Name: luminescence lifetime imaging of o2 with a frequency-domain-based camera system
Uploaded: 2019-12-16T14:00:00
Duration: 8 min 35 s
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Nous remercions Sofie Lindegaard Jakobsen (Université de Copenhague) et Lars Borregaard Pedersen (Université d'Aarhus) pour leur assistance technique. Le financement de cette étude a été obtenu à partir d'une subvention de Sapere-Aude Advanced du Fonds de recherche indépendant Danemark (DFF-1323-00065B; MK), les subventions de projet de l'Independent Research Fund Danemark (fr) Sciences naturelles (DFF-8021-00308B; MK) et sciences techniques et de la production (DFF-8022-00301B et DFF-4184-00515B; MK), la Fondation nationale danoise de la recherche (DNRF136) et la Fondation Poul Due Jensen (KK).

L'auteur Gerhard Holst est un employé de PCO AG qui fabrique le système de caméra utilisé dans cet article. PCO AG a contribué financièrement à la publication et aux coûts d'accès libre de cet article.

Dans ce protocole, l'ensemble du flux de travail de la préparation de l'optode à l'analyse d'image O2 est couvert. En suivant ce protocole, des images chimiques peuvent être obtenues à l'aide de la nouvelle caméra à vie à base de fréquence-domaine de luminescence. Selon l'application, les optodes planaires peuvent être fabriqués dans différentes tailles et épaisseur de couche de la couche de capteur allant de robustes optodes planaires de 50-100 m d'épaisseur de plusieurs dixièmes de centimètre carré à des feuillets de couverture de microscope avec des couches de capteur d'épaisseur de 'lt;1 'm6,40. Le potentiel de cette méthode a été démontré avec une application particulière, mais n'est pas seulement limité à l'imagerie O2 dans les rhizosphères végétales12,28.
Cette méthode présente plusieurs avantages par rapport aux méthodes d'imagerie chimique à base d'intensité de luminescence pure. L'imagerie à vie de Luminescence n'est pas, ou du moins beaucoup moins, affectée par l'éclairage inégal, l'épaisseur inégale d'optode, et le blanchiment de photo25. En outre, cette méthode évite l'utilisation d'un colorant de référence supplémentaire commun dans l'imagerie ratiométrique17,37. En comparaison d'autres systèmes de caméra basés sur la durée de vie, tels que les caméras de domaine du temps couramment utilisé fermé8,26, le nouveau système de caméra et le protocole présenté ici peut fournir des résultats comparables. Dans une publication récente, les caractéristiques analytiques de ces deux systèmes ont été comparées et il a été constaté que le système de caméra à vie de luminescence basé sur le domaine de fréquence est au moins comparable au prédécesseur de domaine temporel interrompu8.
Nous avons présenté l'optode O2 le plus simple, composé uniquement d'un indicateur dans une matrice de polymères. Outre plusieurs autres indicateurs Possibles O2 20 qui pourraient être utilisés additifs peuvent être inclus, c'est-à-dire, les agents de diffusion tels que TiO2 ou la poudre de diamant2 pour augmenter le signal du capteur tout en réduisant la transparence de l'optode. Aussi colorants supplémentaires pourraient être utilisés pour améliorer l'intensité du signal via le transfert d'énergie41.
Pour la fabrication d'optodes planaires, nous vous recommandons d'utiliser une lacune dans le dispositif de revêtement de couteau de 75 à 120 m pour produire une épaisseur finale de couche de capteur d'environ 7,5 à 12 m après l'évaporation du solvant (environ 10 % de l'écart utilisé), lors de l'utilisation de la composition du cocktail du capteur décrit. Il s'agit d'un bon compromis entre l'intensité du signal, qui peut être modifiée par une charge de colorant plus élevée, ou en choisissant des colorants d'indicateur et de référence d'une luminosité plus élevée, et le temps de réponse. Une augmentation de l'épaisseur de la couche entraîne une augmentation du temps de réponse, car le temps requis pour que l'analyte atteigne un équilibre thermodynamique dans la couche de détection avec les médias environnants augmentede 12.
Les optodes, comme décrit ici, réagissent aux changements de concentration d'O2 en quelques secondes17 tout en ayant un signal de luminescence suffisamment fort. Les revêtements de capteur ultraminces avec des temps de réponse de moins de seconde peuvent être réalisés avec spin-coating6. Si le support ou le dispositif de revêtement de couteau ne sont pas bien nettoyés, il pourrait entraîner des couches de capteur inhomogènes. En outre, lorsque le cocktail n'est pas complètement homogène ou appliqué trop rapidement après la propagation devant le dispositif de revêtement un tel résultat indésirable peut être observé. Par conséquent, il pourrait avoir besoin d'une certaine pratique pour préparer des optodes optimales.
La méthode peut être utilisée pour imager des échantillons qui peuvent être mis en contact étroit avec l'optode, tels que certains animaux marins42, biofilms6 et sols31 pour n'en nommer que quelques-uns. Nous présentons une configuration autonome utilisant un objectif, cependant, la caméra peut facilement être couplée à un microscope pour l'imagerie chimique de plus haute résolution43.
Alors que l'imagerie à vie basée sur le domaine du temps a permis la suppression de la fluorescence de fond26, c'est un problème lors de l'utilisation du nouveau système de caméra basé sur la fréquence-domaine8. En raison de l'acquisition d'image continue, cette caméra enregistrera n'importe quelle fluorescence de fond de l'échantillon qui peut être excitée par la LED sélectionnée et émet dans la fenêtre spectrale sélectionnée telle que définie par le filtre d'émission sur l'objectif de la caméra. Cela se traduira par une durée de vie apparemment plus faible et, par conséquent, de fausses lectures. Dans le cas où vous travaillez avec des échantillons avec une fluorescence intrinsèque significative chevauchant avec l'excitation et l'émission du capteur O2, il est essentiel d'appliquer un isolement optique supplémentaire sur le dessus de l'optode, en enrobant une couche supplémentaire contenant du noir de carbone2,17. Ainsi, seule la luminescence émise par l'optode planaire atteindra la caméra. Afin de vérifier la luminescence de fond une image sans l'optode peut être prise, qui montrerait alors exclusivement la luminescence intrinsèque de l'échantillon. Il est également possible d'ajouter des agents de diffusion tels que TiO2 ou poudre de diamant2,44, au cocktail capteur, pour augmenter l'intensité de luminescence de la teinture indicateur. Cependant, cela peut également conduire à un blanchiment photo plus rapide et TiO2 est un photo-catalyseur connu, qui peut altérer la photostabilité d'un colorant41. Un autre aspect à considérer est la lumière de fond. Lors de la durée de vie de la luminescence d'imagerie, la lumière de fond doit être évitée aussi efficacement que possible. Par conséquent, cette méthode d'imagerie nécessite que la configuration soit placée dans un environnement sombre et que toute source de lumière externe doit être temporairement désactivée lors de l'acquisition d'images.
En résumé, l'imagerie à vie de luminescence est une méthode d'imagerie chimique robuste qui peut être adaptée à de nombreuses applications différentes. Ce protocole (voir la section 1 - 5) couvre toutes les étapes essentielles pour générer une image O2 et utilise le système d'imagerie à vie de luminescence de la fréquence-domaine actuellement le plus flexible, qui peut remplacer la caméra de domaine temporel gated discontinuée pour l'imagerie 2D O2 par des optodes planaires.

