Name: luminescence lifetime imaging of o2 with a frequency-domain-based camera system
Uploaded: 2019-12-16T14:00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Luminescence Lifetime Imaging of O2 with a Frequency-Domain-Based Camera System at JoVE.com

אנו מודים לסופי לינדארד יאקובסן (אוניברסיטת קופנהגן) ולארס בורראשארד פדרסן (אוניברסיטת אורהוס) לקבלת סיוע טכני. מימון עבור מחקר זה הושג מענק סאפרה-Aude מתוך קרן מחקר עצמאית דנמרק (DFF-1323-00065B; MK), מענקי הפרויקט מקרן המחקר העצמאי דנמרק | מדעי הטבע (DFF-8021-00308B; MK) & מדעי הטכנולוגיה וההפקה (DFF-8022-00301B ו-DFF-4184-00515B; MK), הקרן הלאומית למחקר של דנמרק (DNRF136), ו-Poul Due ינסן קרן (KK).

הסופר גרהרד הולסט הוא עובד של PCO AG אשר מייצרת את מערכת המצלמה בשימוש במאמר זה. PCO AG תרם כספית לפרסום ולפתיחת עלויות גישה של מאמר זה.

בפרוטוקול זה, זרימת העבודה כולה מן ההכנה של אלקטרואופטיקה ל-O2 ניתוח תמונה מכוסה. על-ידי ביצוע פרוטוקול זה, ניתן להשיג תמונות כימיות באמצעות תדירות הרומן המבוססת על מצלמת המשך חיים מבוססי-תחום. בהתאם ליישום, אלקטרואופטיקה מישורי יכול להיות מפוברק בגדלים שונים ועובי שכבה של שכבת החיישן החל חזק 50-100 יקרומטר מישורי עבה בעובי של מספר עשיריות של סנטימטר מרובע כדי לכסות מיקרוסקופ כיסוי עם < 1 יקרומטר שכבות חיישן עבה6,40. הפוטנציאל של שיטה זו הוכח עם יישום מסוים, אבל הוא לא רק מוגבל O2 הדמיה במפעל ריזודורים12,28.
שיטה זו יש מספר יתרונות כאשר לעומת שיטות הדמיה כימית טהורה המבוססת על עוצמה. לומינסנציה הדמיה של חיים לא, או לפחות הרבה פחות, מושפע תאורה מחוספס, עובי אלקטרואופטיקה מחוספס, צילום הלבנת25. כמו כן, שיטה זו מונעת את השימוש בצבע התייחסות נוסף המשותף בהדמיה של טימטרי17,37. בהשוואה למערכות מבוססות חיים אחרות המבוססות על מערכות, כגון מצלמות בתחום הזמן הנפוץ מגודרת8,26, מערכת המצלמה הרומן ופרוטוקול הציג כאן יכול לספק תוצאות דומות. בפרסום האחרונות, המאפיינים האנליטיים של שתי מערכות אלה הושוו והוא נמצא כי התדר-התחום מבוסס על מערכת החיים מבוססי המצלמה היא לפחות להשוות את הזמן הופסק-תחום הפעילות הקדם8.
הצגנו את הפשוט ביותר O2 אלקטרואופטיקה המורכב רק מחוון במטריצה פולימר. מלבד מספר רב אחרים אפשריים O2 אינדיקטורים שעשויים לשמש תוספים ניתן לכלול, כלומר, פיזור סוכנים כגון TiO2 או אבקת יהלום2 כדי להגדיל את האות חיישן תוך הפחתת שקיפות של אלקטרואופטיקה. גם צבעים נוספים עשויים לשמש כדי לשפר את עוצמת האות באמצעות העברת אנרגיה41.
לייצור אלקטרואופטיקה מישורי, אנו ממליצים להשתמש בפער במכשיר ציפוי סכין של 75-120 יקרומטר כדי להניב עובי שכבת החיישן הסופי של סביב 7.5 כדי 12 יקרומטר לאחר אידוי הממס (סביב 10% הפער המשמש), כאשר באמצעות הרכב חיישן התיאור המתואר. זוהי פשרה טובה בין עוצמת האות, אשר ניתן לשנות על ידי טעינת צבע גבוה יותר, או על ידי בחירה של אינדיקטור וצבע התייחסות של בהירות גבוהה יותר, ואת זמן התגובה. עלייה בעובי השכבה גורמת לעלייה בזמן התגובה, כאשר טווח הזמן הנדרש עבור האנליטה להגיע לשיווי משקל תרמודינמי בשכבת החישה עם המדיה המקיפה מגביר12.
אלקטרואופטיקה, כפי שמתואר כאן, מגיבים לשינויים ב-O2 ריכוז בתוך כמה שניות17 תוך שהוא עדיין בעל אות האור חזק מספיק. ציפוי חיישן ultrathin עם זמני תגובה תת שנייה ניתן להבין עם ציפוי ספין6. אם התמיכה או המכשיר ציפוי סכין אינם מנוקים היטב, זה עלול לגרום לשכבות חיישן הומוגנית. כמו כן, כאשר הקוקטייל אינו הומוגנית לחלוטין או מוחל במהירות רבה מדי לאחר התפשטות מול המכשיר ציפוי כגון תוצאה לא רצויה ניתן לצפות. לכן, ייתכן שיהיה צורך בתרגול כדי להכין אופדים אופטימליים.
השיטה יכולה לשמש דגימות תמונה אשר ניתן לשים במגע קרוב אלקטרואופטיקה, כגון בעלי חיים ימיים מסוימים42, ביוילאמים6 ו קרקעות31 רק שם כמה. אנו מציגים התקנה עצמאית באמצעות מטרה, עם זאת, המצלמה יכולה בקלות להיות מצמידים למיקרוסקופ עבור הדמיה כימית ברזולוציה גבוהה43.
בזמן שהתחום הזמני המבוסס על חיים הדמיה מופעלת הדיכוי של הרקע הזריחה26, זה בעיה בעת שימוש בתדר חדש-מבוססי מערכת המחשבים המבוססת8. בשל רכישת תמונה רציפה, המצלמה הזאת יהיה להקליט כל הזריחה הרקע של המדגם שיכול להיות נרגש על ידי LED שנבחרו פולט בחלון ספקטרלי שנבחר כפי שהוגדר על ידי מסנן פליטה על המטרה המצלמה. הדבר יגרום לתקופת חיים נמוכה ככל הנראה, וכתוצאה מכך בקריאות שווא. במקרה שאתה עובד עם דגימות עם חופף משמעותי מהותי חופפים עם הריגוש O2 חיישן ופליטה, חיוני להחיל בידוד אופטי נוסף על גבי אלקטרואופטיקה, על ידי ציפוי שכבה נוספת המכילה פחמן שחור2,17. כך, רק לומינסנציה הנפלטת מן האופדה מישורי יגיע המצלמה. כדי לבדוק את האור ברקע תמונה ללא אלקטרואופטיקה ניתן לקחת, אשר באופן בלעדי להראות האור הפנימי של המדגם. ניתן גם להוסיף חומרים פיזור כגון TiO2 או אבקת יהלומים2,44, כדי קוקטייל חיישן, כדי להגדיל את עוצמת האור של המחוון צבע. עם זאת, זה יכול גם להוביל מהיר יותר צילום הלבנת ו-TiO2 הוא צילום זרז ידוע, אשר יכול לפגוע ביציבותphotostabilityלצבוע. היבט נוסף לשקול הוא אור הרקע. בעת הדמיה של תקופות חיים, יש להימנע מתאורת רקע באופן היעיל ביותר האפשרי. לכן, שיטת דימות זו מחייבת שההתקנה תוצב בסביבה חשוכה וכל מקור האור החיצוני צריך להיות מכובה זמנית במהלך רכישת תמונה.
לסיכום, הדמיה לכל החיים ההדמיה היא שיטת הדמיה כימית חזקה שניתן להתאים יישומים שונים רבים. פרוטוקול זה (ראה סעיף 1-5) מכסה את כל הצעדים החיוניים כדי ליצור תמונה O2 ומשתמש בתדירות הגמישה ביותר לתחום הדמיה מערכת הגלגול החיים, אשר יכול להחליף את מצלמה הזמן הופסק מתחם המחשב עבור 2D O2 דימות עם אלקטרואופטיקה מישורי.

