdien for hele billedet ved hjælp af funktionen measure. De målte levetid afbildes i forhold til de kendte O2 -koncentrationer for at bestemme kalibreringsfunktionen (figur 4A).</li>
	<li>Beregn τ0/τ fra alle data (τ0 er den målte fase levetid i fravær af O2). Disse værdier i forhold til de kendte O2 -koncentrationer (figur 4B).</li>
	<li>Bestem parametrene KSV og f fra kalibrerings plottet ved hjælp af den forenklede to-site model for dynamisk kollisions dæmpning (ligning 3)38,39 hvor [Q] er O2 koncentrationen. Definer funktionen Tilpas i dataanalyse softwaren, som derefter bestemmer KSV og f.</li>
</ol>3<img align="center" src="/files/ftp_upload/60191/60191eq3.jpg">
<ol start="6"><li>Åbn de erhvervede prøve billeder i billedanalyse softwaren for at konvertere de afbildet levetid til O2 koncentrationer ved hjælp af de fastsatte parametre KSV, f og τ0. Bemærk: som en alternativ tilgang kan de erhvervede kalibrerings fasers levetids værdier (figur 4A) også anvendes direkte. I dette tilfælde bruges en eksponentiel pasform ved hjælp af funktionen kurvetilpasning til kalibrering.</li>
	<li>Åbn billedet med linealen ved siden af billedanalyse softwaren, og mål en kendt distance ved hjælp af måleværktøjet. Angiv denne måling som global skala under set Scale.</li>
</ol>

Forfatteren Gerhard Holst er ansat i PCO AG, som fremstiller det kamerasystem, der anvendes i denne artikel. PCO AG bidrog finansielt til offentliggørelsen og omkostningerne ved åben adgang til denne artikel.

I denne protokol er hele arbejdsstrømmen fra optode Preparation til O2 billedanalyse dækket. Ved at følge denne protokol, kan kemiske billeder opnås ved hjælp af den nye frekvens-domæne-baserede luminescens levetid kamera. Afhængigt af applikationen kan planar optodes fremstilles i forskellige størrelser og lagtykkelse af sensor laget, der spænder fra robuste 50-100 μm tykke planar optodes af flere tiendedele af kvadratcentimeter til mikroskop Cover glider med < 1 μm tykke sensor lag6,40. Potentialet ved denne metode blev påvist med en bestemt anvendelse, men er ikke kun begrænset til O2 billeddannelse i plante rhisfærer12,28.
Denne metode har flere fordele i forhold til ren luminescens intensitetsbaserede kemiske billedbehandlings metoder. Luminescens levetid Imaging er ikke, eller i det mindste langt mindre, påvirket af ujævn belysning, ujævn optode tykkelse, og foto blegning25. Denne metode undgår også brugen af et yderligere reference farvestof, som er almindelig i ratiometrisk billeddannelse17,37. I sammenligning med andre Lifetime baserede kamerasystemer, såsom almindeligt anvendte gated time-Domain kameraer8,26, den nye kamerasystem og protokol præsenteret her kan levere sammenlignelige resultater. I en nylig publikation blev de analytiske karakteristika for disse to systemer sammenlignet, og det konstateredes, at det frekvens-domænebaserede luminescens livstids kamerasystem i det mindste kan sammenlignes med den udgåede tid-domænebaserede forgænger8.
Vi har præsenteret den enkleste O2 optode kun består af en indikator i en polymermatrix. Udover flere andre mulige O2 indikatorer20 , der kan anvendes tilsætningsstoffer kan medtages, dvs spredning agenter såsom TiO2 eller Diamond Powder2 at øge sensor signal samtidig reducere gennemsigtigheden af optode. Yderligere farvestoffer kan også bruges til at forbedre signal intensiteten via energioverførsel41.
For planar optode fabrikation anbefaler vi at bruge et hul i kniv-belægnings anordningen på 75-120 μm til at give en endelig sensor lagtykkelse på ca. 7,5 til 12 μm efter fordampning af opløsningsmiddel (ca. 10% af det anvendte hul), når den beskrevne sensor cocktail sammensætning anvendes. Dette er et godt kompromis mellem signalintensitet, som kan ændres ved højere farvestof lastning, eller ved at vælge indikator og reference farvestoffer af højere lysstyrke, og responstid. En forøgelse af lagtykkelsen resulterer i en stigning i responstid, da det tidsrum, der kræves, for at analytten kan nå en termodynamisk ligevægt i det følende lag med de omgivende medier, stiger12.
Optodes, som beskrevet her, reagerer på ændringer i O2 koncentrationen inden for få sekunder17 , mens der stadig er et tilstrækkeligt stærkt luminescens signal. Ultratynde sensor belægninger med sub-sekund responstider kan realiseres med spin-coating6. Hvis støtte-eller kniv belægnings anordningen ikke er velrengjort, kan det resultere i inhomogene sensor lag. Også, når cocktailen ikke er helt homogen eller anvendes for hurtigt efter spredning foran belægningen anordning sådan et uønsket resultat kan observeres. Derfor, det kan have brug for nogle praksis til at forberede optimale optodes.
Metoden kan bruges til at billed prøver, som kan sættes i tæt kontakt til optode, såsom visse Marine dyr42, biofilm6 og jord31 bare for at nævne nogle få. Vi præsenterer en standalone setup ved hjælp af et mål, men kameraet kan nemt kobles til et mikroskop for højere opløsning kemisk billeddannelse43.
Mens tids domænebaseret luminescens levetid Imaging aktiveret undertrykkelse af baggrunden fluorescens26, dette er et problem, når du bruger den nye frekvens-domæne-baserede kamerasystem8. På grund af den kontinuerlige billed erhvervelse, vil dette kamera optage enhver baggrunds fluorescens af prøven, der kan blive ophidset af den valgte LED og udsender i det valgte spektral vindue som defineret af emissions filteret på kameraets mål. Dette vil resultere i en tilsyneladende lavere levetid og dermed i falske aflæsninger. Hvis du arbejder med prøver med en signifikant iboende fluorescens overlapning med O2 sensor excitation og emission, er det vigtigt at anvende en ekstra optisk isolering på toppen af optode, ved belægning et ekstra lag indeholdende Carbon Black2,17. Således vil kun luminescens udsendt fra planar optode nå kameraet. For at kontrollere baggrunds luminescens kan der tages et billede uden optode, som så udelukkende ville vise prøvens iboende luminescens. Det er også muligt at tilføje spredning agenter såsom TiO2 eller Diamond Powder2,44, til sensoren cocktail, at øge luminescens intensitet af indikatoren farvestof. Dette kan dog også føre til hurtigere foto blegning og TiO2 er en kendt foto-katalysator, som kan forringe foto stabilitet af et farvestof41. Et andet aspekt at overveje, er baggrundslys. Ved billeddannelse af luminescens levetid skal baggrundslyset undgås så effektivt som muligt. Derfor kræver denne billedbehandlings metode, at opsætningen placeres i et mørkt miljø, og at enhver ekstern lyskilde skal slukkes midlertidigt under billed anskaffelsen.
Kort sagt er luminescens livstids Imaging en robust kemisk billedbehandlings metode, der kan tilpasses til mange forskellige anvendelser. Denne protokol (Se afsnit 1-5) dækker alle de væsentlige trin til at generere en O2 billede og bruger den aktuelt mest fleksible frekvens-domæne luminescens levetid Imaging system, som kan erstatte den ophørte gated tids domæne kamera til 2D O2 Imaging med planar optodes.