La distribution et la dynamique des gaz et des ions dissous dans les sédiments et les sols fournissent des informations clés sur les processus biogéochimiques tels que la respiration microbienne1,2, ou la perte d'oxygène radiale des racines des plantes3,4,5, et le microenvironnement chimique des microbes6,7, rhizosphères végétales5,8,9 et les terriers d'animaux10, 11,12. L'activité biologique et chimique dans de tels environnements limités par la diffusion peut créer des gradients abrupts de substrats chimiques ou de produits de processus biogéochimiques. En particulier, la disponibilité O2 a un impact énorme sur les processus biogéochimiques et donc la biologie et l'écologie d'un système13. Par conséquent, l'analyse des concentrations d'O2 à haute résolution spatiale et temporelle est d'une importance primordiale dans les sciences aquatiques et terrestres. Tout d'abord, des microcapteurs électrochimiques et optiques14,15 ont été développés pour mesurer cet analyte important. Plus tard, l'imagerie 2 dimensionnelle (2D) de O2 avec optodes planaires a été introduite12,16,17,18,19, ce qui a permis la visualisation et la quantification de la distribution hétérogène O2 dans les sols et les sédiments.
Planaires O2 optodes se composent d'un O2-sensible colorant indicateur20, qui est dissous dans un polymère approprié21. Le colorant indicateur est excité à des longueurs d'onde optiques spécifiques et émet de la lumière rouge décalée sur la relaxation sous forme de luminescence. En présence de O2, le colorant indicateur excité peut transférer son énergie à la molécule O2 lors de la collision, qui est appelé étanchéité à base de collision22. Par conséquent, l'intensité de luminescence aussi bien que la durée de vie de luminescence sont réduites avec l'augmentation de la concentration d'O2 23. Dans un cas idéal, le changement d'intensité et de durée de vie suit l'équation Stern-Volmer (équation 1) en utilisant soit l'intensité de la luminescence ou la durée de vie en l'absence (I0;0) ou la présence (I, ' ) de O2 à une concentration donnée [Q]. La constante Stern-Volmer (Ksv) est une mesure de la sensibilité de l'optode vers O2; KSV dépend de variables environnementales telles que la température et la pression.
(1)<img align="center" src="/files/ftp_upload/60191/60191eq1.jpg">
L'enregistrement de tels changements de luminescence sur une feuille de capteur planaire avec un système de caméra peut être utilisé pour visualiser les changements correspondants dans la distribution O2. Initialement, l'imagerie O2 basée sur l'intensité de la luminescence simple a été utilisée18. Cependant, une telle méthodologie est très sensible aux interférences externes, qui compromettent la fiabilité des résultats en raison de l'éclairage hétérogène, des fluctuations de la source d'excitation ou de la caméra, ainsi que la distribution inégale du colorant indicateur dans l'optode planaire.
Certaines de ces limitations peuvent être atténuées en utilisant des optodes planaires pour l'imagerie ratiométrique17,24, où le colorant indicateur O2-sensibleest co-immobilisé dans la couche de polymère de l'optode planaire avec un colorant de référence insensible émettant dans une gamme spectrale différente de l'indicateur O2. Basé sur les images d'émission acquises dans deux fenêtres spectrales, le signal d'émission O2-sensibleest divisé par le signal de référence, générant une image de ratio qui est moins sujette aux interférences mentionnées ci-dessus5,17. La méthode nécessite l'utilisation d'un second colorant, qui peut idéalement être excité par la même source d'excitation, mais émet à une longueur d'onde différente (sans chevauchement spectral significatif), dans une autre fenêtre spectrale de la caméra (par exemple, dans un autre canal couleur d'une caméra RGB).
Alternativement, l'imagerie O2 peut être basée sur la quantification du changement O2-dépendantdans la durée de vie de luminescence du colorant indicateur, qui n'est pas affecté par l'éclairage inégal ou les hétérogénéités dans la concentration de l'indicateur25. Les premiers systèmes d'imagerie O2 à durée de vie de luminescence ont été basés sur des mesures de domaine temporel avec un système de caméra couplé (CCD) à périphérique couplé à la porte (CCD)26, où une source d'excitation pulsée est utilisée et où des images de luminescence sont prises sur des intervalles de temps définis dans l'excitation ou l'émission de l'indicateur8,23,27. De telles images, la durée de vie de luminescence peut être déterminée et corrélée à la concentration correspondante d'O2 dans un étalonnage. Par la suite, les images de la durée de vie de luminescence pour un échantillon donné pressé contre l'optode planaire peuvent être converties en images de la distribution 2D correspondante de la concentration o2. Ce système a été utilisé dans de nombreuses applications à la fois en laboratoire et in situ16,28, mais la caméra CCD essentielle porte-capable n'est plus disponible dans le commerce.
Récemment, un système de caméra à vie luminescence différente a été libéré, qui acquiert des images dans le domaine de fréquence8. Le système repose sur une source de lumière continuellement modulée pour l'excitation. Il peut s'agir d'une onde sinusoïdale ou carrée au lieu d'une excitation pulsée, qui est utilisée pour l'acquisition d'images dans le domaine temporel. Cette modulation se traduit par une émission de luminescence modulée du colorant indicateur O2, qui est décalé e par un angle, qui dépend de la durée de vie de la luminescence du colorant indicateur (voir l'équation 2).
(2)<img align="center" src="/files/ftp_upload/60191/60191eq2.jpg">
Le changement entre l'excitation et l'amplitude des émissions (c'est-à-- à l'indique, l'indice ou la profondeur dit de modulation (amplitude divisée par la partie de luminescence constante)) dépend également de la durée de vie de la luminescence. Ainsi, en définissant une fréquence de modulation connue le capteur d'image spécial CMOS dans la caméra est capable de mesurer la durée de vie de la luminescence dans la gamme ns à 's comme décrit en détail ailleurs 8,29,30. Un guide général sur le principe d'exploitation peut être trouvé (en utilisant le lien suivant <a href="https://www.youtube.com/watch?v=xPAB_eVWOr8" target="_blank">https://www.youtube.com/watch?v=xPAB_eVWOr8</a>).
Dans le protocole suivant, nous démontrons l'utilisation du nouveau système de caméra pour l'imagerie de la distribution de la concentration O2 autour des racines de la plante d'eau douce aquatique Littorella uniflora en 2D9,31. Nous tenons à souligner que cette méthode n'est nullement limitée à cette application. Optodes sensibles à l'oxygène ou particules de capteurs27 en combinaison avec diverses méthodes d'imagerie ont été utilisés dans la recherche médicale32, dans la bioimpression33, pour les peintures sensibles à la pression34,35, ou pour étudier les systèmes photosynthétiques2,36,37, pour n'en nommer que quelques autres domaines d'application.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Air pump with air stone and water pump</td>
			<td>Local aquarium store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>67-66-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC4 silicone compound</td>
			<td>Dow Corning GmbH</td>
			<td>2793695</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas mixer</td>
			<td>V&#246;gtlin Instruments GmbH</td>
			<td>red-y compact meter GCM</td>
			<td>This is just one possible instrument. Several companies offer gas mixing devices</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass plates and aquaria</td>
			<td>Local aquarium or hardware store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Freely available imaging software (imagej.nih.gov/ij/index.html)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knife-coating device</td>
			<td> 
			 
