Name: luminescence lifetime imaging of o2 with a frequency-domain-based camera system
Uploaded: 2019-12-16T14:00:00
Duration: 8 min 35 s
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Wir danken Sofie Lindegaard Jakobsen (Universität Kopenhagen) und Lars Borregaard Pedersen (Universität Aarhus) für die technische Unterstützung. Die Finanzierung dieser Studie wurde durch ein Sapere-Aude Advanced-Stipendium des Unabhängigen Forschungsfonds Dänemark (DFF-1323-00065B; MK), Projektzuschüsse aus dem unabhängigen Forschungsfonds Dänemark | Naturwissenschaften (DFF-8021-00308B; MK) & Technische und Produktionswissenschaften (DFF-8022-00301B und DFF-4184-00515B; MK), der Dänischen National Research Foundation (DNRF136) und der Poul Due Jensen Foundation (KK).

Der Autor Gerhard Holst ist Mitarbeiter der PCO AG, die das in diesem Artikel verwendete Kamerasystem herstellt. Die PCO AG hat sich finanziell an den Publikations- und Open-Access-Kosten dieses Artikels beteiligt.

In diesem Protokoll wird der gesamte Arbeitsablauf von der Optodenvorbereitung bis zur O 2-Bildanalyse abgedeckt. Durch das Befolgen dieses Protokolls können chemische Bilder mit der neuartigen frequenzbereichsbasierten Lumineszenz-Lebensdauerkamera gewonnen werden. Je nach Anwendung können die planaren Optoden in verschiedenen Größen und Schichtstärken der Sensorschicht hergestellt werden, von robusten 50-100 m dicken planaren Optoden von mehreren Zehntelquadratzentimetern bis hin zu Mikroskopabdeckungsrutschen mit <1 'm dicken Sensorschichten6,40. Das Potenzial dieser Methode wurde mit einer bestimmten Anwendung demonstriert, ist aber nicht nur aufO2-Bildgebung in Pflanzenrhizosphären12,28beschränkt.
Diese Methode hat mehrere Vorteile im Vergleich zu reinen Lumineszenzintensitäts-basierten chemischen Bildgebungsmethoden. Die Lumineszenzlebensdauer-Bildgebung ist nicht oder zumindest viel weniger von ungleichmäßiger Beleuchtung, ungleichmäßiger Optodedicke und Fotobleiche25betroffen. Diese Methode vermeidet auch die Verwendung eines zusätzlichen Referenzfarbstoffs, der in der ratiometrischen Bildgebung17,37verwendet wird. Im Vergleich zu anderen lebenslangen Kamerasystemen, wie z. B. häufig verwendeten Gated-Time-Domain-Kameras8,26, kann das hier vorgestellte neuartige Kamerasystem und Protokoll vergleichbare Ergebnisse liefern. In einer kürzlich veröffentlichten Veröffentlichung wurden die analytischen Merkmale dieser beiden Systeme verglichen, und es wurde festgestellt, dass das frequenzbereichsbasierte Lumineszenz-Lebensdauer-Kamerasystem zumindest mit dem eingestellten zeitdomänenbasierten Vorgänger8vergleichbar ist.
Wir haben das einfachste O2 Optode präsentiert, das nur aus einem Indikator in einer Polymermatrix besteht. Neben mehreren anderen möglichen O2-Indikatoren können20, die verwendet werden könnten, additive, d.h. Streumittel wie TiO2 oder Diamantpulver2, aufgenommen werden, um das Sensorsignal zu erhöhen und gleichzeitig die Transparenz des Optodes zu reduzieren. Auch zusätzliche Farbstoffe könnten verwendet werden, um die Signalintensität durch Energieübertragung41zu erhöhen.
Für die planare Optodefertigung empfehlen wir bei Verwendung der beschriebenen Sensorcocktailzusammensetzung die Verwendung eines Spalts in der Messerbeschichtungsvorrichtung von 75 - 120 m, um eine endgültige Sensorschichtdicke von ca. 7,5 bis 12 m nach Lösemittelverdampfung (ca. 10% des verwendeten Spalts) zu erzielen. Dies ist ein guter Kompromiss zwischen der Signalintensität, die durch höhere Farbbelastung oder durch die Wahl von Indikator- und Referenzfarbstoffen mit höherer Helligkeit und Reaktionszeit geändert werden kann. Eine Erhöhung der Schichtdicke führt zu einer Erhöhung der Reaktionszeit, da die Zeitspanne, die für den Analyten erforderlich ist, um ein thermodynamisches Gleichgewicht in der Sensorschicht mit den umgebenden Medien zuerreichen, um 12erhöht wird.
Optodes reagieren, wie hier beschrieben, auf Veränderungen derO2-Konzentration innerhalb weniger Sekunden17 und haben dennoch ein ausreichend starkes Lumineszenzsignal. Ultradünne Sensorbeschichtungen mit Ansprechzeiten unter Sekunden können mit Spin-Coating6realisiert werden. Wenn der Träger oder die Messerbeschichtungsvorrichtung nicht gut gereinigt ist, kann dies zu inhomogenen Sensorschichten führen. Auch wenn der Cocktail nach dem Ausbreiten vor der Beschichtungsvorrichtung nicht vollständig homogen ist oder zu schnell aufgetragen wird, kann ein solches unerwünschtes Ergebnis beobachtet werden. Daher kann es einige Übung, um optimale Optodes vorzubereiten.
Die Methode kann verwendet werden, um Proben abzubilden, die in engem Kontakt mit der Optode, wie bestimmte Meerestiere42, Biofilme6 und Böden31, um nur einige zu nennen. Wir präsentieren ein eigenständiges Setup mit einem Objektiv, aber die Kamera kann leicht an ein Mikroskop für chemische Bildgebung mit höherer Auflösung gekoppelt werden43.
Während die zeitdomänenbasierte Lumineszenzlebensdauer-Bildgebung die Unterdrückung der Hintergrundfluoreszenz26ermöglichte, ist dies ein Problem bei der Verwendung des neuen frequenzbereichsbasierten Kamerasystems8. Aufgrund der kontinuierlichen Bildaufnahme zeichnet diese Kamera jede Hintergrundfluoreszenz der Probe auf, die durch die ausgewählte LED angeregt werden kann und im ausgewählten Spektralfenster emittiert, wie durch den Emissionsfilter auf dem Kameraobjektiv definiert. Dies führt zu einer scheinbar niedrigeren Lebensdauer und folglich zu falschen Messwerten. Wenn Sie mit Proben mit einer signifikanten intrinsischen Fluoreszenz arbeiten, die sich mit der Anregung und Emission desO2-Sensors überlappt, ist es wichtig, eine zusätzliche optische Isolierung auf die Optode aufzutragen, indem Sie eine zusätzliche Schicht mit Ruß2,17beschichten. So erreicht nur die Lumineszenz, die von der planaren Optode ausgeht, die Kamera. Um die Hintergrundlumineszenz zu überprüfen, kann ein Bild ohne Optode aufgenommen werden, das dann ausschließlich die intrinsische Lumineszenz der Probe zeigen würde. Es ist auch möglich, Streumittel wie TiO2 oder Diamantpulver2,44, zum Sensorcocktail hinzuzufügen, um die Lumineszenzintensität des Indikatorfarbstoffs zu erhöhen. Dies kann jedoch auch zu einer schnelleren Fotobleiche führen und TiO2 ist ein bekannter Fotokatalysator, der die Photostabilität eines Farbstoffs beeinträchtigen kann41. Ein weiterer Aspekt, der zu berücksichtigen ist, ist das Hintergrundlicht. Bei der Bildgebung von Lumineszenzlebensdauern muss Hintergrundlicht so effizient wie möglich vermieden werden. Daher erfordert diese Bildgebungsmethode, dass die Einrichtung in einer dunklen Umgebung platziert wird und jede externe Lichtquelle während der Bildaufnahme vorübergehend ausgeschaltet werden muss.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Bildgebung der Lumineszenzlebensdauer eine robuste chemische Bildgebungsmethode ist, die an viele verschiedene Anwendungen angepasst werden kann. Dieses Protokoll (siehe Abschnitt 1 - 5) deckt alle wesentlichen Schritte zum Generieren eines O2-Bildes ab und verwendet das derzeit flexibelste Frequenzbereichs-Lumineszenz-Lebensdauer-Bildgebungssystem, das die eingestellte Gated-Time-Domain-Kamera für 2D O 2-Bildgebung durch planare Optoden ersetzen kann.