Fordelingen og dynamikken af opløste gasser og ioner i sedimenter og jord giver vigtige oplysninger om biogeokemiske processer såsom mikrobiel respiration1,2eller radial ilttab fra planterødder3,4,5og det kemiske mikromiljø af mikrober6,7, plante rhisfærer5,8,9 og dyre Burrows10, 11,12. Biologisk og kemisk aktivitet i sådanne diffusions begrænsede miljøer kan skabe stejle stigninger i kemiske substrater eller produkter af biogeokemiske processer. Især, O2 tilgængelighed har en enorm indflydelse på biogeokemiske processer og dermed biologi og økologi i et system13. Derfor, analysere O2 koncentrationer ved høj rumlig og tidsmæssig opløsning er af afgørende betydning i akvatiske og terrestriske videnskaber. For det første blev der udviklet elektrokemiske og optiske mikrosensorer14,15 til måling af denne vigtige analysand. Senere, 2 dimensionelle (2D) billeddannelse af o2 med planar optodes blev introduceret12,16,17,18,19, som gjorde det muligt visualisering og kvantificering af heterogene O2 fordeling i jord og sedimenter.
Planar O2 optodes består af en O2-følsom indikatorfarve20, som opløses i en egnet polymer21. Indikatoren farvestof er spændt på specifikke optiske bølgelængder og udsender rødt forskudt lys ved afslapning i form af luminescens. I nærværelse af O2, kan den spændte indikatorfarve overføre sin energi til O2 molekyle ved kollision, som omtales som kollisions baseret luminescens dæmper22. Derfor reduceres luminescens intensitet og luminescens levetid med stigende O2 -koncentration23. I et ideelt tilfælde følger ændringen i intensitet og levetid den Stern-Volmer ligning (ligning 1) ved hjælp af enten luminescens intensitet eller levetid i fravær (i0; τ0) eller tilstedeværelse (i, τ) af O2 ved en given koncentration [Q]. Stern-Volmer-konstanten (KSV) er en målestok for optode-følsomheden mod O2; KSV er afhængig af miljøvariabler såsom temperatur og tryk.
1<img align="center" src="/files/ftp_upload/60191/60191eq1.jpg">
Registrering af sådanne ændringer i luminescens over en planar sensor folie med et kamerasystem kan bruges til at visualisere de tilsvarende ændringer i O2 fordeling. I første omgang blev der anvendt en simpel luminescens intensitet-baseret O2 -afbildning18. Men, en sådan metode er meget følsom over for eksterne interferenser, som kompromitterer pålideligheden af resultaterne på grund af heterogene belysning, udsving i excitation kilde eller kamera, samt ujævn fordeling af indikatoren farvestof i planar optode.
Nogle af disse begrænsninger kan afhjælpes ved at anvende planar optodes til ratiometrisk billeddannelse17,24, hvor den o2-følsomme indikatorfarve er co-immobiliseret i polymer laget af planar optode med et ufølsomt reference farvestof, der udsender i et andet spektralområde end o2-indikatoren. Baseret på emissions billeder erhvervet i to spektral vinduer, det O2-følsomme emissions signal er divideret med reference signalet, genererer et forhold billede, der er mindre tilbøjelige til ovennævnte interferenser5,17. Metoden kræver brug af et andet farvestof, som ideelt set kan blive ophidset af den samme excitation kilde, men udsender på en anden bølgelængde (uden signifikant spektral overlap), i et andet spektral vindue af kameraet (f. eks, i en anden farvekanal af et RGB-kamera).
Alternativt kan O2 -billeddannelse baseres på kvantificering af o2-afhængig ændring i luminescens levetid for indikatorfarve stoffet, som ikke påvirkes af ujævn belysning eller heterogeniteter i indikator koncentrationen25. Første luminescens levetids baserede O2 -billedbehandlingssystemer var baseret på tidsdomæne målinger med et Gate-able opladet Device (CCD)-kamerasystem26, hvor der anvendes en pulserende excitation-kilde, og luminescens billeder tages over definerede tidsintervaller inden for excitation eller emission af indikatoren8,23,27. Fra sådanne billeder kan luminescens levetid bestemmes og korreleres til den tilsvarende O2 -koncentration i en kalibrering. Efterfølgende kan luminescens livstids billeder for en given prøve, der trykkes mod planar optode, konverteres til billeder af den tilsvarende 2D-fordeling af O2 -koncentrationen. Dette system er blevet anvendt i mange applikationer både i laboratoriet og in situ16,28, men det essentielle Gate-able CCD-kamera er ikke længere kommercielt tilgængeligt.
For nylig blev et andet luminescens livstids kamerasystem frigivet, som erhverver billeder i frekvens-domæne8. Systemet er afhængig af en kontinuerligt moduleret lyskilde til excitation. Dette kan enten være en sinusformet eller firkantet bølge i stedet for en pulserende excitation, som bruges til billed erhvervelse i tids domænet. Denne graduering resulterer i en moduleret luminescens emission af O2 -indikatorens farvestof, som er fase forskudt af en vinkel, φ, som er afhang af indikatorens luminescens levetid (τ) (Se ligning 2).
2<img align="center" src="/files/ftp_upload/60191/60191eq2.jpg">
Ændringen mellem excitation og emission amplitude (dvs. det såkaldte modulations indeks eller dybde (amplitude divideret med den konstante luminescens del)) er også afhængig af luminescens levetid. Så ved at indstille en kendt modulationsfrekvens er den specielle CMOS-billedsensor i kameraet i stand til at måle luminescens levetid i NS til μs-området som beskrevet i detaljer andetsteds 8,29,30. En generel vejledning om Operations princippet kan findes (ved hjælp af følgende link <a href="https://www.youtube.com/watch?v=xPAB_eVWOr8" target="_blank">https://www.youtube.com/watch?v=xPAB_eVWOr8</a>).
I den følgende protokol viser vi brugen af det nye kamerasystem til billeddannelse fordelingen af O2 koncentration omkring rødderne af den akvatiske ferskvands plante littorella uniflora i 2D9,31. Vi vil gerne understrege, at denne metode på ingen måde er begrænset til denne applikation. Oxygen-følsomme optodes eller sensor partikler27 i kombination med forskellige billeddannelses metoder har været anvendt i medicinskforskning 32, i bioprinting33, for trykfølsommaling 34,35, eller at studere fotosyntetiske systemer2,36,37, bare for at nævne et par andre anvendelsesområder.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Air pump with air stone and water pump</td>
			<td>Local aquarium store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>67-66-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC4 silicone compound</td>
			<td>Dow Corning GmbH</td>
			<td>2793695</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas mixer</td>
			<td>V&#246;gtlin Instruments GmbH</td>
			<td>red-y compact meter GCM</td>
			<td>This is just one possible instrument. Several companies offer gas mixing devices</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass plates and aquaria</td>
			<td>Local aquarium or hardware store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Freely available imaging software (imagej.nih.gov/ij/index.html)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knife-coating device</td>
			<td> 
			 