			BYK-GARDNER GMBH byk.com</td>
			<td>2021</td>
			<td>This is a four sided film applicator enabling easy variation of the film thickness. Other versions are also available. We recommend a thickness of the applied film between 75-120 &#181;m, which yields a final sensor layer thickness of ~10% of the applied thickness before solvent evaporation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED lamp, Reflector PAR38</td>
			<td>Megaman</td>
			<td>MM17572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED LEDHUB</td>
			<td>Omicon Laserage, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Can be configured with a variety of LEDs. For the presented example, the green LED (528 nm) is essential</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LOCTITE AA 3494</td>
			<td>Henkel AG &#38; Co. KGaA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Acrylic-based instant adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements AR Software</td>
			<td>Nikon Inc</td>
			<td></td>
			<td>Software package used for image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pco.flim</td>
			<td>PCO AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Frequency domain based luminescence lifetime camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>platinum(II)-5,10,15,20-tetrakis-(2,3,4,5,6-pentafluorphenyl)-porphyrin (PtTFPP)</td>
			<td>Frontier Scientific</td>
			<td>PtT975</td>
			<td>O2 indicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene terephthalate (PET) foil</td>
			<td>Goodfellow</td>
			<td>320-992-72</td>
			<td>Such foils might also be found from other providers and serve as solid support</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene (PS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9003-53-6</td>
			<td>Polymer matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schott RG610 filter</td>
			<td>www.uviroptics.com</td>
			<td></td>
			<td>Here 52mm screw on Filters can obtained. Other sources offer square glass filters from Schott glass that can be fixed in front of the objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl electrical tape</td>
			<td>Scotch, Super 33+</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Makro Planar 2/100 with Hama C for Nikon adaptor</td>
			<td>delivered with the camera</td>
			<td></td>
			<td>Here any other objective might also be used in combination with an adaptor if the objective does not have a C-mount</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