Die Verteilung und Dynamik von gelösten Gasen und Ionen in Sedimenten und Böden liefern wichtige Informationen über biogeochemische Prozesse wie mikrobielle Atmung1,2, oder radialen Sauerstoffverlust von Pflanzenwurzeln3,4,5, und die chemische Mikroumgebung von Mikroben6,7, Pflanzenrhizosphären5,8,9 und tierische Naschen10, 11,12. Biologische und chemische Aktivitäten in solchen diffusionsbegrenzten Umgebungen können zu steilen Gradienten chemischer Substrate oder Produkte biogeochemischer Prozesse führen. Insbesondere die O2-Verfügbarkeit hat einen großen Einfluss auf biogeochemische Prozesse und damit auf die Biologie und Ökologie eines Systems13. Daher ist die Analyse vonO2-Konzentrationen bei hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung in den aquatischen und terrestrischen Wissenschaften von größter Bedeutung. Zunächst wurden elektrochemische und optische Mikrosensoren14,15 entwickelt, um diesen wichtigen Analyten zu messen. Später wurde die 2-dimensionale (2D) Bildgebung von O2 mit planaren Optoden12,16,17,18,19eingeführt, was die Visualisierung und Quantifizierung der heterogenenO2-Verteilung in Böden und Sedimenten ermöglichte.
Planare O2 Optode bestehen aus einemO2-empfindlichenIndikatorfarbstoff20, der in einem geeigneten Polymer21gelöst wird. Der Indikatorfarbstoff wird bei bestimmten optischen Wellenlängen angeregt und strahlt bei Entspannung in Form von Lumineszenz rot verschiebbares Licht aus. In Gegenwart von O2kann der angeregte Indikatorfarbstoff seine Energie bei einer Kollision auf dasO2-Molekül übertragen, das als kollisionsbasierte Lumineszenzabschreckung22bezeichnet wird. Daher werden die Lumineszenzintensität sowie die Lumineszenzlebensdauer mit zunehmenderO2-Konzentration 23reduziert. Im Idealfall folgt die Änderung der Intensität und Lebensdauer der Stern-Volmer-Gleichung (Gleichung 1) unter Verwendung der Lumineszenzintensität oder der Lebensdauer in Abwesenheit (I0;0) oder der Anwesenheit (I, b) von O2 bei einer gegebenen Konzentration [Q]. Die Stern-Volmer-Konstante (Ksv) ist ein Maß für die Empfindlichkeit der Optode gegenüber O2; KSV ist abhängig von Umweltvariablen wie Temperatur und Druck.
(1)<img align="center" src="/files/ftp_upload/60191/60191eq1.jpg">
Die Aufzeichnung solcher Lumineszenzänderungen über eine planare Sensorfolie mit einem Kamerasystem kann verwendet werden, um die entsprechenden Änderungen in der O2-Verteilung zu visualisieren. Zunächst wurde eine einfache Lumineszenzintensitäts-basierte O 2-Bildgebung verwendet18. Eine solche Methode ist jedoch sehr empfindlich gegenüber äußeren Interferenzen, die die Zuverlässigkeit der Ergebnisse durch heterogene Beleuchtung, Schwankungen in der Anregungsquelle oder Kamera sowie eine ungleichmäßige Verteilung des Indikatorfarbstoffs innerhalb des planaren Optodes beeinträchtigen.
Einige dieser Einschränkungen können durch die Verwendung planarer Optoden für die ratiometrische Bildgebung17,24, wo derO2-empfindlicheIndikatorfarbstoff in der Polymerschicht des planaren Optodes mit einem unempfindlichen Referenzfarbstoff, der in einem anderen Spektralbereich als derO2-Indikatoremittiert, mitimmobilisiert werden. Basierend auf Emissionsbildern, die in zwei Spektralfenstern aufgenommen wurden, wird dasO2-empfindlicheEmissionssignal durch das Referenzsignal dividiert, wodurch ein Verhältnisbild erzeugt wird, das weniger anfällig für die oben genannten Interferenzenist 5,17. Das Verfahren erfordert die Verwendung eines zweiten Farbstoffs, der idealerweise durch dieselbe Anregungsquelle angeregt werden kann, aber bei einer anderen Wellenlänge (ohne signifikante Spektralüberlappung) in einem anderen Spektralfenster der Kamera ausstrahlt (z. B. in einem anderen Farbkanal einer RGB-Kamera).
Alternativ kann dieO2-Bildgebung auf der Quantifizierung derO2-abhängigenVeränderung der Lumineszenzlebensdauer des Indikatorfarbstoffs basieren, die nicht durch ungleichmäßige Beleuchtung oder Heterogenitäten in der Indikatorkonzentration25beeinflusst wird. Erste Lumineszenz-Lebensdauer-basierte O 2-Bildgebungssysteme basierten auf Zeitbereichsmessungen mit einem Gate-fähigen charged coupled Device (CCD) Kamerasystem26, bei dem eine gepulste Anregungsquelle verwendet wird und Lumineszenzbilder in definierten Zeitintervallen innerhalb der Anregung oder Emission des Indikators8,23, 27aufgenommen werden. Aus solchen Bildern kann die Lumineszenzlebensdauer bestimmt und mit der entsprechendenO2-Konzentration in einer Kalibrierung korreliert werden. Anschließend können Lumineszenz-Lebensdauerbilder für eine bestimmte Probe, die gegen die planare Optode gedrückt wird, in Bilder der entsprechenden 2D-Verteilung derO2-Konzentration umgewandelt werden. Dieses System wurde in vielen Anwendungen sowohl im Labor als auch in situ16,28verwendet, aber die wesentliche gate-fähige CCD-Kamera ist nicht mehr kommerziell erhältlich.
Kürzlich wurde ein anderes Lumineszenz-Lebensdauer-Kamerasystem veröffentlicht, das Bilder in der Frequenz-Domäne8erfasst. Zur Anregung setzt das System auf eine kontinuierlich modulierte Lichtquelle. Dies kann entweder eine sinusförmige oder quadratische Welle anstelle einer gepulsten Anregung sein, die für die Bildaufnahme im Zeitbereich verwendet wird. Diese Modulation führt zu einer modulierten Lumineszenzemission des O2-Indikatorfarbstoffs, der phasenversetzt um einen Winkel , , der von der Lumineszenzlebensdauer des Indikatorfarbstoffs abhängt (siehe Gleichung 2).
(2)<img align="center" src="/files/ftp_upload/60191/60191eq2.jpg">
Die Veränderung zwischen Anregungs- und Emissionsamplitude (d.h. der sogenannte Modulationsindex oder -tiefe (Amplitude geteilt durch den konstanten Lumineszenzteil)) ist ebenfalls von der Lumineszenzlebensdauer abhängig. Durch die Einstellung einer bekannten Modulationsfrequenz ist der spezielle CMOS-Bildsensor innerhalb der Kamera in der Lage, die Lumineszenzlebensdauer im Ns-bis-S-Bereich zu messen, wie an anderer Stelle ausführlich beschrieben 8,29,30. Eine allgemeine Anleitung zum Funktionsprinzip finden Sie (unter folgendem Link <a href="https://www.youtube.com/watch?v=xPAB_eVWOr8" target="_blank">https://www.youtube.com/watch?v=xPAB_eVWOr8</a>).
Im folgenden Protokoll zeigen wir den Einsatz des neuartigen Kamerasystems zur Abbildung der Verteilung derO2-Konzentration um die Wurzeln der aquatischen Süßwasserpflanze Littorella uniflora in 2D9,31. Wir möchten betonen, dass diese Methode keineswegs auf diese Anwendung beschränkt ist. Sauerstoffempfindliche Optoden oder Sensorpartikel27 in Kombination mit verschiedenen bildgebenden Verfahren wurden in der medizinischen Forschung32, im Bioprinting33, für druckempfindliche Farben34,35, oder zur Untersuchung photosynthetischer Systeme2,36,37, um nur einige andere Anwendungsbereiche zu nennen verwendet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Air pump with air stone and water pump</td>
			<td>Local aquarium store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>67-66-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC4 silicone compound</td>
			<td>Dow Corning GmbH</td>
			<td>2793695</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas mixer</td>
			<td>V&#246;gtlin Instruments GmbH</td>
			<td>red-y compact meter GCM</td>
			<td>This is just one possible instrument. Several companies offer gas mixing devices</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass plates and aquaria</td>
			<td>Local aquarium or hardware store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Freely available imaging software (imagej.nih.gov/ij/index.html)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knife-coating device</td>
			<td> 
			 
