Name: luminescence lifetime imaging of o2 with a frequency-domain-based camera system
Uploaded: 2019-12-16T14:00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Luminescence Lifetime Imaging of O2 with a Frequency-Domain-Based Camera System at JoVE.com

Vi takker Sofie Lindegaard Jakobsen (Universitetet i København) og Lars Borregaard Pedersen (Aarhus universitet) for teknisk assistanse. Finansiering for denne studien ble innhentet fra en Sapere-Aude avansert stipend fra det uavhengige forskningsfondet Danmark (DFF-1323-00065B; MK), prosjekt bevilgninger fra Independent Research Fund Danmark | Naturvitenskap (DFF-8021-00308B; MK) & tekniske og produksjons vitenskaper (DFF-8022-00301B og DFF-4184-00515B; MK), den danske nasjonal forskningsstiftelse (DNRF136), og Poul Due Jensen Foundation (KK).

1. fabrikasjon av Planar O2 optode
<ol><li>Oppløse 1,5 mg av selvlysende O2 indikatorfarge stoff Platinum (II)-5, 10, 15, 20-tetrakis-(2, 3, 4, 5, 6-pentafluorphenyl)-Porfyrin (PtTFPP) og 100 mg av POLYSTYREN (PS) i 1 g kloroform for å få den såkalte "sensor cocktail". Merk: cocktail kan oppbevares i et lukket, gass tett hetteglass i noen timer i kjøleskapet og mørket inntil videre bruk.</li>
	<li>Fix en ren, støvfri polyetylen polyetylentereftalat (PET) folie (størrelse avhengig av programmet) på en rengjort glassplate ved hjelp av en vann eller etanol (70%) filmen (figur 1A).</li>
	<li>Plasser den rengjort kniv belegg enheten (120 μm) på folien og Påfør en linje av sensoren cocktail foran enheten ved hjelp av en glass pipette (figur 1B). Deretter drar du kniv belegg enheten langsomt og jevnt over PET-folien for å fordele cocktail jevnt. Merk: alle materialer og verktøy må rengjøres grundig og fabrikasjon bør gjøres i et støvfritt miljø, for eksempel en avtrekksvifte, strømnings benk eller under et punkt sugeinnretning. For å unngå heterogeniteter i den endelige sensorens folie bør trinnene etter påføring av sensoren cocktail på folien gjøres raskt, da kloroform fordamper raskt.</li>
	<li>Tørk det ferdige Planar O2-sensitive optode i omgivelsesluft i 1 time og deretter over natten i et varme kabinett ved 50-60 ° c, noe som resulterer i en endelig lag tykkelse etter løsemiddel fordampning på ~ 12 μm. Oppbevar de produserte optodes i mørket (f.eks. i en papir konvolutt) inntil videre bruk (figur 1C). Merk: Planar O2 optodes kan oppbevares tørt og i mørket i flere måneder til år før bruk. En endelig lag tykkelse fra 1-20 μm har vist seg å gi gode resultater, med tilstrekkelig luminescence signal og tilstrekkelig responstid.</li>
</ol>2. Rhizo-sandwich kammer
<ol><li>Rengjør to glassplater (24,5 x 14 cm2, tykkelse: 4 mm) med 96% etanol.</li>
	<li>Bruk lett kureres, akryl-basert Instant selvklebende (se tabell over materialer) for å lime mikroskop lysbilder (76 x 26 mm2, tykkelse: 1 mm) langs kantene av den første glassplaten (dvs. bak kammer side), mens du forlater en lang kant åpen. Bruk en glasscutter til å forkorte objektglassene etter behov. FORSIKTIG: skjære glasset kan føre til skarpe kanter og bør håndteres med forsiktighet. Merk: lysbildene i mikroskopet fungerer som avstandsstykker mellom forsiden og baksiden, og avhengig av tykkelsen på røttene og plante størrelsen, kan flere lag med objektglass festes oppå hverandre.</li>
	<li>Skjær Planar optode i ønsket form og størrelse for å passe inn i mellomrommet mellom de limte mikroskop lysbildene. Plasser den på innsiden av fronten glassplaten med belagt side oppover, for å tillate kontakt med prøven av interesse når presset mot den.</li>
	<li>Tape en kant av optode folie til glassplaten og tilsett noen dråper vann fra springen i mellom glassplaten og optode folie (figur 2a). Langsomt senke folien på disse vanndråper slik at det å rette seg ut på glassoverflaten.</li>