luminescence lifetime imaging of o2 with a frequency-domain-based camera system

Nous décrivons une méthode pour imager l'oxygène dissous (O2), en 2D à haute résolution spatiale (lt; 50-100 'm) et temporelle (lt; 10 s) résolution. La méthode utilise des feuilles de capteur luminescentes sensibles O2 (optodes planaires) en combinaison avec un système de caméra spécialisé pour l'imagerie de la durée de vie de la luminescence dans le domaine de la fréquence. Les optodes planaires sont préparés en dissolvant le colorant indicateur O2-sensibledans un polymère et en étalant le mélange sur un support solide dans une épaisseur définie par l'intermédiaire du revêtement de couteau. Après l'évaporation du solvant, l'optode planaire est placé en contact étroit avec l'échantillon d'intérêt - ici démontré avec les racines de la plante aquatique Littorella uniflora. Le changement O2 dépendant de la concentration dans la durée de vie de luminescence du colorant indicateur dans l'optode planaire est représenté par l'arrière du papier d'aluminium transparent et du mur d'aquarium à l'aide d'une caméra spéciale. Cette caméra mesure la durée de vie de la luminescence par un décalage dans l'angle de phase entre un signal d'excitation modulée et un signal d'émission. Cette méthode est supérieure aux méthodes d'imagerie par intensité de luminescence, car le signal est indépendant de la concentration de colorant ou de l'intensité de la source d'excitation, et repose uniquement sur le temps de décomposition de la luminescence, qui est un paramètre intrinsèquement référencé. Par conséquent, un colorant de référence supplémentaire ou d'autres moyens de référencement ne sont pas nécessaires. Nous démontrons l'utilisation du système pour l'imagerie macroscopique O2 des rhizosphères végétales, mais le système de caméra peut également facilement être couplé à un microscope.