			BYK-GARDNER GMBH byk.com</td>
			<td>2021</td>
			<td>This is a four sided film applicator enabling easy variation of the film thickness. Other versions are also available. We recommend a thickness of the applied film between 75-120 &#181;m, which yields a final sensor layer thickness of ~10% of the applied thickness before solvent evaporation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED lamp, Reflector PAR38</td>
			<td>Megaman</td>
			<td>MM17572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED LEDHUB</td>
			<td>Omicon Laserage, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Can be configured with a variety of LEDs. For the presented example, the green LED (528 nm) is essential</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LOCTITE AA 3494</td>
			<td>Henkel AG &#38; Co. KGaA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Acrylic-based instant adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements AR Software</td>
			<td>Nikon Inc</td>
			<td></td>
			<td>Software package used for image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pco.flim</td>
			<td>PCO AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Frequency domain based luminescence lifetime camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>platinum(II)-5,10,15,20-tetrakis-(2,3,4,5,6-pentafluorphenyl)-porphyrin (PtTFPP)</td>
			<td>Frontier Scientific</td>
			<td>PtT975</td>
			<td>O2 indicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene terephthalate (PET) foil</td>
			<td>Goodfellow</td>
			<td>320-992-72</td>
			<td>Such foils might also be found from other providers and serve as solid support</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene (PS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9003-53-6</td>
			<td>Polymer matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schott RG610 filter</td>
			<td>www.uviroptics.com</td>
			<td></td>
			<td>Here 52mm screw on Filters can obtained. Other sources offer square glass filters from Schott glass that can be fixed in front of the objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl electrical tape</td>
			<td>Scotch, Super 33+</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Makro Planar 2/100 with Hama C for Nikon adaptor</td>
			<td>delivered with the camera</td>
			<td></td>
			<td>Here any other objective might also be used in combination with an adaptor if the objective does not have a C-mount</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