התפלגות ודינמיקה של גזים ויונים מומס במשקעים וקרקעות מספקים מידע מרכזי על תהליכים ביו-כימיים כגון נשימה מיקרוביאלית1,2, או אובדן חמצן רדיאלי משורשי צמחים3,4,5, ומיקרואקולוגיה כימית של חיידקים6,7, צמח כדורים5,8,9 בעלי חיים בורוז10, 11,12. פעילות ביולוגית וכימית בסביבות מוגבלות מסוג זה יכולים ליצור מעברי צבע תלולים של מצעים כימיים או מוצרים של תהליכים ביוגיאוכימיים. במיוחד, O2 זמינות יש השפעה עצומה על תהליכים ביוגיאוכימיים ולכן ביולוגיה ואקולוגיה של מערכת13. משום כך, ניתוח O2 ריכוזי מרחבי המרחב הגבוה והרזולוציה הטמפורלית הוא בעל חשיבות עליונה במדעי המים והיבשה. ראשון, אלקטרוכימי מיקרוחיישנים אופטיים14,15 פותחו כדי למדוד את זה האנליטה חשוב. מאוחר יותר, 2 מימדי (2d) הדמיה של O2 עם אלקטרואופטיקה מישורי הוצגה12,16,17,18,19, אשר איפשר את ההדמיה ואת הקוונפיקציה של התפלגות o2 הטרוגנית קרקעות משקעים.
מישורי O2 אלקטרואופטיקה מורכב o2רגיש אינדיקטור מחוון20, אשר מומס פולימר מתאים21. צבע האינדיקטור נרגש באורכי גל אופטי מסוים ופולט אור אדום הוזז על הרפיה בצורה של לומינציה. בנוכחות O2, צבע מחוון נרגש יכול להעביר את האנרגיה שלה למולקולה O2 על התנגשות, אשר המכונה התנגשות מבוססי מבוסס לומיצ'ינג22. לכן, את עוצמת האור כמו גם את החיים האור מופחת עם הגדלת O2 ריכוז23. במקרה אידיאלי השינוי בעוצמה ובמשך החיים עוקב אחר משוואת שטרן-וולמר (משוואה 1) תוך שימוש בעוצמת האור או החיים בהעדר (אני0; τ0) או נוכחות (i, τ) של O2 בריכוז נתון [Q]. קבוע שטרן-Volmer (Ksv) הוא מדד לרגישות של האופדה לכיוון O2; KSV תלוי במשתנים סביבתיים כגון טמפרטורה ולחץ.
1<img align="center" src="/files/ftp_upload/60191/60191eq1.jpg">
הקלטת שינויים כאלה באור השמש חיישן מישורי עם מערכת המצלמה ניתן להשתמש כדי להמחיש את השינויים המתאימים בהתפלגות O2 . בתחילה, הדמיה פשוטה המבוססת על O2 דימות היה בשימוש18. עם זאת, מתודולוגיה כזו רגישה מאוד לאינטרפרעות חיצוניות, אשר מתפשרים על אמינות התוצאות בשל תאורה הטרוגנית, תנודות במקור העירור או המצלמה, כמו גם התפלגות אחידה של צבע האינדיקטור בתוך אלקטרואופטיקה מישורי.
חלק ממגבלות אלה ניתן להקל על ידי שימוש אלקטרואופטיקה מישורי עבור הדמיה טימטרי17,24, שם מחוון O2רגיש אינדיקטור הוא co-קיבוע בשכבת הפולימר של אלקטרואופטיקה מישורי עם צבע התייחסות רגיש פולט בטווח ספקטרלי שונה מאשר O2אינדיקטור. בהתבסס על תמונות פליטה שנרכשו בשני חלונות ספקטרלי, אות הפליטה הרגיש O2מחולק באות ההתייחסות, יצירת תמונת יחס שנוטה פחותלתוךהפרעות שהוזכרו לעיל 5,17. השיטה דורשת שימוש בצבע השני, אשר באופן אידיאלי יכול להיות נרגש על ידי אותו מקור עירור, אבל פולט באורך גל שונה (ללא חפיפה משמעותית ספקטרלי), בחלון ספקטרלי אחר של המצלמה (למשל, בערוץ צבע אחר של מצלמת RGB).
לחילופין, O2 הדמיה יכולה להיות מבוססת על ככמת את שינוי O2תלוי במשך החיים הזוהר של צבע מחוון, אשר אינו מושפע התאורה לא אחידה או הטרוגננים בריכוז אינדיקטור25. ראשון לומינסנציה החיים מבוסס O2 מערכות הדמיה היו מבוססים על מדידות בתחום הזמן עם שער ניתן טעונה מצמידים המכשיר (CCD) מערכת מצלמה26, שם מקור עירור פעמו משמש ותמונות לאור הם נלקחים על מרווחי זמן מוגדרים בתוך עירור או פליטה של המחוון8,23,27. מתוך תמונות כאלה, אורך חיים האור יכול להיקבע ומתואם הריכוז O2 המתאים בכיול. לאחר מכן, תמונות במשך החיים של האור עבור מדגם נתון לחצה נגד אלקטרואופטיקה מישורי ניתן להמיר תמונות של התפלגות דו-ממדית התואמת O2 ריכוז. מערכת זו נעשה שימוש ביישומים רבים הן במעבדה באתרו16,28, אבל מצלמת מצלמות חיוניות שער מסוגל הוא כבר לא זמין מסחרית.
לאחרונה, שוחרר מערכת מצלמת חיים שונה לאור השנים, הרוכשת תמונות בתדר-דומיין8. המערכת מסתמכת על מקור אור ברציפות מאופנן לעירור. זה יכול להיות גל sinusoidal או מרובע במקום עירור פעמו, אשר משמש לרכישת תמונה בתחום הזמן. אפנון זה מביא לפליטת הזדקנות מאופנן של צבע O2 מחוון, שהוא שלב מוזז על ידי זווית, φ, אשר תלויה בחיים האור של צבע מחוון (τ) (ראה משוואה 2).
2<img align="center" src="/files/ftp_upload/60191/60191eq2.jpg">
השינוי בין עירור לשרעת הפליטה (כלומר, מדד האפנון או העומק (משרעת המחולקת לאור מתמשך)) תלוי גם באורך החיים של האור. כך, על ידי הגדרת תדירות אפנון הידוע חיישן cmos מיוחד בתוך המצלמה הוא מסוגל למדוד את החיים לומינסנציה ב-ns לטווח μs כמתואר בפירוט במקום אחר 8,29,30. מדריך כללי על עקרון הפעולה ניתן למצוא (באמצעות הקישור הבא <a href="https://www.youtube.com/watch?v=xPAB_eVWOr8" target="_blank">https://www.youtube.com/watch?v=xPAB_eVWOr8</a>).
בפרוטוקול הבא, אנו מדגימים את השימוש במערכת המצלמה הרומן לדימות התפלגות של O2 ריכוז סביב השורשים של הצמח מים מתוקים מימיים ליטל orella אניפלורה ב 2d9,31. היינו רוצים להדגיש כי שיטה זו היא בשום דרך לא מוגבלת יישום זה. אופדות רגישים לחמצן או חלקיקי חיישן27 בשילוב עם שיטות דימות שונות שימשו במחקר רפואי32, ב ביורינטינג33, עבור צבעים רגישים ללחץ34,35, או ללמוד מערכות פוטוסינתטית2,36,37, רק לתת שם כמה תחומים אחרים של יישום.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Air pump with air stone and water pump</td>
			<td>Local aquarium store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>67-66-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC4 silicone compound</td>
			<td>Dow Corning GmbH</td>
			<td>2793695</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas mixer</td>
			<td>V&#246;gtlin Instruments GmbH</td>
			<td>red-y compact meter GCM</td>
			<td>This is just one possible instrument. Several companies offer gas mixing devices</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass plates and aquaria</td>
			<td>Local aquarium or hardware store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Freely available imaging software (imagej.nih.gov/ij/index.html)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knife-coating device</td>
			<td> 
			 