Comme exemple d'application pour le nouveau système d'imagerie, nous montrons l'imagerie 2D O2 d'un échantillon biologique complexe (c.-à-d., la rhizosphère de la plante aquatique Littorella uniflora).
Tout d'abord, la méthode décrit la fabrication d'un film de capteur planaire, un optode planaire. Comme on le voit dans la figure 1, un tel optode est fait d'une mince couche d'un indicateur optique dans une matrice de polymère qui est répartie sur un support transparent. En suivant le protocole décrit, un film de capteur homogène avec une épaisseur uniforme, tel que défini par l'écart du dispositif de revêtement de couteau, est obtenu. Si l'optode produit a une distribution inégale du matériau du capteur (p. ex., trous dans le revêtement, montre des rayures ou des agrégats de teinture (cela peut être évalué visuellement et visuellement à l'aide d'une lampe UV)), le protocole doit être répété et tous les matériaux doivent être soigneusement nettoyés à l'aide d'acétone.
Une fois l'optode planaire préparé, l'échantillon peut être mis en contact étroit avec la couche de détection de l'optode planaire, comme le montre ici l'optode planaire intégré dans une chambre rhizo-sandwich, où les racines d'une plante dans une matrice sédimentaire environnante peuvent être placées en contact étroit avec l'optode planaire (Figure 2). Si elle est préparée correctement, la chambre rhizo-sandwich doit être facilement évolutive d'un aquarium (incubation) à l'autre (mesure). Si elle n'est pas construite correctement, la chambre rhizo-sandwich peut être instable, perdre des sédiments ou contenir des bulles d'air. L'examen visuel de la chambre rhizo-sandwich directement après l'assemblage est donc recommandé.
Le protocole donné permet l'imagerie à vie de luminescence basée sur la fréquence-domaine de l'échantillon en contact avec l'optode planaire à l'aide de la caméra à vie de luminescence basée sur la fréquence-domaine. Plus de détails sur ce système de caméra tels que le mode d'acquisition d'image et scientifique complémentaire métal-oxyde-semi-conducteur (SCMOS) caractéristiques de la caméra sont donnés dans les publications récentes8,29.
La configuration elle-même est assez simple et ne comprend que la caméra qui contrôle une source de lumière (dans ce cas, une source d'excitation LED) et l'échantillon avec l'optode (Figure 3). Assurez-vous que toutes les pièces sont correctement connectées et que l'échantillon est illuminé de façon homogène. La lumière de fond doit être évitée lors de la préformation des mesures.
Avant d'avoir l'imagerie, l'optode doit être étalonné. Comme on le voit dans la figure 4A, la durée de vie mesurée de la luminescence diminue avec l'augmentation de la concentration d'O2 à la suite d'une carie quasi-exponentielle. Cette relation peut également être décrite à l'aide du modèle simplifié à deux sites(figure 4B et équation 3). Dans l'exemple donné, les paramètres nécessaires pour calculer ultérieurement la concentration d'O2 ont été suivis; 0 56,26 euros, Ksv 0,032 hPa-1 et f 0,86.
L'exécution d'un étalonnage est également un moyen idéal de tester que le système fonctionne correctement. Si tous les composants sont installés comme décrit ici (ou dans les lignes directrices des fabricants), la durée de vie mesurée devrait montrer la même dépendance à l'O2 que la figure 4. En outre, pour la même combinaison de matériaux de détection O2 (polymère et colorant), le0 mesuré doit être dans la même plage (quelques 's) que mesurée ici (principalement influencée par la température expérimentale). S'il n'est pas en mesure d'obtenir une courbe d'étalonnage similaire, assurez-vous que toutes les étapes ont été suivies correctement. Parfois, l'optode est accidentellement fixé avec le côté sensible face à la paroi de verre plutôt que l'échantillon, ou les images acquises sont sur-ou sous-exposées.