luminescence lifetime imaging of o2 with a frequency-domain-based camera system

Wir beschreiben eine Methode, um gelösten Sauerstoff (O2), in 2D bei hoher räumlicher Auflösung (< 50-100 m) und zeitlicher (< 10 s) Auflösung abzubilden. Das Verfahren verwendet O2 empfindliche Leuchtsensorfolien (planare Optoden) in Kombination mit einem speziellen Kamerasystem zur Bildgebung der Lumineszenzlebensdauer im Frequenzbereich. Planare Optode werden durch Auflösen desO2-empfindlichenIndikatorfarbstoffs in einem Polymer und Das Streuen der Mischung auf einem festen Träger in einer definierten Dicke mittels Messerbeschichtung hergestellt. Nach der Verdunstung des Lösungsmittels wird die planare Optode in engem Kontakt mit der Interessenprobe gesetzt - hier demonstriert mit den Wurzeln der Wasserpflanze Littorella uniflora. Die konzentrationsabhängigeO2-Änderung der Lumineszenzlebensdauer des Indikatorfarbstoffs innerhalb des planaren Optods wird über die Rückseite der transparenten Trägerfolie und Aquarienwand mit einer speziellen Kamera abgebildet. Diese Kamera misst die Lumineszenzlebensdauer (s) über eine Verschiebung des Phasenwinkels zwischen einem modulierten Anregungssignal und einem Emissionssignal. Diese Methode ist den Bildgebungsverfahren der Lumineszenzintensität überlegen, da das Signal unabhängig von der Farbkonzentration oder -intensität der Anregungsquelle ist und sich ausschließlich auf die Lumineszenzzerfallszeit stützt, die ein intrinsisch referenzierter Parameter ist. Folglich ist kein zusätzlicher Referenzfarbstoff oder ein anderes Referenzmittel erforderlich. Wir demonstrieren den Einsatz des Systems zur makroskopischen O 2-Bildgebung von Pflanzenrhizosphären, aber das Kamerasystem lässt sich auch einfach an ein Mikroskop koppeln.