	<li>Forsiktig fjerne luftbobler fanget i-mellom Planar optode og glassplaten ved hjelp av et mykt vev, og samtidig unngå riper i sensor belegget. Tørk av glassplaten og tape de resterende kantene på den optode folien til glassplaten (figur 2B). Merk: en tape med egnet vedheft under vann bør velges.</li>
	<li>Sil sediment ved hjelp av en mesh størrelse på 0,5 mm. Legg en skje med vått sediment på den første glassplaten (figur 2C). Merk: maskestørrelsen bør ikke være større enn halve avstands tykkelsen.</li>
	<li>Fordel sediment jevnt og justere den til samme tykkelse som mikroskopet lysbildet avstandsstykker ved hjelp av en flat glassplate. Rengjør den øvre overflaten på objektglassene forsiktig for å sikre at den andre glassplaten forsegler kammeret på riktig måte.</li>
	<li>Påfør silisium fett på lysbilde overflaten på mikroskopet. Dekk sediment med en tynn vann film, mens forsiktig Unngå dannelse av luftbobler.</li>
	<li>Vask forsiktig et enkelt skyte av Littorella uniflora og legg den på sediment, med anlegget bladene stikker ut fra den øvre åpne side (figur 2D).</li>
	<li>Plasser den andre glassplaten, med optode festet til den, på sediment og påfør forsiktig press for å bringe optode i nær kontakt med planterøtter og de omkringliggende sediment. Merk: luftbobler fanget i sediment kan fjernes ved å vippe glass platene mens bringe dem sammen.</li>
	<li>Fest glass platene sammen med klemmer (figur 2E). Tørk ytterkantene med silkepapir. Hold bladene fuktig gjennom hele monteringen av rhizo-sandwich (for eksempel ved hyppig tilsetning av noen få dråper vann).</li>
	<li>Stram det rhizo-sandwich kammeret med vinyl elektrisk tape. Forsegle kantene med modellering leire og i tillegg tape dem med vinyl elektrisk tape (figur 2F). Merk: Hvis det er mange luftbobler i sediment, eller sediment korn i mellom avstands objekt lysbildene og den andre glassplaten, bør kammeret være satt sammen igjen som pore vann kan lekke ut (gjenta trinn 2,4-2,8).</li>
	<li>Bruk en ugjennomsiktig plast for å dekke rhizo-sandwich, men la en spalte i folien for anlegget bladene å stikke ut. Skjær et vindu i plastfolie, slik at den kan åpnes for eksperimenter ved utfolder seg. Lukk vinduet under Akklimatisering ganger ved hjelp av gummibånd (figur 2G) for å beskytte optode fra Foto bleking mens planten er inkubert. Merk: som alger vekst potensielt kan påvirke O2 konsentrasjoner målt, anbefaler vi å prøve å minimere den, ved å bruke filtrert vann, pre-rengjort eksperimentell utstyr og fjerne alger ved dannelse.</li>
</ol>3. Rhizo-sandwich kammer inkubasjons
<ol><li>Plasser rhizo-sandwich kammeret i en vannbeholder (32 x 7 x 28 cm3) i en svakt skråstilt posisjon for å oppmuntre til rot vekst mot Planar optode.</li>
	<li>Fyll vannbeholderen med nok vann til å senke plante bladene.</li>
	<li>Etablere en 14 h lys, 10 h mørk syklus for Akklimatisering av anlegget ved hjelp av en tidsstyrt lampe. Plasser en luft-stein eller en vannpumpe i tanken for å sikre lufting og blanding av vann (figur 2H).</li>
</ol>4. bildebehandling
<ol><li>Oppsett av bildebehandling
	<ol>
<li>Fjern plastfolie som dekker Planar optode i rhizo-sandwich kammeret. Plasser kammeret med glassveggen med optode oppreist mot akvariet veggen. Bruk en Spacer til å trykke rhizo-sandwich kammer mot akvariet veggen. Merk: den generelle tykkelsen på akvariet veggen pluss rhizo-sandwich kammer veggen bør ikke bli for tykk, men glass tykkelser for akvarier vegger for luminescence Imaging anbefales med > 1 cm, for å redusere romlig kryss-snakk ved å øke demping av spredt lys. Det er viktig, å bruke det samme materialet for både glassvegger (samme ildfast indeks), for å minimere lysspredning på materialet grensesnittet; da dette ville føre til et uskarpt bilde så vel12.</li>