			BYK-GARDNER GMBH byk.com</td>
			<td>2021</td>
			<td>This is a four sided film applicator enabling easy variation of the film thickness. Other versions are also available. We recommend a thickness of the applied film between 75-120 &#181;m, which yields a final sensor layer thickness of ~10% of the applied thickness before solvent evaporation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED lamp, Reflector PAR38</td>
			<td>Megaman</td>
			<td>MM17572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED LEDHUB</td>
			<td>Omicon Laserage, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Can be configured with a variety of LEDs. For the presented example, the green LED (528 nm) is essential</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LOCTITE AA 3494</td>
			<td>Henkel AG &#38; Co. KGaA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Acrylic-based instant adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements AR Software</td>
			<td>Nikon Inc</td>
			<td></td>
			<td>Software package used for image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pco.flim</td>
			<td>PCO AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Frequency domain based luminescence lifetime camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>platinum(II)-5,10,15,20-tetrakis-(2,3,4,5,6-pentafluorphenyl)-porphyrin (PtTFPP)</td>
			<td>Frontier Scientific</td>
			<td>PtT975</td>
			<td>O2 indicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene terephthalate (PET) foil</td>
			<td>Goodfellow</td>
			<td>320-992-72</td>
			<td>Such foils might also be found from other providers and serve as solid support</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene (PS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9003-53-6</td>
			<td>Polymer matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schott RG610 filter</td>
			<td>www.uviroptics.com</td>
			<td></td>
			<td>Here 52mm screw on Filters can obtained. Other sources offer square glass filters from Schott glass that can be fixed in front of the objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl electrical tape</td>
			<td>Scotch, Super 33+</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Makro Planar 2/100 with Hama C for Nikon adaptor</td>
			<td>delivered with the camera</td>
			<td></td>
			<td>Here any other objective might also be used in combination with an adaptor if the objective does not have a C-mount</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