Als Anwendungsbeispiel für das neue Bildgebungssystem zeigen wir 2DO2-Bildgebung einer komplexen biologischen Probe (d.h. die Rhizosphäre der Wasserpflanze Littorella uniflora).
Zunächst beschreibt die Methode die Herstellung einer planaren Sensorfolie, einer sogenannten planaren Optode. Wie in Abbildung 1 zu sehen,besteht ein solches Optode aus einer dünnen Schicht eines optischen Indikators in einer Polymermatrix, die auf einer transparenten Stütze verteilt ist. Durch befolgen des beschriebenen Protokolls wird eine homogene Sensorfolie mit einer gleichmäßigen Dicke, wie sie durch den Spalt der Messerbeschichtungsvorrichtung definiert ist, erhalten. Wenn die produzierte Optode eine lückenhafte Sensormaterialverteilung aufweist (z. B. Löcher in der Beschichtung, zeigt Streifen oder Farbstoffaggregate (dies kann visuell und visuell mit Hilfe einer UV-Lampe bewertet werden)), muss das Protokoll wiederholt werden und alle Materialien müssen gründlich mit Aceton gereinigt werden.
Sobald die planare Optode vorbereitet ist, kann die Probe in engen Kontakt mit der Sensorschicht des planaren Optoden gebracht werden, wie hier mit der planaren Optode in einer Rhizo-Sandwich-Kammer gezeigt, wo die Wurzeln einer Pflanze innerhalb einer umgebenden Sedimentmatrix in engem Kontakt mit der planaren Optode positioniert werden können (Abbildung 2). Bei richtiger Vorbereitung sollte die Rhizo-Sandwich-Kammer leicht von einem Aquarium (Inkubation) zum anderen (Messung) bewegt werden können. Wenn die Rhizo-Sandwich-Kammer nicht richtig konstruiert ist, kann sie instabil sein, Sedimente verlieren oder Luftblasen enthalten. Eine visuelle Untersuchung der Rhizo-Sandwichkammer direkt nach der Montage wird daher empfohlen.
Das gegebene Protokoll ermöglicht eine frequenzbereichsbasierte Lumineszenz-Lebensdauer-Bildgebung der Probe in Kontakt mit der planaren Optode mit der frequenzbereichsbasierten Lumineszenz-Lebensdauerkamera. Weitere Details zu diesem Kamerasystem wie die Art der Bildaufnahme und wissenschaftlich komplementäre Metalloxid-Halbleiter (SCMOS) Kameraeigenschaften sind in den jüngsten Publikationen8,29angegeben.
Das Setup selbst ist ziemlich einfach und enthält nur die Kamera, die eine Lichtquelle steuert (in diesem Fall eine LED-Anregungsquelle) und das Sample mit der Optode (Abbildung 3). Stellen Sie sicher, dass alle Teile korrekt angeschlossen sind und die Probe homogen ausleuchtet ist. Hintergrundlicht muss bei vorformenden Messungen vermieden werden.
Vor der Abbildung der Probe muss die Optode kalibriert werden. Wie in Abbildung 4Adargestellt, nimmt die gemessene Lumineszenzlebensdauer mit steigenderO2-Konzentration nach einem quasi-exponentiellen Zerfall ab. Diese Beziehung kann auch mit dem vereinfachten Modell mit zwei Standorten beschrieben werden(Abbildung 4B und Gleichung 3). Im gegebenen Beispiel wurden die Parameter, die für die anschließende Berechnung derO2-Konzentration erforderlich waren, wie folgt angegeben; 0 = 56,26 s, Ksv = 0,032 hPa-1 und f = 0,86.
Die Durchführung einer Kalibrierung ist auch eine ideale Möglichkeit, um zu testen, ob das System ordnungsgemäß funktioniert. Wenn alle Komponenten wie hier beschrieben (oder gemäß den Herstellerrichtlinien) installiert sind, sollte die gemessene Lebensdauer die gleicheO2-Abhängigkeit aufweisen wie in Abbildung 4. Darüber hinaussollte bei der gleichen Kombination vonO2-Sensormaterialien (Polymer und Farbstoff) die gemessene 0 im gleichen Bereich (ca. ein paar s) liegen, wie hier gemessen (hauptsächlich beeinflusst durch die Versuchstemperatur). Wenn Sie keine ähnliche Kalibrierkurve erhalten können, stellen Sie sicher, dass alle Schritte korrekt ausgeführt wurden. Manchmal wird die Optode versehentlich mit der empfindlichen Seite zur Glaswand und nicht mit der Probe fixiert, oder die aufgenommenen Bilder sind über- oder unterbelichtet.