			BYK-GARDNER GMBH byk.com</td>
			<td>2021</td>
			<td>This is a four sided film applicator enabling easy variation of the film thickness. Other versions are also available. We recommend a thickness of the applied film between 75-120 &#181;m, which yields a final sensor layer thickness of ~10% of the applied thickness before solvent evaporation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED lamp, Reflector PAR38</td>
			<td>Megaman</td>
			<td>MM17572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED LEDHUB</td>
			<td>Omicon Laserage, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Can be configured with a variety of LEDs. For the presented example, the green LED (528 nm) is essential</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LOCTITE AA 3494</td>
			<td>Henkel AG &#38; Co. KGaA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Acrylic-based instant adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements AR Software</td>
			<td>Nikon Inc</td>
			<td></td>
			<td>Software package used for image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pco.flim</td>
			<td>PCO AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Frequency domain based luminescence lifetime camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>platinum(II)-5,10,15,20-tetrakis-(2,3,4,5,6-pentafluorphenyl)-porphyrin (PtTFPP)</td>
			<td>Frontier Scientific</td>
			<td>PtT975</td>
			<td>O2 indicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene terephthalate (PET) foil</td>
			<td>Goodfellow</td>
			<td>320-992-72</td>
			<td>Such foils might also be found from other providers and serve as solid support</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene (PS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9003-53-6</td>
			<td>Polymer matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schott RG610 filter</td>
			<td>www.uviroptics.com</td>
			<td></td>
			<td>Here 52mm screw on Filters can obtained. Other sources offer square glass filters from Schott glass that can be fixed in front of the objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl electrical tape</td>
			<td>Scotch, Super 33+</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Makro Planar 2/100 with Hama C for Nikon adaptor</td>
			<td>delivered with the camera</td>
			<td></td>
			<td>Here any other objective might also be used in combination with an adaptor if the objective does not have a C-mount</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

