Name: luminescence lifetime imaging of o2 with a frequency-domain-based camera system
Uploaded: 2019-12-16T14:00:00
Duration: 8 min 35 s
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Ringraziamo Sofie Lindegaard Jakobsen (Università di Copenaghen) e Lars Borregaard Pedersen (Università di Aarhus) per l'assistenza tecnica. I finanziamenti per questo studio sono stati ottenuti da una sovvenzione di Sapere-Aude Advanced dell'Independent Research Fund Denmark (DFF-1323-00065B; MK), sovvenzioni ai progetti dell'Independent Research Fund Danimarca Scienze naturali (DFF-8021-00308B; MK) & Scienze Tecniche e di Produzione (DFF-8022-00301B e DFF-4184-00515B; MK), la Danish National Research Foundation (DNRF136) e la Poul Due Jensen Foundation (KK).

L'autore Gerhard Holst è un dipendente di PCO AG che produce il sistema di telecamere utilizzato in questo articolo. PCO AG ha contribuito finanziariamente alla pubblicazione e ai costi di accesso aperto di questo articolo.

In questo protocollo, viene coperto l'intero flusso di lavoro dalla preparazione dell'optode all'analisi delle immagini O2. Seguendo questo protocollo, le immagini chimiche possono essere ottenute utilizzando la nuova fotocamera a vita di luminescenza basata su dominio di frequenza. A seconda dell'applicazione, gli optodi planari possono essere fabbricati in varie dimensioni e spessore dello strato dello strato del sensore che vanno da robusti optodi planari spessi 50-100 m di diversi decimi quadrati a scivolamenti di copertura al microscopio con strati di sensore <1 m di spessore6,40. Il potenziale di questo metodo è stato dimostrato con una particolare applicazione, ma non è solo limitato all'imaging O2 nelle rizosfere vegetali12,28.
Questo metodo ha diversi vantaggi rispetto ai metodi di imaging chimico basati sull'intensità della luminescenza pura. L'imaging a vita di luminescenza non è, o almeno molto inferiore, influenzato da un'illuminazione irregolare, spessore di optode irregolare e sbiancamento fotografico25. Inoltre, questo metodo evita l'uso di un tintura di riferimento aggiuntiva comune nell'imagingratiometrico 17,37. Rispetto ad altri sistemi di telecamere a vita, come le telecamere gated time-domain di uso comune8,26, il nuovo sistema di telecamere e il protocollo qui presentati possono fornire risultati comparabili. In una recente pubblicazione, le caratteristiche analitiche di questi due sistemi sono state confrontate e si è scoperto che il sistema di telecamere a vita a vita di luminescenza basato su frequenza-dominio è almeno paragonabile al predecessore basato su dominio temporaleinterrotto 8.
Abbiamo presentato la più semplice optode O2 costituita solo da un indicatore in una matrice polimerica. Oltre a molti altri possibili indicatori O2 20 che potrebbero essere utilizzati additivi possono essere inclusi, cioè agenti di dispersione come TiO2 o polvere di diamante2 per aumentare il segnale del sensore riducendo la trasparenza dell'optode. Anche coloranti aggiuntivi potrebbero essere utilizzati per migliorare l'intensità del segnale tramite trasferimento di energia41.
Per la fabbricazione di optodi planari, si consiglia di utilizzare uno spazio nel dispositivo di rivestimento del coltello di 75 - 120 m per produrre uno spessore finale dello strato del sensore di circa 7,5 a 12 m dopo l'evaporazione del solvente (circa il 10% dello spazio utilizzato), quando si utilizza la composizione del cocktail del sensore descritto. Questo è un buon compromesso tra l'intensità del segnale, che può essere modificato da un maggiore carico di tinture, o scegliendo indicatore e coloranti di riferimento di maggiore luminosità e tempo di risposta. Un aumento dello spessore dello strato comporta un aumento del tempo di risposta, poiché l'intervallo di tempo necessario all'analita per raggiungere un equilibrio termodinamico nello strato di rilevamento con il supporto circostante aumentadi 12.
Gli optodi, come descritto qui, reagiscono ai cambiamenti di concentrazione di O2 entro pochi secondi17 pur avendo un segnale di luminescenza sufficientemente forte. I rivestimenti dei sensori ultrasottili con tempi di risposta al secondo possono essere realizzati con spin-coating6. Se il supporto o il dispositivo di rivestimento del coltello non sono ben puliti, potrebbe causare strati di sensori inomogenei. Inoltre, quando il cocktail non è completamente omogeneo o applicato troppo rapidamente dopo la diffusione davanti al dispositivo di rivestimento un tale risultato indesiderato può essere osservato. Pertanto, potrebbe essere necessario un po 'di pratica per preparare optodi ottimali.
Il metodo può essere utilizzato per l'immagine di campioni che possono essere messi a stretto contatto con l'optode, come alcuni animali marini42, biofilm6 e suoli31 solo per citarne alcuni. Vi presentiamo una configurazione autonoma utilizzando un obiettivo, tuttavia, la fotocamera può essere facilmente accoppiata ad un microscopio per l'imaging chimico ad alta risoluzione43.
Mentre l'imaging a vita di luminescenza basato su dominio temporale ha consentito la soppressione della fluorescenza di fondo26, si tratta di un problema quando si utilizza il nuovo sistema di telecamere basato su dominio di frequenza8. Grazie all'acquisizione continua dell'immagine, questa fotocamera registrerà qualsiasi fluorescenza di fondo del campione che può essere eccitata dal LED selezionato ed emette nella finestra spettrale selezionata come definito dal filtro di emissione sull'obiettivo della fotocamera. Questo si tradurrà in una durata apparentemente inferiore e di conseguenza in false letture. Nel caso in cui si lavori con campioni con una significativa fluorescenza intrinseca sovrapposta all'eccitazione e all'emissione del sensore O2, è essenziale applicare un isolamento ottico aggiuntivo sopra l'optode, ricoprendo uno strato aggiuntivo contenente il nero carbonio2,17. Così, solo la luminescenza emessa dall'optode planare raggiungerà la fotocamera. Al fine di verificare la luminescenza di sfondo può essere presa un'immagine senza l'optode, che poi mostrerebbe esclusivamente la luminescenza intrinseca del campione. È anche possibile aggiungere agenti di dispersione come TiO2 o polvere di diamante2,44, al cocktail del sensore, per aumentare l'intensità della luminescenza del tinio indicatore. Tuttavia, questo può anche portare a più veloce foto sbiancamento e TiO2 è un noto foto-catalizzatore, che può compromettere la fotostabilità di un colorante41. Un altro aspetto da considerare è la luce di fondo. Quando si immagina la durata della luminescenza, la luce di fondo deve essere evitata nel modo più efficiente possibile. Pertanto, questo metodo di imaging richiede che la configurazione sia posizionata in un ambiente scuro e qualsiasi sorgente luminosa esterna deve essere temporaneamente spenta durante l'acquisizione dell'immagine.
In sintesi, l'imaging a vita della luminescenza è un metodo di imaging chimico robusto che può essere adattato a molte applicazioni diverse. Questo protocollo (vedere la sezione 1 - 5) copre tutti i passaggi essenziali per generare un'immagine O2 e utilizza il sistema di imaging a vita di luminosità del dominio di frequenza attualmente più flessibile, che può sostituire la fotocamera del dominio temporale interrotta per l'imaging 2D O2 con optodi planari.