Mit den Kalibrierparametern ist es möglich, dieO2-Konzentration durch Abbildung der Lumineszenzlebensdauer zu bestimmen. Dies zeigt Abbildung 5A,B, wo die Verteilung derO2-Konzentration in der Rhizosphäre von Littorella uniflora in der Dunkelheit und nach Lichteinwirkung von 500 mol Photonen m-2 s-1 für 12 h abgebildet wurde. Aufgrund der photosynthetischen Aktivität der Pflanze erhöhte sich dieO2-Konzentration in der Rhizosphäre nach Lichteinwirkung. Neben Lebensdauerbildern können auch "strukturelle" Bilder unter externer Beleuchtung aufgenommen werden, wobei die Bildgeometrie fixiert bleibt. Auf diese Weise können O2-Bilder präzise mit dem Strukturbild (Abbildung 5C), Querschnitten oder Interessengebieten korreliert werden. Als Beispiel wurden O 2-Konzentrationsprofile über eine einzelne Wurzel aus dem Bild extrahiert, das in Dunkelheit bzw. Licht aufgenommen wurde (Abbildung 5D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60191/60191fig1a.jpg"> Abbildung 1: Herstellung einer planaren O2 Optode. (A) Eine PET-Folie wird auf einer Glasplatte befestigt und die Messerbeschichtungsvorrichtung auf die Folie gelegt. (B) Der vorbereitete Sensorcocktail wird auf der PET-Folie als dünne Linie vor der Messerbeschichtungsvorrichtung verteilt. (C) Die Messerbeschichtungwirdin wird nach unten bewegt, um den Sensorcocktail als dünner Film auf der PET-Folie zu verteilen, was nach Derlöseverdampfung zu einem gebrauchsfertigen planaren Optod führt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60191/60191fig1alarge.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60191/60191fig2a.jpg"> Abbildung 2: Rhizo-Sandwich-Kammerbaugruppe mit Integration eines planaren O2 Optoden. (A) Die Optode wird mit einem Wasserfilm auf einer der Glasplatten befestigt. (B) Die Optode wird mit Klebeband auf die Platte geklebt. (C) Sediment wird mit den angebrachten Abstandshaltern (d.h. Mikroskopschlitten) in die gegenüberliegende Platte gefüllt. (D) Die Pflanzenwurzeln werden auf das gleichmäßig verteilte Sediment gelegt. (E) Die Rhizo-Sandwich-Kammer ist geschlossen und vorübergehend mit Klemmen fixiert. (F) Voll geschlossene und montierte Rhizo-Sandwich-Kammer. (G) Um die Optode vor Lichteinwirkung durch die Inkubationslampe zu schützen und Algenwachstum zu vermeiden, wird eine Kunststoffabdeckung über die montierte Rhizo-Sandwich-Kammer gelegt. (H) Die in einem Aquarium inkubierte Rhizo-Sandwich-Kammer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60191/60191fig2alarge.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60191/60191fig3a.jpg"> Abbildung 3: Imaging-Setup mit der frequenzbereichsbasierten Lumineszenz-Lebensdauerkamera, wobei das Objektiv über die transparenten Aquarium- und Rhizo-Sandwich-Kammerwände von hinten auf die Probe mit der Optode von hinten fokussiert ist. Die Lichtführung der LED-Anregungsquelle ist so positioniert, dass die Probe gleichmäßig beleuchtet wird. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60191/60191fig3alarge.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60191/60191fig4a.jpg"> Abbildung 4: Kalibrierkurven für planare O 2-Optode. (A) Unterschiedliche Phosphoreszenzlebensdauern, die bei den jeweiligenO2-Konzentrationen in der mit Wasser gefüllten Kalibrierkammer gemessen werden. (B) Stern-Volmer-Diagramm der Kalibrierdaten, die mit dem vereinfachten Zwei-Standort-Modell für dynamisches Kollisionsabschreckungs-Quenching (Gleichung 3) angepasst wurden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60191/60191fig4alarge.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60191/60191fig5a.jpg"> Abbildung 5: Lebensdauerbildgebung derO2-Verteilung in der Rhizosphäre der Wasserpflanze Littorella uniflora. (A)O2-Verteilung nach 12 h unter Licht gehalten, bei ca. 500 mol Photonen m-2 s-1. (B)O2 Verteilung nach Dem Halten der Pflanze in Dunkelheit für 1 h. (C) Strukturelles Bild der Pflanzenwurzeln durch die planare Optode gesehen. (D) Querschnitts-O2-Konzentrationsprofil (die Position wird durch die gelbe Linie in Panel A und B) nach 12 h bei Licht (rot) und 1 h bei Dunkelheit (schwarz) angezeigt. Angepasst mit Genehmigung von (Koren, K., Moßhammer, M., Scholz, V. V., Borisov, S.M., Holst, G., Kühl, M. Luminescence Lifetime Imaging of Chemical Sensors - A Comparison between Time-Domain and Frequency-Domain Based Camera Systems. Analytische Chemie. 91 (5), 3233-3238, doi: 10.1021/acs.analchem.8b05869 (2019)). Copyright (2019) American Chemical Society. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60191/60191fig5alarge.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