		<li>Plasser frekvens-domene-basert luminescence levetid kamera utstyrt med en objektiv (se tabell av materialer) foran akvariet og området av interesse (røtter av akvatiske planten Littorella uniflora, som er i direkte kontakt med Planar optode) (Figur 3). Merk: kameraet kan plasseres på et laboratorie stativ slik at det er enkelt å justere høyden på kameraet. Plasseringen av lab stativet skal merkes og holdes fast. I tillegg kan kameraet tapes til laboratorie stativet for å unngå utilsiktet bevegelse av kameraet under eksperimentet.</li>
		<li>Skru et egnet utslipps filter for bildebehandling PtTFPP som indikatorfarge stoff (se tabell over materialer) på kameraets målsetting, for å fjerne slutninger fra eksitasjon kilde. Merk: skru på filtre er ideelle, men firkantede filtre kan også brukes med enten en passende adapter, eller ved forsiktig taping dem til målet.</li>
		<li>Koble en LED eksitasjon kilde (se tabell over materialer) til moduleringshjul og mørke gate utgang på kameraet. Merk: den tidligere leverer modulerings signal for lyskilden, mens sistnevnte slår av lyset under bilde avlesning av bildebrikken. Koble LED-eksitasjon kilde og kamera til en datamaskin. Bakgrunnslys bør minimeres under bilde avlesning, enten ved å mørkere hele rommet eller sette en tett, svart klut over hele oppsettet. I sistnevnte tilfelle er det viktig å sikre tilstrekkelig ventilasjon for å unngå oppvarming av kameraet.</li>
		<li>Fest lys føreren i LED-eksitasjon kilde og plasser den jevnt for å belyse den Planar optode folien som dekker det området av interesse. Merk: i den brukte LED eksitasjon kilde er det mulig å veksle mellom 3 forskjellige lysdioder (460 NM, 528 NM, 625 NM), intensiteten som kan justeres via Kontrollprogramvaren.</li>
	</ol></li>
	<li>Innstillinger og kamera drift Merk: for de beskrevne forsøkene, brukte vi et frekvens-domene-basert livstids kamera i kombinasjon med en dedikert modul for livstid Imaging i en kommersielt tilgjengelig programvarepakke (se tabell over materialer).<ol>
<li>Velg kameraet i den valgte programvaren før bruk. Merk: programvaren og kameraets drivere må installeres før bildebehandling følger produsentens retningslinjer.</li>
		<li>Åpne LED Kontrollprogramvaren (igjen installert før du starter eksperimentet) og velg egnet LED (her: 528 NM) ved å krysse av standby. Still inn LED-intensiteten etter behov (her til 30%). Kontroller at LYSDIODEN utløses av den eksterne TTL- Dette gjøres ved tikkende analog og Sync for LED. Merk: LED-intensiteten må justeres individuelt, da for høy laser effekt kan føre til akselerert bilde bleking av indikator eller referanse fargestoff.</li>
		<li>Fokuser kameraet og Juster blenderåpningen til målet manuelt (i den foreliggende studien, bruk f = 2,8). Merk: det er viktig å fokusere kameraet på Planar optode og ikke på akvariet glass; Dette kan sikres ved å ta et bilde med en linjal for skala, og fokusere på skyggen av linjalen på optode, i stedet for på selve linjalen.</li>
		<li>Angi følgende parametere i programvare kameraets Kontrollpanel: intern modulerings kilde; sinus bølge for output bølgeform; ytterligere fase prøvetaking (Ja); 8 fase prøver, fase rekkefølge motsatt, trykk A + B avlesning; 5 kHz modulering frekvens. Merk: disse parametrene påvirker bildekvaliteten og kan endres ved behov. Produsenten av kameraet gir retningslinjer om de enkelte parametrene (kameraprodusenten lanserer retningslinjer og oppdateringer når programvaren blir oppdatert).</li>
		<li>Ta et referanse bilde før eksperimenter. Merk: Dette kan gjøres enten ved Imaging en kalibrering standard (et selvlysende fargestoff med en kjent levetid (NS eller μs)), eller ved hjelp av reflektert lys av LED. I sistnevnte tilfelle må utslipps lange pass filter fjernes fra målet og den kjente levetiden kan settes til 1 NS.</li>