La distribuzione e la dinamica di gas e ioni disciolti nei sedimenti e nei suoli forniscono informazioni chiave sui processi biogeochimici come la respirazione microbica1,2, o la perdita radiale di ossigeno dalle radici vegetali3,4,5, e il microambiente chimico dei microbi6,7, rizosfere vegetali5,8,9 e tane animali10, 11,12. L'attività biologica e chimica in tali ambienti con diffusione limitata può creare ripide sfumature di substrati chimici o prodotti di processi biogeochimici. In particolare, la disponibilità di O2 ha un enorme impatto sui processi biogeochimici e quindi sulla biologia e l'ecologia di un sistema13. Pertanto, l'analisi delle concentrazioni di O2 ad alta risoluzione spaziale e temporale è di primaria importanza nelle scienze acquatiche e terrestri. In primo luogo, sono stati sviluppati microsensori elettrochimici e ottici14,15 per misurare questo importante analita. Successivamente, è stata introdotta l'imaging 2 dimensionale (2D) di O2 con optodi planari12,16,17,18,19, che ha permesso la visualizzazione e la quantificazione della distribuzione eterogenea O2 nei suoli e nei sedimenti.
Gli optodi Planar O2 sono costituiti da un coloranti indicatore sensibile O22, che viene sciolto in un polimero adatto21. Il coloranti indicatore è eccitato a specifiche lunghezze d'onda ottiche ed emette luce spostando verso il rosso al rilassamento sotto forma di luminescenza. In presenza di O2, il colorante indicatore eccitato può trasferire la sua energia alla molecola O2 al momento della collisione, che è indicato come disintazione di luminescenza basata sulla collisione22. Pertanto, l'intensità della luminescenza e la durata della luminescenza sono ridotte con l'aumento della concentrazione di O22 . In un caso ideale il cambiamento di intensità e durata segue l'equazione Stern-Volmer (equazione 1) utilizzando l'intensità di luminescenza o la durata in assenza (I0;)o presenza (I, ) di O2 ad una data concentrazione [Q]. La costante Stern-Volmer (Ksv) è una misura per la sensibilità dell'optode verso O2; KSV dipende da variabili ambientali come temperatura e pressione.
(1)<img align="center" src="/files/ftp_upload/60191/60191eq1.jpg">
La registrazione di tali cambiamenti nella luminescenza su un foglio di sensore planare con un sistema di telecamere può essere utilizzata per visualizzare i cambiamenti corrispondenti nella distribuzione O2. Inizialmente, è stato utilizzato l'imaging O2 basato sull'intensità della luminescenza semplice18. Tuttavia, tale metodologia è molto sensibile alle interferenze esterne, che compromettono l'affidabilità dei risultati a causa di un'illuminazione eterogenea, fluttuazioni nella fonte di eccitazione o fotocamera, nonché distribuzione irregolare del tintura indicatore all'interno dell'optode planare.
Alcune di queste limitazioni possono essere alleviate utilizzando optodi planari per l'imaging ratiometrico17,24, dove il colorante indicatore sensibile O2è co-immobilizzato nello strato polimerico dell'optode planare con un colorante di riferimento insensibile che emette in un intervallo spettrale diverso rispetto all'indicatore O2. Sulla base di immagini di emissione acquisite in due finestre spettrali, il segnale di emissione sensibile a O2è diviso per il segnale di riferimento, generando un'immagine di rapporto meno incline alle suddette interferenze5,17. Il metodo richiede l'uso di un secondo coloranti, che idealmente può essere eccitato dalla stessa sorgente di eccitazione, ma emette a una diversa lunghezza d'onda (senza sovrapposizione spettrale significativa), in un'altra finestra spettrale della fotocamera (ad esempio, in un altro canale di colore di una fotocamera RGB).
In alternativa, l'imaging O2 può essere basato sulla quantificazione del cambiamento dipendente da O2nella durata della luminescenza del colorante indicatore, che non è influenzato da illuminazione o eterogeneità irregolare nella concentrazione dell'indicatore25. I primi sistemi di imaging O2 basati sulla luminescenza si basavano su misurazioni del dominio temporale con un sistema di telecamere a dispositivo accoppiato caricato (CCD) gate-able26, in cui viene utilizzata una fonte di eccitazione pulsata e le immagini della luminescenza vengono rilevate su intervalli di tempo definiti all'interno dell'eccitazione o dell'emissione dell'indicatore8,23,27. Da tali immagini, la durata della luminescenza può essere determinata e correlata alla corrispondente concentrazione di O2 in una calibrazione. Successivamente, le immagini a vita di luminescenza per un dato campione premuto contro l'optode planare possono essere convertite in immagini della corrispondente distribuzione 2D della concentrazione di O2. Questo sistema è stato utilizzato in molte applicazioni sia in laboratorio che in situ16,28, ma l'essenziale telecamera CCD gate-able non è più disponibile in commercio.
Recentemente, è stato rilasciato un diverso sistema di telecamere a vita di luminescenza, che acquisisce le immagini nel dominio di frequenza8. Il sistema si basa su una fonte di luce continuamente modulata per l'eccitazione. Questo può essere un'onda sinusoidale o quadrata invece di un'eccitazione pulsata, che viene utilizzata per l'acquisizione di immagini nel dominio temporale. Questa modulazione si traduce in un'emissione modulata di luminescenza del colorante indicatore O2, che è spostata di fase da un angolo, - che dipende dalla durata della luminescenza del colorante indicatore (vedi equazione 2).
(2)<img align="center" src="/files/ftp_upload/60191/60191eq2.jpg">
Il cambiamento tra l'ampiezza di eccitazione e di emissione (cioè il cosiddetto indice di modulazione o profondità (ampiezza divisa per la parte di luminescenza costante)) dipende anche dalla durata della luminescenza. Quindi, impostando una frequenza di modulazione nota, lo speciale sensore di immagine CMOS all'interno della fotocamera è in grado di misurare la durata della luminescenza nella gamma ns fino alla gamma s come descritto nel dettaglio altrove 8,29,30. È possibile trovare una guida generale sul principio operativo (utilizzando il seguente collegamento <a href="https://www.youtube.com/watch?v=xPAB_eVWOr8" target="_blank">https://www.youtube.com/watch?v=xPAB_eVWOr8</a>).
Nel seguente protocollo, dimostriamo l'uso del nuovo sistema di telecamere per l'imaging della distribuzione della concentrazione di O2 intorno alle radici della pianta acquatica d'acqua dolce Littorella uniflora in 2D9,31. Vorremmo sottolineare che questo metodo non è affatto limitato a questa applicazione. Optodi sensibili all'ossigeno o particelle di sensori27 in combinazione con vari metodi di imaging sono stati utilizzati nella ricerca medica32, in biostampa33, per vernici sensibili alla pressione34,35, o per studiare i sistemi fotosintetici2,36,37, solo per citarne alcuni altri campi di applicazione.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Air pump with air stone and water pump</td>
			<td>Local aquarium store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>67-66-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC4 silicone compound</td>
			<td>Dow Corning GmbH</td>
			<td>2793695</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas mixer</td>
			<td>V&#246;gtlin Instruments GmbH</td>
			<td>red-y compact meter GCM</td>
			<td>This is just one possible instrument. Several companies offer gas mixing devices</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass plates and aquaria</td>
			<td>Local aquarium or hardware store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Freely available imaging software (imagej.nih.gov/ij/index.html)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knife-coating device</td>
			<td> 
			 