luminescence lifetime imaging of o2 with a frequency-domain-based camera system

Vi beskriver en metode til at afbilde opløst ilt (O2), i 2D ved høj rumlig (< 50-100 μm) og tidsmæssig (< 10 s) opløsning. Metoden beskæftiger O2 følsomme lysende viser sensor folier (planar optodes) i kombination med en specialiseret kamerasystem til billeddannelse luminescens levetid i frekvens-domæne. Planar optodes fremstilles ved at opløse den O2-følsomme indikatorfarve i en polymer og sprede blandingen på en solid støtte i en defineret tykkelse via kniv belægning. Efter fordampning af opløsningsmidlet anbringes planar optode i tæt kontakt med prøven af interesse-her demonstreret med rødderne af vand planten Littorella uniflora. Den O2 koncentrationsafhængige ændring i luminescens levetid for indikator farven i planar optode er afbildet via bagsiden af den gennemsigtige bære folie og akvarie væggen ved hjælp af et særligt kamera. Dette kamera måler luminescens levetid (μs) via et skift i fase vinklen mellem et moduleret excitation-signal og et emissions signal. Denne metode er bedre end luminescens intensitet Imaging metoder, da signalet er uafhængig af farvestoffet koncentration eller intensitet af excitation kilde, og udelukkende er afhængig af luminescens forfald tid, som er en iboende refereret parameter. Der er derfor ikke behov for yderligere reference farve eller andre henvisnings midler. Vi demonstrerer brugen af systemet til makroskopisk O2 billeddannelse af plante jord stængkugler, men Kamerasystemet kan også nemt kobles til et mikroskop.