Avec les paramètres d'étalonnage, il est possible de déterminer la concentration d'O2 par l'imagerie de la durée de vie de la luminescence. Ceci est démontré dans la figure 5A,B, où la distribution de la concentration d'O2 dans la rhizosphère de Littorella uniflora a été représentée dans l'obscurité et après une exposition à la lumière à 500 photons m-2 s-2 pour 12 h, respectivement. En raison de l'activité photosynthétique de la plante, la concentration d'O2 dans la rhizosphère a augmenté après l'exposition à la lumière. Outre les images à vie, des images « structurelles » peuvent également être acquises sous l'éclairage externe, tout en gardant la géométrie d'imagerie fixe. De cette façon, les images O2 peuvent être précisément corrélées à l'image structurelle (figure 5C), des sections transversales ou des régions d'intérêt. À titre d'exemple, les profils de concentration O2 sur une seule racine ont été extraits de l'image acquise dans l'obscurité et la lumière, respectivement (Figure 5D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60191/60191fig1a.jpg"> Figure 1 : Fabrication d'un optode planaire O2. (A) Une feuille de PET est fixée sur une plaque de verre et le dispositif de revêtement de couteau est placé sur le papier d'aluminium. (B) Le cocktail de capteur préparé est étalé sur le papier d'aluminium PET comme une fine ligne devant le dispositif de revêtement de couteau. (C) Le dispositif de revêtement de couteau est déplacé vers le bas pour répandre le cocktail de capteur comme un film mince sur le papier d'aluminium de PET, qui après l'évaporation de solvant a comme conséquence un optode planaire prêt à l'emploi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60191/60191fig1alarge.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60191/60191fig2a.jpg"> Figure 2 : Assemblage de chambre Rhizo-sandwich avec intégration d'un optode planaire O2. (A) L'optode est fixé sur l'une des plaques de verre à l'aide d'un film d'eau. (B) L'optode est collé à la plaque avec du ruban adhésif électrique. (C) Le sédiment est rempli dans la plaque opposée avec les espaceurs attachés (c.-à-d. des lames de microscope). (D) Les racines des plantes sont placées sur les sédiments uniformément étalés. (E) La chambre rhizo-sandwich est fermée et temporairement fixée avec des pinces. (F) Chambre rhizo-sandwich entièrement fermée et assemblée. (G) Pour protéger l'optode de l'exposition à la lumière par la lampe d'incubation et pour éviter la croissance des algues, un couvercle en plastique est placé au-dessus de la chambre de rhizo-sandwich assemblée. (H) La chambre rhizo-sandwich incubée dans un aquarium. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60191/60191fig2alarge.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60191/60191fig3a.jpg"> Figure 3 : Configuration d'imagerie contenant la caméra à vie à base de luminescence basée sur le domaine de la fréquence, avec l'objectif focalisé sur l'échantillon avec l'optode par derrière via l'aquarium transparent et les murs de chambre rhizo-sandwich. Le guide lumineux de la source d'excitation LED est positionné pour éclairer l'échantillon uniformément. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60191/60191fig3alarge.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60191/60191fig4a.jpg"> Figure 4 : Courbes de calibration pour l'optode planaire O2. (A) Différentes durées de vie de phosphorescence mesurées aux concentrations respectives d'O2 dans la chambre d'étalonnage remplie d'eau. (B) Tracestern-Volmer des données d'étalonnage équipées à l'aide du modèle simplifié à deux sites pour l'étanchéité collisionnelle dynamique (équation 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60191/60191fig4alarge.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60191/60191fig5a.jpg"> Figure 5 : Imagerie à vie de la distribution O2 dans la rhizosphère de la plante aquatique Littorella uniflora. (A) O2 distribution après avoir gardé l'usine sous la lumière pendant 12 h à environ 500 photons m-2 s-1. (B) O2 distribution après avoir maintenu la plante dans l'obscurité pendant 1 h. (C) Image structurale des racines de la plante vue à travers l'optode planaire. (D) Profil de concentration intersectionnelle O2 (l'emplacement est indiqué par la ligne jaune dans le panneau A et B) après 12 h à la lumière (rouge) et 1 h dans l'obscurité (noir). Adapté avec la permission de (Koren, K., Moshammer, M., Scholz, V. V., Borisov, S.M., Holst, G., Kôhl, M. Luminescence Lifetime Imaging of Chemical Sensors - A Comparison between Time-Domain and Frequency-Domain Based Camera Systems. Chimie analytique. 91 (5), 3233-3238, doi: 10.1021/acs.analchem.8b05869 (2019)). Droit d'auteur (2019) American Chemical Society. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60191/60191fig5alarge.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