			BYK-GARDNER GMBH byk.com</td>
			<td>2021</td>
			<td>This is a four sided film applicator enabling easy variation of the film thickness. Other versions are also available. We recommend a thickness of the applied film between 75-120 &#181;m, which yields a final sensor layer thickness of ~10% of the applied thickness before solvent evaporation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED lamp, Reflector PAR38</td>
			<td>Megaman</td>
			<td>MM17572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED LEDHUB</td>
			<td>Omicon Laserage, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Can be configured with a variety of LEDs. For the presented example, the green LED (528 nm) is essential</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LOCTITE AA 3494</td>
			<td>Henkel AG &#38; Co. KGaA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Acrylic-based instant adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements AR Software</td>
			<td>Nikon Inc</td>
			<td></td>
			<td>Software package used for image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pco.flim</td>
			<td>PCO AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Frequency domain based luminescence lifetime camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>platinum(II)-5,10,15,20-tetrakis-(2,3,4,5,6-pentafluorphenyl)-porphyrin (PtTFPP)</td>
			<td>Frontier Scientific</td>
			<td>PtT975</td>
			<td>O2 indicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene terephthalate (PET) foil</td>
			<td>Goodfellow</td>
			<td>320-992-72</td>
			<td>Such foils might also be found from other providers and serve as solid support</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene (PS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9003-53-6</td>
			<td>Polymer matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schott RG610 filter</td>
			<td>www.uviroptics.com</td>
			<td></td>
			<td>Here 52mm screw on Filters can obtained. Other sources offer square glass filters from Schott glass that can be fixed in front of the objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl electrical tape</td>
			<td>Scotch, Super 33+</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Makro Planar 2/100 with Hama C for Nikon adaptor</td>
			<td>delivered with the camera</td>
			<td></td>
			<td>Here any other objective might also be used in combination with an adaptor if the objective does not have a C-mount</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