Som et eksempel på anvendelsen af det nye billedbehandlingssystem viser vi 2D O2 -billeddannelse af en kompleks biologisk prøve (dvs. rhizosfæren af vand planten littorella uniflora).
For det første beskriver metoden fabrikation af en planar sensor film, en såkaldt planar optode. Som det ses i figur 1, er en sådan optode lavet af et tyndt lag af en optisk indikator i en polymermatrix, der spredes på en gennemsigtig støtte. Ved at følge den beskrevne protokol opnås en homogen sensor film med en ensartet tykkelse, som defineret af hullet i kniv belægnings anordningen. Hvis den producerede optode har en ujævn sensor materiale fordeling (f. eks huller i belægningen, viser striber, eller farvestoffer aggregater (dette kan evalueres visuelt, og visuelt ved hjælp af en UV-lampe)), skal protokollen gentages, og alle materialer skal rengøres grundigt ved hjælp af acetone.
Når planar optode er tilberedt, kan prøven bringes i tæt kontakt med det følende lag af planar optode, som vist her med planar optode integreret i et rhizo-sandwich kammer, hvor rødderne af et anlæg i en omgivende sediment matrix kan placeres i tæt kontakt med planar optode (figur 2). Hvis det tilberedes korrekt, skal rhizo-sandwich kammeret let kunne flyttes fra et akvarium (inkubation) til det andet (måling). Hvis det ikke er konstrueret korrekt, kan rhizo-sandwich kammeret være instable, tabe sediment eller indeholde luftbobler. Visuel undersøgelse af rhizo-sandwich kammeret umiddelbart efter montering anbefales derfor.
Den givne protokol giver mulighed for frekvens-domænebaseret luminescens livstids afbildning af prøven i kontakt med planar optode ved hjælp af det frekvens-domænebaserede luminescens levetids kamera. Flere detaljer om dette kamerasystem, såsom tilstanden af billed erhvervelse og videnskabelige komplementære metal-oxid-halvleder (scmos) kameraegenskaber er givet i de seneste publikationer8,29.
Selve opsætningen er ret enkel og omfatter kun kameraet, der styrer en lyskilde (i dette tilfælde en LED-excitation-kilde) og prøven med optode (figur 3). Sørg for, at alle dele er korrekt tilsluttet, og at prøven belyses ensartet. Baggrundslyset skal undgås under præforme målinger.
Forud for billeddannelse af prøven skal optode kalibreres. Som det ses i figur 4A, aftager den målte luminescens levetid med stigende O2 -koncentration efter en kvasieksponentiel nedbrydning. Dette forhold kan også beskrives ved hjælp af den forenklede to-site model (figur 4B og ligning 3). I det givne eksempel blev de parametre, der var nødvendige for efterfølgende beregning af O2 -koncentrationen, fulgt. τ0 = 56,26 μs, KSV = 0,032 hPa-1 og f = 0,86.
Udførelse af en kalibrering er også en ideel måde at teste, at systemet fungerer korrekt. Hvis alle komponenter er installeret som beskrevet her (eller inden for producentens retningslinjer), skal den målte levetid vise den samme O2 -afhængighed, som det ses i figur 4. For den samme kombination af O2 -sensor materialer (polymer og farvestof) skal den målte τ0 desuden være i samme område (± et par μs) målt her (hovedsageligt påvirket af forsøgstemperaturen). Hvis der ikke kan opnås en lignende kalibreringskurve, skal du sikre dig, at alle trin er fulgt korrekt. Sommetider optode er ved et uheld fastgjort med den følsomme side vender glasvæggen i stedet for prøven, eller de erhvervede billeder er over-eller undereksponeret.
Med kalibrerings parametrene er det muligt at bestemme O2 -koncentrationen ved at afbilde luminescens levetid (τ). Dette påvises i figur 5A, B, hvor fordelingen af O2 koncentrationen i rhizosfæren af littorella uniflora blev afbildet i mørke og efter lys eksponering til 500 μmol fotoner m-2 s-1 for 12 h, hhv. På grund af den fotosyntetiske aktivitet af planten, O2 koncentrationen i rhizosfæren steg efter lys eksponering. Udover livstids billeder kan også "strukturelle" billeder erhverves under ekstern belysning, samtidig med at billedbehandlings geometrien fastholdes. På denne måde kan O2 billeder præcist korreleres til det strukturelle billede (figur 5C), tværsnit eller regioner af interesse. Som et eksempel, O2 koncentrations profiler på tværs af en enkelt rod blev udvundet fra billedet erhvervet i mørke og lys, henholdsvis (figur 5D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60191/60191fig1a.jpg"> Figur 1: fabrikation af en planar O2 optode. A) en PET-folie er fastgjort på en glasplade, og kniv belægnings anordningen anbringes på folien. B) den forberedte sensor cocktail SPREDES på PET-folien som en tynd linje foran kniv-belægnings anordningen. C) kniven-belægnings anordningen flyttes nedad for at sprede sensor cocktailen som en tynd film på PET-folien, som efter fordampning af opløsningsmidlet resulterer i en klar til brug planar optode. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60191/60191fig1alarge.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60191/60191fig2a.jpg"> Fig. 2: Rhizo-sandwich kammer samling med integration af en planar O2 optode. A) optode fastgøres på en af glaspladerne ved hjælp af en vandfilm. (B) optode klæbes fast til pladen med elektrisk tape. C) sedimentet fyldes i den modsatte plade med de vedlagte afstandsstykker (dvs. mikroskop glider). D) planterødderne anbringes på det jævnt spredte sediment. (E) rhizo-sandwich kammeret er lukket og midlertidigt fastgjort med klemmer. F) fuldt lukket og samlet rhizo-sandwich kammer. G) for at beskytte optode mod lys eksponering ved inkubations lampen og for at undgå algevækst anbringes et plastik dæksel over det samlede rhizo-sandwich kammer. H) rhizo-sandwich kammeret inkuberet i et akvarium. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60191/60191fig2alarge.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60191/60191fig3a.jpg"> Figur 3: billedbehandlings opsætning, der indeholder det frekvens-domænebaserede luminescens levetids kamera, med målet fokuseret på prøven med optode bagfra via det gennemsigtige akvarium og rhizo-sandwich kammervæggene. Lysføringen af LED-excitation-kilden er positioneret til at belyse prøven jævnt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60191/60191fig3alarge.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60191/60191fig4a.jpg"> Figur 4: kalibreringskurver for planar O2 optode. A) forskellige livstider for phosphorescens målt ved de respektive O2 -koncentrationer i det vandfyldte kalibrerings kammer. B) et agterstavns plot af kalibreringsdata, som er monteret ved hjælp af den forenklede to-site model for dynamisk kollisions dæmpning (ligning 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60191/60191fig4alarge.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60191/60191fig5a.jpg"> Figur 5: livstids afbildning af O2 -fordelingen i rhizosfæren af vand planten littorella uniflora. A) O2 fordeling efter at have holdt anlægget under lys i 12 timer ved ca. 500 μmol fotoner m-2 s-1. B) O2 fordeling efter at have holdt planten i mørke i 1 time.C) strukturelt billede af planterødderne som set gennem planar optode. D) tværsnits-O2 -koncentrations profil (placeringen indikeres af den gule linje i panel A og B) efter 12 timer i lys (rød) og 1 time i mørke (sort). Tilpasset med tilladelse fra (Koren, K., Moßhammer, M., Scholz, V. V., Borisov, S.M., Holst, G., Kühl, M. luminescence Lifetime Imaging af kemiske sensorer-en sammenligning mellem tid-domæne og frekvens-domænebaserede kamerasystemer. Analytisk kemi. 91 (5), 3233-3238, Doi: 10.1021/ACS. analchem. 8b05869 (2019)). Ophavsret (2019) det amerikanske kemikalie selskab. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60191/60191fig5alarge.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Luminescence Lifetime Imaging of O2 with a Frequency-Domain-Based Camera System at JoVE.com