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Luminescence Lifetime Imaging of O2 with a Frequency-Domain-Based Camera System

Nous décrivons l'utilisation d'une nouvelle caméra à vie de luminescence de domaine de fréquence pour cartographier les distributions 2D O2 avec des feuilles de capteur optique. Le système de caméra et les procédures d'analyse d'image sont décrits avec la préparation, l'étalonnage et l'application des foils de capteur pour visualiser le microenvironnement O2 dans la rhizosphère des plantes aquatiques.

Luminescence Lifetime Imaging of O2 avec un système de caméra basé sur le domaine de fréquence

We describe a method to image dissolved oxygen (O2), in 2D at high spatial (&#60; 50-100 &#181;m) and temporal (&#60; 10 s) resolution. The method employs ...

En tant que meilleur accepteur d’électrons, l’oxygène joue un rôle crucial dans les systèmes biologiques. Avec ce protocole, vous pouvez imager la distribution d’oxygène en 2D à l’aide d’un optode. En plus de sa haute résolution spatiale et temporelle, cette méthode ne nécessite pas un colorant de référence supplémentaire, est extrêmement robuste, et permet l’acquisition de l’image structurelle.Cette méthode peut être appliquée à divers domaines de recherche dans lesquels l’oxygène joue un rôle clé, y compris l’écologie, la recherche médicale, la bioimpression et l’impression sensible à la pression. La fabrication optode peut être difficile que la quantité de cocktail ajouté à la feuille de soutien et la vitesse de traînée dispositif de revêtement couteau peut nécessiter l’optimisation et la pratique. Avec cette contribution vidéo, nous voulons rendre cette technique puissante accessible aux chercheurs d’autres domaines d’étude.Pour préparer une optode d’oxygène planaire, utilisez d’abord un film d’eau ou 70 % d’éthanol pour fixer une feuille pet propre et exempte de poussière sur une plaque de verre propre. Placez un dispositif propre de revêtement de couteau de 120 micromètres sur le papier d’aluminium et utilisez une pipette en verre pour appliquer une ligne de cocktail de capteur devant l’appareil. Ensuite, faites glisser le dispositif de revêtement couteau lentement et uniformément sur la feuille PET pour étendre le cocktail uniformément.Ensuite, séchez l’optode sensible à l’oxygène planaire fini dans l’air ambiant pendant une heure avant de sécher toute la nuit dans une armoire chauffée à 50 à 60 degrés Celsius. Le lendemain matin, une couche d’environ 12 micromètres d’épaisseur aura été obtenue. Conservez l’optode à l’abri de la lumière jusqu’à nouvel usage.Pour préparer une chambre rhizo-sandwich, utilisez un adhésif instantané à base d’acrylique curable léger pour coller des diapositives au microscope le long des bords d’une plaque de verre laissant un long bord ouvert. Couper l’optode planaire dans la forme et la taille requises pour s’insérer dans l’espace entre les glissières de microscope collées et placer l’optode à l’intérieur de la plaque de verre avant avec le côté enduit vers le haut. Collez un bord de la feuille d’optode à la plaque de verre et ajoutez de l’eau du robinet entre la plaque de verre et le papier d’aluminium optode.Abaissez lentement le papier d’aluminium sur les gouttelettes d’eau permettant à l’optode de se redresser sur la surface du verre et d’utiliser un tissu mou pour enlever soigneusement une bulle d’air coincée entre l’optode et la plaque. Essuyez ensuite la plaque de verre et collez les bords restants du papier d’aluminium à la plaque. Ensuite, utilisez une plaque de verre plate pour répartir uniformément les sédiments de 0,5 millimètre sur la plaque jusqu’à la même épaisseur que les entretoires à glissière du microscope.Nettoyez soigneusement la surface supérieure de la glissière du microscope pour vous assurer que la deuxième plaque de verre scelle correctement la chambre et appliquez de la graisse de silicone sur la surface de la glissière du microscope. Couvrez ensuite le sédiment d’un mince film d’eau tout en évitant soigneusement la formation de bulles d’air. Avant de placer un échantillon sur les sédiments, lavez soigneusement une seule pousse de Littorella uniflora et placez la pousse sur un sédiment avec les feuilles qui sortent du côté supérieur ouvert.Lorsque l’échantillon est en place, placez la plaque de verre avec l’optode sur le sédiment et appliquez une pression douce pour mettre l’optode en contact étroit avec les racines des plantes et les sédiments environnants. Utilisez des pinces pour attacher les plaques ensemble et sécher les bords extérieurs avec du papier de soie. Ajoutez à plusieurs reprises quelques gouttes d’eau aux feuilles pour garder la plante hydratée tout au long de l’assemblage du rhizo-sandwich et utilisez du ruban électrique en vinyle pour resserrer la chambre rhizo-sandwich.Ensuite, sceller les bords avec de l’argile de modélisation et du ruban électrique supplémentaire. Pour se préparer à