luminescence lifetime imaging of o2 with a frequency-domain-based camera system

אנו מתארים שיטה התמונה מומס חמצן (O2), ב 2d ב מרחבית גבוהה (< 50-100 μm) ו הזמני (< 10 s) החלטה. השיטה מעסיקה O2 בעלי חיישן האור הזורח רגיש (אלקטרואופטיקה מישורי) בשילוב עם מערכת מצלמה מיוחדת עבור הדמיה לאור החיים בתחום התדר. אלקטרואופטיקה מישורי מוכנים על ידי המסת הצבע O2רגיש אינדיקטור פולימר והפצת התערובת על תמיכה מוצקה בעובי מוגדר באמצעות ציפוי סכין. לאחר אידוי של הממס, אלקטרואופטיקה מישורי ממוקם במגע קרוב עם מדגם של עניין-כאן הפגינו עם שורשי הצמח הימי המים הקטנים Orella. O2 שינוי תלוי ריכוז במשך החיים לאור של צבע מחוון בתוך אלקטרואופטיקה מישורי היא התמונה באמצעות הישבן של הנושא שקוף רדיד הקיר אקווריום באמצעות מצלמה מיוחדת. מצלמה זו מודדת את אורך החיים האור (μs) באמצעות משמרת בזווית הפאזה בין אות עירור מאופנן ואות פליטה. שיטה זו עדיפה על האור האור שיטות הדמיה, כמו האות אינו תלוי בריכוז הצבע או האינטנסיביות של מקור עירור, והוא מסתמך אך ורק על הזמן ניוון הלומיאלי, שהוא פרמטר מיסודה ההפניה. כתוצאה מכך אין צורך להוסיף צבע התייחסות נוסף או אמצעים אחרים להפניה. אנו להדגים את השימוש במערכת עבור מאקרוסקופי O2 הדמיה של הצמח הריון, אבל מערכת המצלמה יכול גם בקלות להיות מצמידים למיקרוסקופ.