Luminescence Lifetime Imaging of O2 with a Frequency-Domain-Based Camera System

Vi beskriver brugen af et nyt, frekvens-Domain luminescens livstids kamera til kortlægning af 2D O2 -distributioner med optiske sensor folier. Kamerasystemet og billedanalyse procedurerne beskrives sammen med forberedelsen, kalibreringen og anvendelsen af sensor folier til visualisering af O2 -mikromiljøet i rhizosfæren af vandplanter.

Luminescens levetid billeddannelse af O2 med et frekvens-domæne-baseret kamera system

We describe a method to image dissolved oxygen (O2), in 2D at high spatial (&#60; 50-100 &#181;m) and temporal (&#60; 10 s) resolution. The method employs ...

Som den bedste elektron acceptor, ilt spiller en afgørende rolle i biologiske systemer. Med denne protokol kan du afbilde iltfordelingen i 2D ved hjælp af en optode. Ud over sin høje rumlige og tidsmæssige opløsning, kræver denne metode ikke en ekstra reference farvestof, er ekstremt robust, og giver mulighed for erhvervelse af strukturelle image.Denne metode kan anvendes på forskellige forskningsområder, hvor ilt spiller en central rolle, herunder økologi, medicinsk forskning, bioprint og trykfølsom udskrivning. Den optode fabrikation kan være udfordrende, da mængden af cocktail tilføjet til støttefolie og kniv belægning enhed træk hastighed kan kræve optimering og praksis. Med denne video bidrag, ønsker vi at gøre denne kraftfulde teknik tilgængelig for forskere fra andre områder af undersøgelsen.For at forberede en planar ilt optode, først bruge en film af vand eller 70% ethanol til at fastsætte en ren støvfri PET folie på en ren glasplade. Placer en ren 120 mikrometer kniv belægning enhed på folien og bruge et glas pipette til at anvende en linje af sensor cocktail foran enheden. Træk derefter knivbelægningsenheden langsomt og ensartet over PET-folien for at sprede cocktailen jævnt.Tør derefter den færdige planar iltfølsomme optode i luften i en time før tørring natten over i et opvarmet kabinet ved 50 til 60 grader Celsius. Næste morgen vil der være et ca. 12 mikrometer tykt lag. Optodeen opbevares beskyttet mod lys indtil videre brug.For at forberede en rhizo-sandwich kammer, bruge lys helbredes akryl-baserede instant lim til lim mikroskop dias langs kanterne af en glasplade forlader en lang kant åben. Skær planar optode i den nødvendige form og størrelse til at passe ind i rummet mellem de limede mikroskop dias og placere optode på indersiden af den forreste glasplade med den belagte side opad. Tape den ene kant af optodefolien til glaspladen og tilsæt vand fra hanen mellem glaspladen og optodefolien.Sænk langsomt folien ned på vanddråberne, så optoden kan rette sig ud på glasoverfladen og bruge et blødt væv til forsigtigt at fjerne en luftbobler, der er fanget mellem optoden og pladen. Tør derefter glaspladen tør og tape de resterende kanter af folien til pladen. Brug derefter en flad glasplade til at fordele 0,5 millimeter si sediment jævnt over pladen til samme tykkelse som mikroskopet slide afstandstagere.Rengør omhyggeligt mikroskopslidens overflade for at sikre, at den anden glasplade forsegler kammeret korrekt og påfører silikonefedt på mikroskopets glideflade. Derefter dække sedimentet med en tynd film af vand, mens omhyggeligt undgå dannelsen af luftbobler. Før du placerer en prøve på sedimentet, omhyggeligt vaske en enkelt skyde af Littorella uniflora og placere skyde på et sediment med bladene stikker ud fra den øverste åbne side.Når prøven er på plads, anbringes glaspladen med optoden på sedimentet, og der trykkes forsigtigt for at bringe optoden i tæt kontakt med planterødderne og det omgivende sediment. Brug klemmer til at fastgøre pladerne sammen og tør yderkanterne med silkepapir. Gentagne gange tilføje et par dråber vand til bladene for at holde anlægget hydreret i hele samlingen af rhizo-sandwich og bruge vinyl elektrisk tape til at stramme rhizo-sandwich kammer.Derefter forsegle kanterne med modellering ler og ekstra