luminescence lifetime imaging of o2 with a frequency-domain-based camera system

Viene descritto un metodo per l'immagine di ossigeno disciolto (O2), in 2D ad alta risoluzione spaziale (< 50-100 m) e temporale (< 10 s). Il metodo utilizza fogli di sensori luminescenti sensibili O2 (optode planari) in combinazione con un sistema di telecamere specializzato per l'imaging della durata della luminescenza nel dominio della frequenza. Gli optodi planari vengono preparati sciogliendo il colorante indicatore sensibileOin un polimero e diffondendo la miscela su un supporto solido in uno spessore definito tramite rivestimento del coltello. Dopo l'evaporazione del solvente, l'optode planare viene posto a stretto contatto con il campione di interesse - qui dimostrato con le radici della pianta acquatica Littorella uniflora. Ilcambiamento o 2 dipendente dalla concentrazione nella durata della luminescenza del coloranti indicatore all'interno dell'optode planare è immagine attraverso il retro della pellicola portante trasparente e la parete dell'acquario utilizzando una fotocamera speciale. Questa telecamera misura la durata della luminescenza (z) attraverso uno spostamento dell'angolo di fase tra un segnale di eccitazione modulato e un segnale di emissione. Questo metodo è superiore ai metodi di imaging dell'intensità della luminescenza, in quanto il segnale è indipendente dalla concentrazione o dall'intensità del colore della fonte di eccitazione e si basa esclusivamente sul tempo di decadimento della luminescenza, che è un parametro intrinsecamente referenziato. Di conseguenza, non è necessario un tintura di riferimento aggiuntiva o altri mezzi di riferimento. Dimostriamo l'uso del sistema per l'imaging macroscopico O2 di rizosfere vegetali, ma il sistema di telecamere può anche essere facilmente accoppiato a un microscopio.