כדוגמה ליישום עבור מערכת ההדמיה החדשה, אנו מראים 2D O2 הדמיה של מדגם ביולוגי מורכב (כלומר, הריון של צמח המים הקטן orella).
ראשית, השיטה מתארת את הייצור של סרט חיישן מישורי, אלקטרואופטיקה כביכול מישורי. כפי שנראה באיור 1, מעין אופדה זו עשויה משכבה דקה של אינדיקטור אופטי במטריצה הכפולה התפשטה בתמיכה שקופה. בעקבות הפרוטוקול המתואר, הסרט חיישן הומוגנית עם עובי אחיד, כפי שהוגדר על ידי הפער של המכשיר ציפוי הסכין, מתקבל. אם לאופדה המיוצר יש התפלגות בחומר החיישן לא סדיר (למשל, חורים בציפוי, מראה פסים, או אגרגטים לצבוע (זה יכול להיות מוערך חזותית, ובאופן חזותי בעזרת מנורת UV)), הפרוטוקול צריך לחזור על כל החומרים צריך להיות ניקה ביסודיות באמצעות אצטון.
לאחר אלקטרואופטיקה מישורי מוכן, המדגם ניתן להביא במגע הקרוב עם שכבת חישה של אלקטרואופטיקה מישורי, כפי שמוצג כאן עם אלקטרואופטיקה מישורי משולבים בחדר כריך ריזוזו, שם השורשים של צמח בתוך מטריצת משקעים שמסביב יכול להיות ממוקם במגע קרוב אלקטרואופטיקה מישורי (איור 2). אם הוא מוכן נכון, החדר של כריך ריזו-סנדוויץ ' צריך להיות ניידים בקלות מאקווריום אחד (דגירה) לאחר (מדידה). אם לא נבנה כראוי, החדר הסנדוויץ ' ריזו-סנדביץ ' עשוי להיות מסוגל, לאבד משקעים או להכיל בועות אוויר. הבדיקה החזותית של החדר הסנדוויץ ' הישר אחרי ההרכבה מומלצת לכן.
הפרוטוקול הנתון מאפשר תדר-תחום מבוסס האור החיים מבוססי הדמיה של המדגם במגע עם אלקטרואופטיקה מישורי באמצעות תדר-דומיין מבוססי מצלמה מבוסס חיים. פרטים נוספים על מערכת מצלמה זו כגון המצב של רכישת תמונה ומאפייני מצלמה משלימה תחמוצת מתכת-מוליך למחצה (scmos) מאפיינים ניתנים בפרסומים האחרונים8,29.
הכיוונון עצמו הוא פשוט למדי וכולל רק את המצלמה השולטת מקור אור (במקרה זה, מקור עירור של LED) ואת המדגם עם אלקטרואופטיקה (איור 3). ודא שכל החלקים מחוברים כראוי ושהמדגם מואר באופן הומוגנטי. יש להימנע מתאורת רקע בעת יצירת מדידות מקדימות.
לפני הדמיה של המדגם, את האופדה צריך להיות מכויל. כפי שנראה באיור 4א, משך החיים הנמדד מקטין עם הגדלת O2 ריכוז בעקבות ריקבון מעריכי. ניתן לתאר מערכת יחסים זו גם באמצעות מודל דו-האתר הפשוט (איור 4ב' ומשוואה 3). בדוגמה הנתונה, הפרמטרים הנחוצים לחישוב הריכוז O2 היו כלאחר מכן; τ0 = 56.26 μs, KSv = 0.032 hpa-1 ו- f = 0.86.
ביצוע כיול הוא גם דרך אידיאלית לבדוק שהמערכת פועלת כהלכה. אם כל הרכיבים מותקנים כמתואר כאן (או בתוך הקווים המנחים של היצרנים), תקופת החיים הנמדדת צריכה להראות את אותו התלות O2 כפי שנראה באיור 4. בנוסף, עבור אותו שילוב של O2 חומרי חישה (פולימר וצבען), τ0 נמדד צריך להיות בטווח זהה (± a כמה μs) כפי שנמדד כאן (בעיקר מושפע הטמפרטורה הניסיונית). אם לא ניתן לקבל עקומת כיול דומה, ודא שכל השלבים הופעלו בצורה נכונה. לפעמים האופדה מקובע בטעות עם הצד הרגיש שפונה לקיר הזכוכית ולא במדגם, או שהתמונות שנרכשו הן מעל או חשופות.
עם פרמטרי הכיול, ניתן לקבוע את הריכוז O2 על ידי הדמיה של חיים האור (τ). זה מוצג באיור 5A, B, שבו התפלגות של O2 ריכוז בריזוספירה של היוניפלורה הקטנה והקטנה היה התמונה באפלה ולאחר חשיפה לאור 500 μm הפוטונים מ-2 s-1 עבור 12 h, בהתאמה. בשל הפעילות הפוטוסינתטית של המפעל, הריכוז O2 בתוך הריזוספירה גדל לאחר חשיפה לאור. מלבד תמונות החיים, גם "מבנית" תמונות ניתן לרכוש תחת תאורה חיצונית, תוך שמירה על הגיאומטריה הדמיה קבוע. בדרך זו, O2 תמונות יכול להיות מתואם בדיוק את התמונה המבנית (איור 5ג), לחצות סעיפים או אזורים של עניין. כדוגמה, O2 פרופילי ריכוז על פני שורש אחד חולצו מהתמונה שנרכשה בחושך ובאור, בהתאמה (איור 5ד).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60191/60191fig1a.jpg"> איור 1: ייצור מישורי O2 אופדה. (א) רדיד מחמד הוא קבוע על צלחת זכוכית המכשיר ציפוי סכין מושם על נייר הכסף. (ב) קוקטייל החיישן המוכן מתפשט על רדיד המחמד כמו קו דק מול המכשיר ציפוי סכין. (ג) המכשיר ציפוי סכין מועבר כלפי מטה כדי להפיץ את הקוקטייל חיישן כמו סרט דק על רדיד המחמד, אשר לאחר אידוי הממס תוצאות מוכן להשתמש אלקטרואופטיקה מישורי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60191/60191fig1alarge.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60191/60191fig2a.jpg"> איור 2: האסיפה הקאמרית של הכריך עם שילוב של מישורי O2 אלקטרואופטיקה. (א) אלקטרואופטיקה מתוקנת על אחת מלוחות הזכוכית באמצעות סרט מים. (ב) האופדה מודבק לצלחת עם הקלטת החשמלית. (ג) משקע מתמלא לתוך הלוחית הנגדית עם החללים המצורפים (כלומר, שקופיות מיקרוסקופ). (ד) שורשי הצמחים מונחים על המשקע הנפרש באופן שווה. (ה) חדר הכריך של ריזו-סנדוויץ ' סגור ותוקן באופן זמני עם מלחציים. (ו) נסגר לגמרי והורכב מחדר סנדוויץ '. (G) כדי להגן על אלקטרואופטיקה מפני חשיפה באור על ידי מנורת הדגירה וכדי למנוע צמיחה פריחת אצות כיסוי פלסטיק ממוקם על הקאמרית התאספו-סנדוויץ '. (ח) חדר הסנדוויץ ' הישן מתחזה באקווריום. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60191/60191fig2alarge.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60191/60191fig3a.jpg"> איור 3: הגדרת הדמיה המכילה את התדר המבוסס על מצלמה מבוססת-תחום, עם המטרה המתמקדת במדגם עם אלקטרואופטיקה מאחור דרך האקווריום השקוף והקירות הקאמריים של כריך. מדריך האור של מקור עירור ה-LED ממוקם כדי להאיר את המדגם באופן שווה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60191/60191fig3alarge.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60191/60191fig4a.jpg"> איור 4: כיול עקומות עבור מישורי O2 אלקטרואופטיקה. (A) תקופות חייםזרחתיים שונות הנמדד בריכוזים של O 2 בחדר הכיול מלא המים. (ב) שטרן-וולמר של נתוני הכיול הותאמו באמצעות מודל שני האתרים הפשוט ביותר לקוצ'ינג דינמי (משוואה 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60191/60191fig4alarge.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60191/60191fig5a.jpg"> איור 5: הדמיה של גלגול החיים של התפלגות O2 בתוך הצמח הימי של המפעל הימי הקטן orella. (A) O2 הפצה לאחר שמירה על הצמח מתחת לאור עבור 12 h ב כ 500μ:4 -1. (ב) O2 הפצה לאחר שמירה על המפעל בחושך עבור 1 h. (ג) דמות מבנית של שורשי הצמח כפי שנראה דרך אלקטרואופטיקה מישורי. (ד) חתך הרוחב2 פרופיל הריכוז (המיקום מצוין על ידי הקו הצהוב בלוח A ו-B) לאחר 12 h באור (אדום) ו-1 h בחשיכה (שחור). הותאם בהיתר מ (קורן, ק., מוסקוביץ ', מ., שולס, V. V., בוריסוב, ס, הולסט, ג, קוהל, מ. לומינסנציה הדמיה של החיים של חיישנים כימיים-השוואה בין מחשבים-תחום ומערכות תדר מבוסס-תחום מצלמה. כימיה אנליטית. 91 (5), 3233-3238, דוי: 10.1021/acs. המאמאנכימיה 8b05869 (2019)). זכויות יוצרים (2019) האגודה האמריקנית לכימיה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60191/60191fig5alarge.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Luminescence Lifetime Imaging of O2 with a Frequency-Domain-Based Camera System at JoVE.com