elektrisk tape. For at forberede billeddannelse, fjerne den dækker folie fra optode området efter inkubation og placere rhizo-sandwich kammer med glasvæggen med optode oprejst mod akvariet væggen. Brug en afstandsbevæger til at trykke rhizo-sandwich kammer mod væggen.Placer frekvens domæne-baserede luminescens levetid kamera udstyret med et objektivt foran akvariet og området af interesse. Fastgør et egnet emissionsfilter til billeddannelse af indikatorfarvestoffet til kameraets mål, og fastgør lysguiden i LED-excitationskilden. Derefter placere guide, så det vil jævnt belyse planar optode folie, der dækker det område af interesse.I billedsoftwaren skal du vælge kameraet og vælge LED'en i LED-kontrolsoftwaren. Indstil LED-intensiteten efter behov, og sæt kryds analogt, og synkroniser for at bekræfte, at LED'en udløses af den eksterne transistor-transistorlogik. Fokuser kameraet manuelt og juster den objektive blændeåbning, og indstil den interne moduleringskilde, sinusbølge for outputbølgeformen, yderligere faseprøvetagning, ottefaseprøver, faserækkefølge modsat, tryk på A B-udlæsning og fem kilohertz-moduleringsfrekvens.Juster eksponeringstiden, indtil udlæsningen af interessestatistikområdet for billedet af den normaliserede luminescensintensitet er i intervallet 0,68 til 0,72. Klik derefter på hentningsreference for at starte anskaffelsen af en referencemålingsserie. For at kalibrere optoden skal du bruge en gasblandingsanordning til at skylle vandet i et kalibreringsakvarium med en nitrogengasblanding fra luften med en kendt iltkoncentration, der overvåger iltkoncentrationen med en ekstern sonde med en iltsensor.Derefter erhverve en række billeder på forskellige ilt koncentrationer i kalibreringskammeret for at opnå en ordentlig kurve passer til de erhvervede kalibrering data. Når systemet er kalibreret, slukkes lyset, der anvender bestråling på anlægget og alle de andre lyskilder, og anskaffelsestiden justeres på grundlag af billedets intensitet for at sikre, at signalet hverken er oversat eller for svagt til et godt signal-støj-forhold i levetidsbestemmelsen. Når alle iltlevetidsbillederne er anskaffet, skal du tænde lyset igen for at få et strukturelt billede og få et billede med en lineal i synsfeltet for at muliggøre efterfølgende skalering af de erhvervede billeder.Før prøven afstøbes, skal optoden kalibreres. Efter et kvasi-eksponentielt forfald falder den målte luminescenslevetid, efterhånden som iltkoncentrationen øges. Denne relation kan også beskrives ved hjælp af den forenklede to-site model.Når optoden er kalibreret, er det muligt at bestemme iltkoncentrationen ved at afbilde luminescenslevetiden som observeret i disse billeder, hvor fordelingen af iltkoncentrationen i rhizosfæren i Littorella uniflora blev afbildet efter lyseksponering for 500 mikromolefotoner pr. sekund i 12 timer og efter 12 timer i mørke. Ud over levetidsbilleder kan strukturelle billeder også anskaffes under ekstern belysning, samtidig med at billedgeometrien er fastgjort, så iltbilleddannelsen præcist kan korreleres til det strukturelle billede. Iltkoncentrationsprofiler på tværs af en enkelt rod kan for eksempel udvindes fra de billeder, der er erhvervet i mørke og lys.Det er afgørende at have god kontakt mellem prøvematrixen og optoden for at undgå unødvendige artefakter. Hvis du er i tvivl, så lav sandwichen. Den øjeblikkelige erhvervelse af et billede på en ikke-ødelæggende måde gør det muligt at overvåge iltmiljøet.Metoden kan lige så godt kombineres med andre optøninger til pH eller andre analysander. Sørg for at udføre optodefabrikation i en røghætte, da sensorcocktailen indeholder chloroform. Planar optoder kan bruges til at identificere mikrobielle samfund i sedimentet.Og efter billedbehandling, kan sandwich åbnes op for at prøve disse hot spots for mikrobielle samfund analyse.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Luminescence Lifetime Imaging of O2 with a Frequency-Domain-Based Camera System