Come esempio applicativo per il nuovo sistema di imaging, mostriamo l'imaging 2D O2 di un campione biologico complesso (cioè la rizosfera della pianta acquatica Littorella uniflora).
In primo luogo, il metodo descrive la fabbricazione di una pellicola sensore planare, un cosiddetto optode planare. Come si vede nella Figura 1, tale optode è costituito da uno strato sottile di un indicatore ottico in una matrice polimerica che si diffonde su un supporto trasparente. Seguendo il protocollo descritto, si ottiene una pellicola sensore omogenea con uno spessore uniforme, come definito dallo spazio del dispositivo di rivestimento del coltello. Se l'optode prodotto ha una distribuzione del materiale del sensore patchy (ad esempio, fori nel rivestimento, mostra strisce o aggregati di tintura (questo può essere valutato visivamente e visivamente con l'aiuto di una lampada UV)), il protocollo deve essere ripetuto e tutti i materiali devono essere accuratamente puliti utilizzando acetone.
Una volta preparata l'optode planare, il campione può essere portato a stretto contatto con lo strato di rilevamento dell'optode planare, come mostrato qui con l'optode planare integrato in una camera rhizo-sandwich, dove le radici di una pianta all'interno di una matrice di sedimenti circostante possono essere posizionate a stretto contatto con l'optode planare (Figura 2). Se preparata correttamente, la camera rhizo-sandwich dovrebbe essere facilmente spostabile da un acquario (incubazione) all'altro (misurazione). Se non è stata costruita correttamente, la camera rhizo-sandwich può essere instabile, perdere sedimenti o contenere bolle d'aria. Si raccomanda pertanto l'esame visivo della camera rhizo-sandwich direttamente dopo l'assemblaggio.
Il protocollo specificato consente l'imaging a vita della luminescenza basata su dominio di frequenza del campione a contatto con l'optode planare utilizzando la fotocamera a vita di luminescenza basata su dominio di frequenza. Maggiori dettagli su questo sistema di telecamere come la modalità di acquisizione di immagini e le caratteristiche scientifiche complementari della telecamera metal-ossido-semiconduttore (SCMOS) sono fornite nelle recenti pubblicazioni8,29.
La configurazione stessa è piuttosto semplice e include solo la fotocamera che controlla una fonte di luce (in questo caso, una sorgente di eccitazione LED) e il campione con l'optode (Figura 3). Assicurarsi che tutte le parti siano collegate correttamente e che il campione sia illuminato in modo omogeneo. La luce di fondo deve essere evitata durante la preformazione delle misurazioni.
Prima di imaging del campione, l'optode deve essere calibrato. Come si vede nella Figura 4A, la durata della luminescenza misurata diminuisce con l'aumento della concentrazione di O2 a seguito di un decadimento quasi-esponenziale. Questa relazione può essere descritta anche utilizzando il modello a due siti semplificato(Figura 4B e equazione 3). Nell'esempio dato, i parametri necessari per calcolare successivamente la concentrazione di O2 sono stati come segue; 0 x 56,26 s, Ksv - 0,032 hPa-1 e f - 0,86.
L'esecuzione di una calibrazione è anche un modo ideale per verificare che il sistema funzioni correttamente. Se tutti i componenti sono installati come descritto qui (o all'interno delle linee guida dei produttori), la durata misurata dovrebbe mostrare la stessa dipendenza O2 come si vede nella Figura 4. Inoltre, per la stessa combinazione di materiali di rilevamento O2 (polimero e tinri), il misurato0 dovrebbe essere nella stessa gamma (a pochi z) misurata qui (principalmente influenzata dalla temperatura sperimentale). Se non è possibile ottenere una curva di calibrazione simile, assicurarsi che tutti i passaggi siano stati seguiti correttamente. A volte l'optode viene accidentalmente fissato con il lato sensibile rivolto verso la parete di vetro piuttosto che il campione, o le immagini acquisite sono sovra o sottoesposte.