Luminescence Lifetime Imaging of O2 with a Frequency-Domain-Based Camera System

אנו מתארים את השימוש של רומן, תדר-תחום מצלמה לאורך החיים עבור מיפוי 2D O2 הפצות עם משטח חיישן אופטי. מערכת המצלמה וניתוח התמונה הליכים מתוארים יחד עם ההכנה, כיול ויישום של כנפונים חיישן עבור המחשה O2 מיקרו הסביבה בריזוספירה של צמחים ימיים.

לומינסנציה הדמיה של החיים של O2 עם תדר-מערכת מבוססי התחום מצלמה

We describe a method to image dissolved oxygen (O2), in 2D at high spatial (&#60; 50-100 &#181;m) and temporal (&#60; 10 s) resolution. The method employs ...

כמקבל האלקטרונים הטוב ביותר, חמצן ממלא תפקיד מכריע במערכות ביולוגיות. עם פרוטוקול זה, אתה יכול תמונה התפלגות החמצן ב 2D באמצעות optode. בנוסף לרזולוציה המרחבית והטמפוראלית הגבוהה שלה, שיטה זו אינה דורשת צבע ייחוס נוסף, היא חזקה ביותר, ומאפשרת רכישת תמונה מבנית.שיטה זו יכולה להיות מיושמת על תחומי מחקר שונים שבהם חמצן ממלא תפקיד מפתח כולל אקולוגיה, מחקר רפואי, הדפסה ביולוגית, והדפסה רגישה ללחץ. ייצור optode יכול להיות מאתגר כמו כמות הקוקטייל הוסיף רדיד התמיכה ואת מהירות הגרירה של מכשיר ציפוי הסכין עשוי לדרוש אופטימיזציה ותרגול. עם תרומת וידאו זו, אנו רוצים להפוך טכניקה רבת עוצמה זו נגישה לחוקרים מתחומי מחקר אחרים.כדי להכין optode חמצן מישורי, תחילה להשתמש בסרט של מים או 70% אתנול כדי לתקן רדיד PET נקי ללא אבק על צלחת זכוכית נקייה. מניחים מכשיר ציפוי סכין 120 מיקרומטר נקי על נייר הכסף ולהשתמש פיפטה זכוכית להחיל קו של קוקטייל חיישן מול המכשיר. לאחר מכן, גרור את מכשיר ציפוי הסכין לאט ואחיד מעל רדיד ה- PET כדי להפיץ את הקוקטייל באופן שווה.לאחר מכן לייבש את optode רגיש חמצן פלנאר סיים באוויר הסביבה במשך שעה אחת לפני ייבוש לילה ארון מחומם ב 50 עד 60 מעלות צלזיוס. עד למחרת בבוקר, הושגה שכבה בעובי של כ-12 מיקרומטר. אחסן את האופטודה המוגנת מפני אור עד לשימוש נוסף.להכנת תא סנדוויץ' ריזו, השתמשו בדבק מיידי קל לריפוי כדי להדביק מגלשות מיקרוסקופ לאורך קצות צלחת זכוכית ולהשאיר קצה אחד ארוך פתוח. חותכים את optode מישור לתוך הצורה והגודל הנדרשים כדי להתאים את החלל בין שקופיות מיקרוסקופ מודבקים למקם את optode בצד הפנימי של צלחת הזכוכית הקדמית עם הצד מצופה כלפי מעלה. קלטת קצה אחד של רדיד optode לצלחת הזכוכית ולהוסיף מי ברז בין צלחת הזכוכית ואת רדיד optode.לאט לאט להוריד את רדיד אלומיניום על טיפות מים המאפשר optode ליישר את עצמו על משטח הזכוכית ולהשתמש ברקמה רכה כדי להסיר בזהירות בועות אוויר לכודים בין optode ואת הצלחת. לאחר מכן לנגב את צלחת הזכוכית יבשה קלטת הקצוות הנותרים של נייר כסף לצלחת. לאחר מכן, השתמש צלחת זכוכית שטוחה כדי להפיץ 0.5 מילימטרים מסננים מסיסים באופן שווה על פני הצלחת לאותו עובי כמו מפזרי המחוון מיקרוסקופ.נקו בזהירות את המשטח העליון של מגלשת המיקרוסקופ כדי להבטיח שצלחת הזכוכית השנייה תאטם את התא כראוי ותחיל גריז סיליקון על משטח השקופיות של המיקרוסקופ. ואז לכסות את המעים עם סרט דק של מים תוך הימנעות בזהירות היווצרות של בועות אוויר. לפני הנחת מדגם על המעים, בזהירות לשטוף ירייה אחת של ליטורלה uniflora ולמקם את לירות על מעים עם העלים בולטים מהצד הפתוח העליון.כאשר המדגם נמצא במקום, מניחים את צלחת הזכוכית עם optode על המעים ולהחיל לחץ עדין כדי להביא את optode במגע הדוק עם שורשי הצמח ואת המעים שמסביב. השתמש מלחציים כדי להדק את הצלחות יחד ולייבש את הקצוות החיצוניים עם נייר טישו. מוסיפים שוב ושוב כמה טיפות מים לעלים כדי לשמור על הצמח hydrated לאורך כל ההרכבה של כריך rhizo ולהשתמש סרט חשמלי ויניל להדק את תא כריך rhizo.