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

Forberedelse vedhæftende celler for X-ray fluorescens Imaging af Chemical Fiksering

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Water in Oil Emulsions: A New System for Assembling Water-soluble Chlorophyll-binding Proteins with Hydrophobic Pigments

Vand i olie Emulsioner: Et nyt system til samling Vandopløselige klorofyl-bindende proteiner med Hydrofobe Pigmenter

Chlorophylls (Chls) and bacteriochlorophylls (BChls) are the primary cofactors that carry out photosynthetic light harvesting and electron transport. ...

Visualization of Ambient Mass Spectrometry with the Use of Schlieren Photography

Visualisering af Ambient massespektrometri med brug af Schlieren Photography

This manuscript outlines how to visualize mass spectrometry ambient ionization sources using schlieren photography. In order to properly optimize the mass ...

A Simple, Low-cost, and Robust System to Measure the Volume of Hydrogen Evolved by Chemical Reactions with Aqueous Solutions

En enkel, Lavprisselskaber og robust system til at måle volumen af ​​Hydrogen Evolved af kemiske reaktioner med vandige opløsninger

There is a growing research interest in the development of portable systems which can deliver hydrogen on-demand to proton exchange membrane (PEM) ...

Measurements of Long-range Electronic Correlations During Femtosecond Diffraction Experiments Performed on Nanocrystals of Buckminsterfullerene

Målinger af langtrækkende elektroniske korrelationer under femtosekund diffraktion eksperimenter udført på nanokrystaller af Buckminsterfullerene

The precise details of the interaction of intense X-ray pulses with matter are a topic of intense interest to researchers attempting to interpret the ...

Time-resolved Photophysical Characterization of Triplet-harvesting Organic Compounds at an Oxygen-free Environment Using an iCCD Camera

Tidsopløst Photophysical karakterisering af Triplet-høst organiske forbindelser på en ilt-frit miljø ved hjælp af en iCCD kamera

Here, we present a sensible method of the acquisition and analysis of time-resolved photoluminescence using an ultrafast iCCD camera. This system enables ...

Regioselective O-Glycosylation of Nucleosides via the Temporary 2',3'-Diol Protection by a Boronic Ester for the Synthesis of Disaccharide Nucleosides

Regioselective O-Glycosylation of Nucleosides via the Temporary 2',3'-Diol Protection by a Boronic Ester for the Synthesis of Disaccharide Nucleosides

Regioselective O- glykosylering af Nukleosider via den midlertidige 2', 3'-Diol beskyttelse af en Boronic Ester til syntese af disaccharid Nukleosider

Disaccharide nucleosides, which consist of disaccharide and nucleobase moieties, have been known as a valuable group of natural products having ...

Synthesis and Structure Determination of &#181;-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities

Synthesis and Structure Determination of ÃƒÆ’Ã¢â‚¬Å¡Ãƒâ€šÃ‚Âµ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities

Syntese og struktur bestemmelse af µ-Conotoxin PIIIA isomerer med forskellige disulfid Connectivities

Peptides with a high number of cysteines are usually influenced regarding the three-dimensional structure by their disulfide connectivity. It is thus ...

Automation of a Positron-emission Tomography (PET) Radiotracer Synthesis Protocol for Clinical Production

Automation of a Positron-emission Tomography PET Radiotracer Synthesis Protocol for Clinical Production

Automatisering af en Positron-emissions-tomografi (PET) Radiotracer syntese protokol for kliniske produktion

The development of new positron-emission tomography (PET) tracers is enabling researchers and clinicians to image an increasingly wide array of biological ...

Solid Phase 11C-Methylation, Purification and Formulation for the Production of PET Tracers

Solid Phase 11C-Methylation, Purification and Formulation for the Production of PET Tracers

Solid fase 11C-methylering, oprensning og formulering til fremstilling af PET-Tracers

Routine production of radiotracers used in positron emission tomography (PET) mostly relies on wet chemistry where the radioactive synthon reacts with a ...