Con i parametri di calibrazione, è possibile determinare la concentrazione di O2 esaminando la durata della luminescenza . Ciò è dimostrato nella Figura 5A,B, dove la distribuzione della concentrazione di O2 nella rizosfera di Littorella uniflora è stata fotografata al buio e dopo l'esposizione alla luce a 500 fotoni mol m-2 s-1 per 12 h, rispettivamente. A causa dell'attività fotosintetica della pianta, la concentrazione di O2 nella rizosfera è aumentata dopo l'esposizione alla luce. Oltre alle immagini a vita, anche le immagini "strutturali" possono essere acquisite sotto l'illuminazione esterna, mantenendo fissa la geometria dell'immagine. In questo modo, le immagini O2 possono essere correlate con precisione all'immagine strutturale (Figura 5C), alle sezioni trasversali o alle regioni di interesse. Ad esempio, i profili di concentrazione O2 in una singola radice sono stati estratti dall'immagine acquisita rispettivamente nel buio e nella luce (Figura 5D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60191/60191fig1a.jpg"> Figura 1: Fabbricazione di un optode planare O2. (A) Un foglio di PET è fissato su una lastra di vetro e il dispositivo di rivestimento del coltello è posto sul foglio. (B) Il cocktail sensore preparato viene diffuso sulla lamina PET come una linea sottile davanti al dispositivo di rivestimento del coltello. (C) Il dispositivo di rivestimento del coltello viene spostato verso il basso per diffondere il cocktail del sensore come una pellicola sottile sulla lamina PET, che dopo l'evaporazione del solvente si traduce in un optode planare pronto all'uso. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60191/60191fig1alarge.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60191/60191fig2a.jpg"> Figura 2: assemblaggio da camera Rhizo-sandwich con integrazione di un optode planare O2. (A) L'optode è fissato su una delle lastre di vetro utilizzando una pellicola d'acqua. (B) L'optode è incollato alla piastra con nastro elettrico. (C) Il sedimento viene riempito nella piastra opposta con i distanziali collegati (cioè i vetrini al microscopio). (D) Le radici delle piante sono poste sul sedimento uniformemente diffuso. (E) La camera rizo-sandwich è chiusa e temporaneamente fissata con morsetti. (F) Camera completamente chiusa e assemblata di rhizo-sandwich. (G) Per proteggere l'optode dall'esposizione alla luce da parte della lampada di incubazione ed evitare la crescita delle alghe, viene posto un coperchio di plastica sopra la camera assemblata di rhizo-sandwich. (H) La camera rhizo-sandwich incubata in un acquario. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60191/60191fig2alarge.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60191/60191fig3a.jpg"> Figura 3: Configurazione dell'imaging contenente la fotocamera a vita della luminescenza basata su dominio di frequenza, con l'obiettivo focalizzato sul campione con l'optode da dietro attraverso l'acquario trasparente e le pareti della camera rhizo-sandwich. La guida luminosa della sorgente di eccitazione LED è posizionata per illuminare il campione in modo uniforme. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60191/60191fig3alarge.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60191/60191fig4a.jpg"> Figura 4: Curve di calibrazione per optode planare O2. (A) Diverse durate di fosforescenza misurate alle rispettive concentrazioni di O2 nella camera di taration riempita d'acqua. (B) Grafico Stern-Volmer dei dati di calibrazione montato utilizzando il modello a due siti semplificato per lo spegnimento collisionale dinamico (equazione 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60191/60191fig4alarge.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60191/60191fig5a.jpg"> Figura 5: Immagini a vita della distribuzione O2 nella rizosfera della pianta acquatica Littorella uniflora. (A) O2 distribuzione dopo aver tenuto la pianta sotto luce per 12 h a circa 500 fotoni mol m-2 s-1. (B) O2 distribuzione dopo aver tenuto la pianta al buio per 1 h. (C) Immagine strutturale delle radici della pianta come visto attraverso l'optode planare. (D) Profilo di concentrazione o2 trasversale (la posizione è indicata dalla linea gialla nel pannello A e B) dopo 12 h in luce (rosso) e 1 h nel buio (nero). Adattato con il permesso di (Koren, K., Mo'hammer, M., Scholz, V. V., Borisov, S.M., Holst, G., K'hl, M. Luminescence Lifetime Imaging of Chemical Sensors - Un confronto tra Time-Domain e Frequency-Domain Based Camera Systems. Chimica analitica. 91 (5), 3233-3238, doi: 10.1021/acs.analchem.8b05869 (2019)). Diritto d'autore (2019) American Chemical Society. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60191/60191fig5alarge.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Luminescence Lifetime Imaging of O2 with a Frequency-Domain-Based Camera System at JoVE.com