לאחר מכן לאטום את הקצוות עם חימר דוגמנות וקלטת חשמלית נוספת. כדי להתכונן להדמיה, להסיר את רדיד הכיסוי מאזור optode לאחר הדגירה ולמקם את תא כריך rhizo עם קיר הזכוכית עם optode זקוף על קיר האקווריום. השתמש במרחב כדי ללחוץ על תא כריך rhizo על הקיר.מקם את המצלמה לכל החיים מבוססת תחום התדרים המצוידת במטרה מול האקווריום ותחום העניין. חבר מסנן פליטה מתאים להדמיית צבע המחוון למטרת המצלמה ותקן את מדריך האור במקור העירור LED. לאחר מכן למקם את המדריך, כך שהוא יאיר באופן שווה את רדיד optode planar המכסה את שטח העניין.בתוכנת ההדמיה, בחר את המצלמה ובחר את ה-LED בתוכנת בקרת ה-LED. הגדר את עוצמת ה-LED לפי הצורך ותסמן אנלוגי וסנכרון כדי לאשר שהנורית מופעלת על-ידי הלוגיקה הטרנזיסטורית-טרנזיסטורית החיצונית. למקד את המצלמה באופן ידני ולהתאים את הצמצם האובייקטיבי ולהגדיר את מקור אפנון פנימי, גל סינוס עבור צורת הגל פלט, דגימת פאזה נוספת, דגימות שמונה פאזה, סדר פאזה ממול, הקש על A B readout, וחמישה תדר אפנון קילוהרץ.התאם את זמן החשיפה עד שקריאת סטטיסטיקת אזור הריבית עבור תמונת עוצמת האור המנורמלת נמצאת בטווח של 0.68 עד 0.72. לאחר מכן לחץ על הפניה ללכידה כדי להתחיל ברכישת סדרת מדידת ייחוס. כדי לכייל את האופטודה, השתמשו במכשיר ערבוב גז כדי לשטוף את המים באקווריום כיול עם תערובת גז חנקן אוויר סביבתי עם ריכוז חמצן ידוע המנטר את ריכוז החמצן באמצעות בדיקה חיצונית עם חיישן חמצן.לאחר מכן לרכוש סדרה של תמונות בריכוזי חמצן שונים בתא הכיול כדי לקבל עקומה נכונה להתאים את נתוני הכיול שנרכשו. כאשר המערכת מכוילת, לכבות את האורות החלת הקרנה על הצמח ועל כל מקורות האור האחרים ולהתאים את זמן הרכישה בהתבסס על עוצמת התמונה כדי להבטיח כי האות הוא לא רווי מדי ולא חלש מדי עבור יחס אות לרעש טוב בקביעת החיים. כאשר כל התמונות של אורך חיי החמצן נרכשו, הפעל מחדש את האורות כדי לקבל תמונה מבנית ולקבל תמונה עם סרגל בשדה התצוגה כדי לאפשר שינוי קנה מידה עוקב של התמונות שנרכשו.לפני הדמיית הדגימה, optode חייב להיות מכויל. לאחר ריקבון מעין-אקספוננציאלי, משך החיים של האלוהות הנמדדת פוחת ככל שריכוז החמצן עולה. ניתן לתאר קשר גומלין זה גם באמצעות מודל שני האתרים המפושט.לאחר האופטימודה כבר מכויל, ניתן לקבוע את ריכוז החמצן על ידי הדמיה של אורך החיים זוהר כפי שנצפה בתמונות אלה שבהן התפלגות ריכוז החמצן ב rhizosphere של ליטורלה uniflora היה בתמונה לאחר חשיפה לאור 500 פוטונים micromole למטר בריבוע לשנייה במשך 12 שעות ואחרי 12 שעות בחושך. בנוסף לתמונות לכל החיים, ניתן לרכוש תמונות מבניות גם תחת תאורה חיצונית תוך שמירה על גיאומטריית ההדמיה קבועה כדי לאפשר להדמיית החמצן להיות מתואמת במדויק לתמונה המבנית. פרופילי ריכוז חמצן על פני שורש אחד למשל ניתן לחלץ מן התמונות שנרכשו בחושך ואור.זה קריטי כדי לקבל קשר טוב בין מטריצת מדגם optode כדי למנוע חפצים מיותרים. אם יש לך ספק, לחדש את הכריך. רכישה מיידית של תמונה באופן לא הרסני מאפשרת ניטור של סביבת החמצן.השיטה יכולה גם להיות משולבת עם optodes אחרים עבור pH או analytes אחרים. הקפד לבצע ייצור optode במכסה המנוע אדים כמו קוקטייל החיישן מכיל כלורופורם. Optodes Planar ניתן להשתמש כדי לזהות קהילות מיקרוביות במעים.ואחרי ההדמיה, ניתן לפתוח את הכריך כדי לדגום את הנקודות החמות האלה לניתוח קהילתי מיקרוביאלי.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Luminescence Lifetime Imaging of O2 with a Frequency-Domain-Based Camera System