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Luminescence Lifetime Imaging of O2 with a Frequency-Domain-Based Camera System

Wir beschreiben die Verwendung einer neuartigen, Frequenzbereichs-Lumineszenz-Lebensdauerkamera zur Kartierung von 2D O2-Verteilungen mit optischen Sensorfolien. Das Kamerasystem und die Bildanalyseverfahren werden zusammen mit der Vorbereitung, Kalibrierung und Anwendung von Sensorfolien zur Visualisierung der O 2-Mikroumgebung in der Rhizosphäre von Wasserpflanzen beschrieben.

Lumineszenz-Lebensdauer-Bildgebung von O2 mit einem Frequency-Domain-basierten Kamerasystem

We describe a method to image dissolved oxygen (O2), in 2D at high spatial (&#60; 50-100 &#181;m) and temporal (&#60; 10 s) resolution. The method employs ...

Als bester Elektronenakzeptor spielt Sauerstoff eine entscheidende Rolle in biologischen Systemen. Mit diesem Protokoll können Sie die Sauerstoffverteilung in 2D mit einer Optode abbilden. Neben der hohen räumlichen und zeitlichen Auflösung erfordert diese Methode keinen zusätzlichen Referenzfarbstoff, ist extrem robust und ermöglicht die Erfassung von Strukturbildern.Diese Methode kann auf verschiedene Forschungsbereiche angewendet werden, in denen Sauerstoff eine Schlüsselrolle spielt, einschließlich Ökologie, medizinische Forschung, Bioprinting und druckempfindlichem Druck. Die Optode-Fertigung kann eine Herausforderung sein, da die Menge an Cocktail, die der Stützfolie hinzugefügt wird, und die Zuggeschwindigkeit der Messerbeschichtungsvorrichtung Optimierung und Übung erfordern kann. Mit diesem Videobeitrag wollen wir diese leistungsstarke Technik Forschern aus anderen Studienbereichen zugänglich machen.Um eine planare Sauerstoffoptode vorzubereiten, verwenden Sie zunächst einen Wasserfilm oder 70% Ethanol, um eine saubere staubfreie PET-Folie auf einer sauberen Glasplatte zu befestigen. Legen Sie eine saubere 120 Mikrometer Messerbeschichtung auf die Folie und verwenden Sie eine Glaspipette, um eine Sensor-Cocktail-Linie vor dem Gerät aufzutragen. Ziehen Sie als nächstes die Messerbeschichtung langsam und gleichmäßig über die PET-Folie, um den Cocktail gleichmäßig zu verteilen.Dann trocknen Sie das fertige planare sauerstoffempfindliche Optode in der Umgebungsluft für eine Stunde, bevor Sie über Nacht in einem beheizten Schrank bei 50 bis 60 Grad Celsius trocknen. Bis zum nächsten Morgen wird eine etwa 12 Mikrometer dicke Schicht erhalten sein. Bewahren Sie die optode vor Licht geschützt bis zur weiteren Verwendung auf.Um eine Rhizo-Sandwich-Kammer vorzubereiten, verwenden Sie lichthärtenden Acryl-basierten Instant-Klebstoff, um Mikroskop-Dias entlang der Ränder einer Glasplatte zu kleben und eine lange Kante offen zu lassen. Schneiden Sie die planare Optode in die gewünschte Form und Größe, um in den Raum zwischen den geklebten Mikroskop-Dias zu passen und legen Sie die Optode auf der Innenseite der vorderen Glasplatte mit der beschichteten Seite nach oben. Eine Kante der Optodefolie auf die Glasplatte kleben und Leitungswasser zwischen der Glasplatte und der Optodefolie hinzufügen.Senken Sie die Folie langsam auf die Wassertröpfchen, so dass sich die Optode auf der Glasoberfläche aufrichten und mit einem Weichgewebe vorsichtig eine Luftblase entfernen kann, die zwischen optode und der Platte eingeschlossen ist. Wischen Sie dann die Glasplatte trocken und verkleben Sie die restlichen Kanten der Folie auf die Platte. Verwenden Sie als Nächstes eine flache Glasplatte, um 0,5 Millimeter Siebsediment gleichmäßig auf die gleiche Dicke wie die Mikroskop-Schiebeabstandhalter zu verteilen.Reinigen Sie die obere Oberfläche des Mikroskopschlittens sorgfältig, um sicherzustellen, dass die zweite Glasplatte die Kammer richtig abdichtet und Silikonfett auf die Mikroskop-Diaoberfläche aufträgt. Dann bedecken Sie das Sediment mit einem dünnen Wasserfilm und vermeiden Sie dabei sorgfältig die Bildung von Luftblasen. Bevor Sie eine Probe auf das Sediment legen, waschen Sie vorsichtig einen einzelnen Schuss Littorella uniflora und positionieren Sie den Trieb auf einem Sediment mit den Blättern, die von der oberen offenen Seite herausragen.Wenn die Probe an Ort und Stelle ist, legen Sie die Glasplatte mit der Optode auf das Sediment und wenden Sie sanften Druck an, um die Optode in engen Kontakt mit den Pflanzenwurzeln und dem umgebenden Sediment zu bringen. Verwenden Sie Klemmen, um die Platten zusammen zu befestigen und die äußeren Ränder mit Tissuepapier zu trocknen. Fügen Sie den Blättern wiederholt ein paar Tropfen Wasser hinzu, um die Pflanze während der Montage des Rhizo-Sandwiches hydratisiert zu halten und verwenden Sie Vinyl-Elektroband, um die Rhizo-Sandwich-Kammer zu straffen.Dann versiegeln Sie die Kanten mit