Luminescence Lifetime Imaging of O2 with a Frequency-Domain-Based Camera System

Descriviamo l'uso di una nuova telecamera a vita di luminescenza del dominio di frequenza per la mappatura delle distribuzioni 2D O2 con fogli di sensori ottici. Il sistema di telecamere e le procedure di analisi delle immagini sono descritte insieme alla preparazione, alla calibrazione e all'applicazione di fogli di sensori per la visualizzazione del microambiente O2 nella rizosfera delle piante acquatiche.

Luminescenza Lifetime Imaging di O2 con un sistema di telecamere basato su frequenza-dominio

We describe a method to image dissolved oxygen (O2), in 2D at high spatial (&#60; 50-100 &#181;m) and temporal (&#60; 10 s) resolution. The method employs ...

Come miglior accettore di elettroni, l'ossigeno gioca un ruolo cruciale nei sistemi biologici. Con questo protocollo, è possibile visualizzare la distribuzione dell'ossigeno in 2D utilizzando un optodo. Oltre alla sua elevata risoluzione spaziale e temporale, questo metodo non richiede un colorante di riferimento aggiuntivo, è estremamente robusto e consente l'acquisizione di immagini strutturali.Questo metodo può essere applicato a vari settori di ricerca in cui l'ossigeno svolge un ruolo chiave tra cui ecologia, ricerca medica, biostam ecologica e stampa sensibile alla pressione. La fabbricazione optode può essere impegnativa in quanto la quantità di cocktail aggiunta al foglio di supporto e la velocità di trascinamento del dispositivo di rivestimento del coltello possono richiedere ottimizzazione e pratica. Con questo contributo video, vogliamo rendere questa potente tecnica accessibile ai ricercatori di altri campi di studio.Per preparare un optodo planare all'ossigeno, utilizzare prima una pellicola d'acqua o il 70% di etanolo per fissare un foglio pet pulito senza polvere su una piastra di vetro pulita. Posizionare un dispositivo di rivestimento del coltello pulito da 120 micrometri sulla lamina e utilizzare una pipetta di vetro per applicare una linea di cocktail di sensori davanti al dispositivo. Successivamente, trascinare il dispositivo di rivestimento del coltello lentamente e uniformemente sul foglio di PET per stendere il cocktail in modo uniforme.Quindi asciugare l'optodo planare sensibile all'ossigeno finito nell'aria ambiente per un'ora prima di asciugarsi durante la notte in un armadio riscaldato a 50-60 gradi Celsius. Entro la mattina successiva, sarà stato ottenuto uno strato spesso circa 12 micrometri. Conservare l'optodo protetto dalla luce fino a un ulteriore utilizzo.Per preparare una camera rhizo-sandwich, utilizzare un adesivo istantaneo a base di acrilico polimerizzabile leggero per incollare vetrini al microscopio lungo i bordi di una lastra di vetro lasciando aperto un lungo bordo. Tagliare l'optodo planare nella forma e nelle dimensioni richieste per adattarsi allo spazio tra i vetrini del microscopio incollato e posizionare l'optodo all'interno della piastra di vetro anteriore con il lato rivestito verso l'alto. Fissare un bordo del foglio di optodo alla piastra di vetro e aggiungere acqua del rubinetto tra la lastra di vetro e il foglio di optodo.Abbassare lentamente il foglio sulle goccioline d'acqua permettendo all'optodo di raddrizzare se stesso sulla superficie del vetro e utilizzare un tessuto molle per rimuovere con cura una bolla d'aria intrappolata tra l'optodo e la piastra. Quindi asciugare la piastra di vetro e rastrelare i bordi rimanenti del foglio sulla piastra. Successivamente, utilizzare una piastra di vetro piano per distribuire i sedimenti del setaccio di 0,5 millimetri uniformemente attraverso la piastra allo stesso spessore dei distanziale a scorrimento del microscopio.Pulire con cura la superficie superiore dello scivolo del microscopio per assicurarsi che la seconda lastra di vetro sigilli correttamente la camera e applicare grasso siliconico sulla superficie di scorrimento del microscopio. Quindi coprire il sedimento con un sottile film d'acqua evitando accuratamente la formazione di bolle d'aria. Prima di posizionare un campione sul sedimento, lavare con cura un singolo germoglio di Littorella uniflora e posizionare il germoglio su un sedimento con le foglie sporgenti dal lato aperto superiore.Quando il campione è in posizione, posizionare la lastra di vetro con l'optodo sul sedimento e applicare una pressione delicata per portare l'optodo a stretto contatto con le radici della pianta e il sedimento circostante. Utilizzare morsetti per fissare le piastre insieme e asciugare i bordi esterni con carta velina. Aggiungere ripetutamente alcune gocce d'acqua alle foglie per mantenere la pianta idratata durante l'assemblaggio del rhizo-sandwich e utilizzare nastro elettrico in vinile per stringere