l’imagerie, retirer le papier d’aluminium de couverture de la zone optode après l’incubation et positionner la chambre rhizo-sandwich avec le mur de verre avec l’optode droit contre le mur de l’aquarium. Utilisez un espaceur pour appuyer sur la chambre rhizo-sandwich contre le mur.Placez la caméra à vie de luminescence basée sur le domaine de fréquence équipée d’un objectif devant l’aquarium et la zone d’intérêt. Fixez un filtre d’émission approprié pour l’imagerie du colorant indicateur à l’objectif de la caméra et fixez le guide lumineux dans la source d’excitation LED. Ensuite, placez le guide de sorte qu’il illuminera uniformément la feuille d’optode planaire couvrant la zone d’intérêt.Dans le logiciel d’imagerie, sélectionnez la caméra et sélectionnez la LED dans le logiciel de contrôle LED. Réglez l’intensité led au besoin et cocher analogique et synchroniser pour confirmer que la LED est déclenchée par la logique transistor-transistor externe. Concentrez manuellement la caméra et ajustez l’ouverture objective et réglez la source de modulation interne, l’onde sinusoïdale pour la forme d’onde de sortie, l’échantillonnage de phase supplémentaire, les échantillons en huit phases, l’ordre de phase opposé, appuyez sur la lecture A B et la fréquence de modulation de cinq kilohertz.Ajustez le temps d’exposition jusqu’à ce que la lecture des statistiques de la région d’intérêt pour l’image normalisée de l’intensité de luminescence soit de l’intervalle de 0,68 à 0,72. Cliquez ensuite sur la référence de capture pour commencer l’acquisition d’une série de mesure de référence. Pour calibrer l’optode, utilisez un dispositif de mélange de gaz pour rincer l’eau dans un aquarium d’étalonnage avec un mélange de gaz azoté de l’air ambiant avec une concentration connue d’oxygène surveillant la concentration d’oxygène avec une sonde externe avec un capteur d’oxygène.Ensuite, acquérir une série d’images à différentes concentrations d’oxygène dans la chambre d’étalonnage pour obtenir une courbe appropriée adaptée aux données d’étalonnage acquises. Lorsque le système a été calibré, éteignez les lumières appliquant l’irradiation à la plante et à toutes les autres sources de lumière et ajustez le temps d’acquisition en fonction de l’intensité de l’image pour vous assurer que le signal n’est ni sursaturé ni trop faible pour un bon rapport signal-bruit dans la détermination de la durée de vie. Lorsque toutes les images de durée de vie de l’oxygène ont été acquises, allumez les lumières pour obtenir une image structurelle et obtenir une image avec une règle dans le champ de vision pour permettre la mise à l’échelle ultérieure des images acquises.Avant d’imaginer l’échantillon, l’optode doit être calibré. À la suite d’une décomposition quasi exponentielle, la durée de vie mesurée de la luminescence diminue à mesure que la concentration d’oxygène augmente. Cette relation peut également être décrite à l’aide du modèle simplifié à deux sites.Une fois que l’optode a été calibré, il est possible de déterminer la concentration d’oxygène en imagerie de la durée de vie de la luminescence observée dans ces images dans lesquelles la distribution de la concentration d’oxygène dans la rhizosphère de Littorella uniflora a été photographiée après une exposition lumineuse à 500 photons de micromole par mètre carré par seconde pendant 12 heures et après 12 heures dans l’obscurité. En plus des images à vie, des images structurelles peuvent également être acquises sous illumination externe tout en maintenant la géométrie d’imagerie fixe pour permettre à l’imagerie par oxygène d’être précisément corrélée à l’image structurale. Les profils de concentration d’oxygène sur une seule racine, par exemple, peuvent ensuite être extraits des images acquises dans l’obscurité et la lumière.Il est essentiel d’avoir un bon contact entre la matrice de l’échantillon et l’optode pour éviter les artefacts inutiles. Si vous avez des doutes, refaitez le sandwich. L’acquisition instantanée d’une image d’une manière non constructive permet de surveiller l’environnement de l’oxygène.La méthode pourrait aussi bien être combinée avec d’autres optodes pour le pH ou d’autres analytes. Assurez-vous d’effectuer la fabrication optode dans une hotte de fumée que le cocktail capteur contient du chloroforme. Les optodes planaires peuvent être utilisés pour identifier les communautés microbiennes dans les sédiments.Et après l’imagerie, le sandwich peut être ouvert pour échantillonner ces points chauds pour l’analyse de la communauté microbienne.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Luminescence Lifetime Imaging of O2 with a Frequency-Domain-Based Camera System

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

Préparation cellules adhérentes pour fluorescence X-ray Imaging par fixation chimique

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Recherche

Chimie

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