Modellierton und zusätzlichem Elektroband. Zur Vorbereitung der Bildgebung die Deckfolie nach der Inkubation aus dem Optodenbereich entfernen und die Rhizo-Sandwichkammer mit der Glaswand mit der Optode aufrecht gegen die Aquarienwand positionieren. Verwenden Sie einen Abstandsraum, um die Rhizo-Sandwich-Kammer gegen die Wand zu drücken.Platzieren Sie die frequenzbereichsbasierte Lumineszenz-Lebensdauerkamera, die mit einem Objektiv ausgestattet ist, vor das Aquarium und den Interessenbereich. Befestigen Sie einen geeigneten Emissionsfilter zur Abbildung des Indikatorfarbstoffs am Kameraobjektiv und fixieren Sie die Lichtführung in der LED-Anregungsquelle. Positionieren Sie dann die Führung so, dass sie die planare Optodefolie, die den Interessenbereich abdeckt, gleichmäßig ausleuchtet.Wählen Sie in der Bildverarbeitungssoftware die Kamera und in der LED-Steuerungssoftware die LED aus. Stellen Sie die LED-Intensität nach Bedarf ein und ticken Sie analog und synchronisieren Sie, um zu bestätigen, dass die LED durch die externe Transistor-Transistor-Logik ausgelöst wird. Richten Sie die Kamera manuell aus und stellen Sie die objektive Blende ein und stellen Sie die interne Modulationsquelle, die Sinuswelle für die Ausgangswellenform, zusätzliche Phasenproben, achtphasige Proben, Phasenreihenfolge gegenüber, Tippen Sie auf A B-Auslesung und fünf Kilohertz Modulationsfrequenz ein.Passen Sie die Belichtungszeit an, bis die Statistik der Region des Interesses für das normalisierte Lumineszenzintensitätsbild im Bereich von 0,68 bis 0,72 liegt. Klicken Sie dann auf Erfassungsreferenz, um mit der Erfassung einer Referenzmessreihe zu beginnen. Um das Optode zu kalibrieren, verwenden Sie eine Gasmischvorrichtung, um das Wasser in einem Kalibrieraquarium mit einem Umgebungsluftstickstoffgasgemisch mit einer bekannten Sauerstoffkonzentration zu spülen, die die Sauerstoffkonzentration mit einer externen Sonde mit einem Sauerstoffsensor überwacht.Erfassen Sie dann eine Reihe von Bildern mit unterschiedlichen Sauerstoffkonzentrationen in der Kalibrierkammer, um eine richtige Kurve zu erhalten, die zu den erfassten Kalibrierdaten passt. Wenn das System kalibriert wurde, schalten Sie die Lichter aus, die die Anlage bestrahlung und alle anderen Lichtquellen bestrahlung, und passen Sie die Erfassungszeit basierend auf der Intensität des Bildes an, um sicherzustellen, dass das Signal weder übersättigt noch zu schwach für ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis bei der Lebensdauerbestimmung ist. Wenn alle Sauerstofflebensdauerbilder erfasst wurden, schalten Sie die Lichter wieder ein, um ein Strukturbild zu erhalten, und erhalten Sie ein Bild mit einem Lineal im Sichtfeld, um eine nachträgliche Skalierung der erfassten Bilder zu ermöglichen.Vor der Abbildung der Probe muss die Optode kalibriert werden. Nach einem quasi-exponentiellen Zerfall nimmt die gemessene Lumineszenzlebensdauer mit zunehmender Sauerstoffkonzentration ab. Diese Beziehung kann auch mit dem vereinfachten Modell mit zwei Standorten beschrieben werden.Sobald die Optode kalibriert wurde, ist es möglich, die Sauerstoffkonzentration durch Abbildung der Lumineszenzlebensdauer zu bestimmen, wie in diesen Bildern beobachtet, in denen die Verteilung der Sauerstoffkonzentration in der Rhizosphäre von Littorella uniflora nach Lichteinwirkung von 500 Mikromol-Photonen pro Meter quadratisch pro Sekunde für 12 Stunden und nach 12 Stunden in dunkelheit abgebildet wurde. Neben Lebensdauerbildern können auch Strukturbilder unter äußerer Beleuchtung aufgenommen werden, wobei die bildgebende Geometrie so fixiert bleibt, dass die Sauerstoffbildgebung präzise mit dem Strukturbild korreliert werden kann. Sauerstoffkonzentrationsprofile über eine einzelne Wurzel können dann beispielsweise aus den in Dunkelheit und Licht aufgenommenen Bildern extrahiert werden.Es ist wichtig, einen guten Kontakt zwischen der Probenmatrix und der Optode zu haben, um unnötige Artefakte zu vermeiden. Wenn Sie Zweifel haben, remake das Sandwich. Die sofortige Erfassung eines Bildes in zerstörungsfreier Weise ermöglicht die Überwachung der Sauerstoffumgebung.Die Methode könnte ebenso gut mit anderen Optoden für pH-Wert oder andere Analyten kombiniert werden. Achten Sie darauf, Optode-Herstellung in einer Dunstabzugshaube durchzuführen, da der Sensorcocktail Chloroform enthält. Planare Optodes können verwendet werden, um mikrobielle Gemeinschaften im Sediment zu identifizieren.Und nach der Bildgebung kann das Sandwich geöffnet werden, um diese Hotspots für die mikrobielle Gemeinschaftsanalyse zu probieren.

Research

JoVE Journal

Chemistry

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Chemie

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