la camera rhizo-sandwich.Quindi sigillare i bordi con argilla modellante e nastro elettrico aggiuntivo. Per prepararsi all'imaging, rimuovere il foglio di copertura dall'area dell'optodo dopo l'incubazione e posizionare la camera rizo-sandwich con la parete di vetro con l'optodo in posizione verticale contro la parete dell'acquario. Utilizzare un distanziale per premere la camera rhizo-sandwich contro il muro.Posiziona la telecamera a vita in luminescenza basata sul dominio di frequenza dotata di un obiettivo di fronte all'acquario e all'area di interesse. Collegare un filtro di emissione adatto per l'imaging del colorante dell'indicatore all'obiettivo della fotocamera e fissare la guida luminosa nella sorgente di eccitazione a LED. Quindi posizionare la guida in modo che illumini uniformemente il foglio di optodo planare che copre l'area di interesse.Nel software di imaging, selezionare la fotocamera e selezionare il LED nel software di controllo LED. Impostare l'intensità del LED in base alle esigenze e spuntare l'analogico e la sincronizzazione per confermare che il LED è attivato dalla logica transistor-transistor esterna. Mettere a fuoco manualmente la fotocamera e regolare l'apertura oggettiva e impostare la sorgente di modulazione interna, l'onda sine per la forma d'onda di uscita, il campionamento di fase aggiuntivo, i campioni a otto fasi, l'ordine di fase opposto, il lettura A B e la frequenza di modulazione di cinque kilohertz.Regolare il tempo di esposizione fino a quando le statistiche della regione di interesse non vengono lette per l'immagine di intensità della luminescenza normalizzata nell'intervallo da 0,68 a 0,72. Quindi fare clic su riferimento di acquisizione per avviare l'acquisizione di una serie di misura di riferimento. Per calibrare l'optodo, utilizzare un dispositivo di miscelazione del gas per sciacquare l'acqua in un acquario di taratura con una miscela di gas azoto ad aria ambiente con una concentrazione di ossigeno nota che monitora la concentrazione di ossigeno con una sonda esterna con un sensore di ossigeno.Quindi acquisire una serie di immagini a diverse concentrazioni di ossigeno nella camera di taratura per ottenere una curva adeguata adatta ai dati di calibrazione acquisiti. Una volta calibrato il sistema, spegnere le luci che applicano l'irradiazione all'impianto e a tutte le altre sorgenti luminose e regolare il tempo di acquisizione in base all'intensità dell'immagine per assicurarsi che il segnale non sia né saturo né troppo debole per un buon rapporto segnale-rumore nella determinazione della durata. Una volta acquisite tutte le immagini a vita di ossigeno, riattivare le luci per ottenere un'immagine strutturale e ottenere un'immagine con un righello nel campo visivo per consentire il successivo ridimensionamento delle immagini acquisite.Prima di imaging del campione, l'optodo deve essere calibrato. Dopo un decadimento quasi esponenziale, la durata della luminescenza misurata diminuisce con l'aumentare della concentrazione di ossigeno. Questa relazione può anche essere descritta utilizzando il modello semplificato a due siti.Una volta calibrato l'optodo, è possibile determinare la concentrazione di ossigeno imagingndo la durata della luminescenza osservata in queste immagini in cui la distribuzione della concentrazione di ossigeno nella rizosfera di Littorella uniflora è stata immagine dopo l'esposizione alla luce a 500 fotoni di micromoli al metro al secondo per 12 ore e dopo 12 ore nell'oscurità. Oltre alle immagini a vita, le immagini strutturali possono anche essere acquisite sotto illuminazione esterna mantenendo fissa la geometria di imaging per consentire all'imaging dell'ossigeno di essere esattamente correlato all'immagine strutturale. I profili di concentrazione di ossigeno su una singola radice, ad esempio, possono quindi essere estratti dalle immagini acquisite nell'oscurità e nella luce.È fondamentale avere un buon contatto tra la matrice campione e l'optode per evitare artefatti non necessari. Se sei in dubbio, rifare il panino. L'acquisizione istantanea di un'immagine in modo non distruttivo consente il monitoraggio dell'ambiente dell'ossigeno.Il metodo potrebbe anche essere combinato con altri optodi per pH o altri aaliti. Assicurati di eseguire la fabbricazione optode in una cappa aspirante poiché il cocktail del sensore contiene cloroformio. Gli optodi planari possono essere usati per identificare le comunità microbiche nei sedimenti.E dopo l'imaging, il panino può essere aperto per campionare questi punti caldi per l'analisi microbica della comunità.

Research

JoVE Journal

Chemistry

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Ricerca

Chimica

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