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

הכנת תאים חסידים הדמיה הקרינה רנטגן על ידי קיבוע כימי

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Water in Oil Emulsions: A New System for Assembling Water-soluble Chlorophyll-binding Proteins with Hydrophobic Pigments

המים אמולסיות שמן: מערכת חדשה להרכבת חלבונים מסיסים במים כלורופיל מחייב עם פיגמנטים הידרופובי

Chlorophylls (Chls) and bacteriochlorophylls (BChls) are the primary cofactors that carry out photosynthetic light harvesting and electron transport. ...

Visualization of Ambient Mass Spectrometry with the Use of Schlieren Photography

ויזואליזציה של ספקטרומטריית אמביינט המוני עם השימוש של צילומי שליארן

This manuscript outlines how to visualize mass spectrometry ambient ionization sources using schlieren photography. In order to properly optimize the mass ...

A Simple, Low-cost, and Robust System to Measure the Volume of Hydrogen Evolved by Chemical Reactions with Aqueous Solutions

פשוט, בעלות נמוכה, ואת מערכת חזקה כדי למדוד את הנפח של מימן התפתח באמצעות תגובות כימיות עם תמיסות מימיות

There is a growing research interest in the development of portable systems which can deliver hydrogen on-demand to proton exchange membrane (PEM) ...

Measurements of Long-range Electronic Correlations During Femtosecond Diffraction Experiments Performed on Nanocrystals of Buckminsterfullerene

מדידות של מתאמים אלקטרונית לטווח ארוך במהלך הניסויים עקיפה הפמטו-שנייה מתבצע על Nanocrystals של Buckminsterfullerene

The precise details of the interaction of intense X-ray pulses with matter are a topic of intense interest to researchers attempting to interpret the ...

Time-resolved Photophysical Characterization of Triplet-harvesting Organic Compounds at an Oxygen-free Environment Using an iCCD Camera

זמן לפתור Photophysical אפיון של שלישיה-קציר תרכובות אורגניות ללא חמצן-הסביבה שימוש iCCD המצלמה

Here, we present a sensible method of the acquisition and analysis of time-resolved photoluminescence using an ultrafast iCCD camera. This system enables ...

Regioselective O-Glycosylation of Nucleosides via the Temporary 2',3'-Diol Protection by a Boronic Ester for the Synthesis of Disaccharide Nucleosides

Regioselective O-Glycosylation of Nucleosides via the Temporary 2',3'-Diol Protection by a Boronic Ester for the Synthesis of Disaccharide Nucleosides

Regioselective O- גליקוזילציה של נוקלאוזידים via זמני 2', 3'-Diol הגנה על ידי אסתר Boronic לסינתזה של דו-סוכר נוקלאוזידים

Disaccharide nucleosides, which consist of disaccharide and nucleobase moieties, have been known as a valuable group of natural products having ...

Synthesis and Structure Determination of &#181;-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities

Synthesis and Structure Determination of ÃƒÆ’Ã¢â‚¬Å¡Ãƒâ€šÃ‚Âµ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities

סינתזה וקביעת מבנה ממוצע-Conotoxin Isomers PIIIA עם Connectivities דיסולפידי שונים

Peptides with a high number of cysteines are usually influenced regarding the three-dimensional structure by their disulfide connectivity. It is thus ...

Automation of a Positron-emission Tomography (PET) Radiotracer Synthesis Protocol for Clinical Production

Automation of a Positron-emission Tomography PET Radiotracer Synthesis Protocol for Clinical Production

אוטומציה של טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים (PET) Radiotracer סינתזה פרוטוקול לייצור קליני

The development of new positron-emission tomography (PET) tracers is enabling researchers and clinicians to image an increasingly wide array of biological ...

Solid Phase 11C-Methylation, Purification and Formulation for the Production of PET Tracers

Solid Phase 11C-Methylation, Purification and Formulation for the Production of PET Tracers

שלב מוצק 11ג-מתילציה, טיהור וניסוח לייצור מנותבים PET

Routine production of radiotracers used in positron emission tomography (PET) mostly relies on wet chemistry where the radioactive synthon reacts with a ...