		<li>Juster eksponeringstiden i kalibrerings delen av den dedikerte bildebehandlingsprogram varen til avkastningen statistikk avlesning (i bunnen av dette panelet) for normalisert luminescence intensitet bildet er i størrelsesklasse 0,68-0,72. Merk: nå er referanse levetiden (f.eks. 1 NS) gitt som innspill til programvaren.</li>
		<li>Trykk Capture referanse for å starte oppkjøpet av en referanse måle serie. Merk: Når du er ferdig, er referanse dataene lagret og enten enkelt eller tidsforløp målinger kan gjøres på prøver.</li>
	</ol></li>
	<li>Kalibrering av O2 optode
	<ol>
<li>Plasser et stykke av en Planar O2-sensitive optode i et (lite) glass akvarium. Fest Planar optode på glassveggen i kalibrerings kammeret som beskrevet tidligere (se avsnitt 2,3). Plasser kalibrerings akvariet foran kameraet. Sikre jevn belysning av LED, samt at optode fyller hele synsfeltet. Merk: Planar optode skal være fra samme stykke folie eller laget av samme sensor cocktail som folien som brukes i selve eksperimentet.</li>
		<li>Fylle akvariet med det likt flytende medium idet anvendt inne eksperimentene. Merk: bruk av forskjellige medier for kalibreringer og eksperimenter kan påvirke målingen (f.eks. ved å endre sensorens respons og/eller O2 løselighet). Dermed bør kalibrering gjøres i samme medium, og ved samme temperatur som selve eksperimentet. Svingninger i temperatur vil påvirke luminescence signalet og bør unngås. Men hvis temperaturen ikke kan holdes stabil, må temperaturkompensering gjøres ved å kalibrere O2-sensitive optode (flere punkter) ved ulike (relevante) temperaturer og påfølgende omberegning av verdiene.</li>
		<li>Juster O2 konsentrasjon innenfor kalibreringen akvariet ved å skylle vannet med en Air/N2 gass-blanding av kjente O2 konsentrasjon, ved hjelp av en gass-miksing enhet. Sikre det vannet er frisk equilibrated med det anvendt gass-blanding av lufting for en nok tid (avhenger på flyte rate og størrelse av akvariet). Merk: Vi anbefaler at du overvåker O2 -nivået i kalibrerings akvariet med en ekstern, kalibrert O2 -sensor med temperatur kompensasjon (f.eks. ved bruk av fiberoptisk eller elektrokjemiske O2 -sensor).</li>
		<li>Ta en rekke bilder på forskjellige O2 konsentrasjoner i kalibrerings kammeret. Merk: minst fem forskjellige O2 konsentrasjoner bør måles for å muliggjøre en riktig kurve passer til ervervet kalibrering data. Det er viktig å måle ved 0 hPa (anoksisk forhold), og deretter distribuere de andre verdiene over det dynamiske spekteret av dine spesifikke indikatorfarge stoff. Her har vi brukt PtTFPP som O2-sensitive indikatorfarge stoff immobilisert i en polystyren matrise. Bilder ble tatt ved 0, 48, 102, 156 og 207 hPa; 207 hPa tilsvarer 100% luft metning ved gitt saltinnhold og trykk.</li>
	</ol></li>
	<li>Imaging prøven
	<ol>
<li>Plasser prøven foran kameraet og sørg for jevn belysning.</li>
		<li>Slå av lyset forsyne bestråling til anlegget (og alle andre lyskilder) like før anskaffe luminescence levetid bildet av anlegget. Juster anskaffelses tiden basert på intensiteten bildet, slik at signalet er verken overmettet eller for svak for et godt signal til støy (S/N) ratio i levetid besluttsomhet.</li>
		<li>Utsett planten for varierende lysforhold (f.eks. lys/mørk) og Skaff deg et sett med bilder.</li>
		<li>Slå på lyset i rommet for å få et strukturelt bilde. Merk: Når bakgrunnslyset slås på, vil ikke kameraet måle et realistisk bilde av livet. Intensiteten bildet viser imidlertid nå hele synsfeltet sett gjennom den delvis gjennomsiktige optode.</li>
		<li>Ta et bilde med en linjal eller likt i synsfeltet for å aktivere senere skalering av de oppnådde bildene.</li>
	</ol></li>
</ol>5. data analyse
<ol><li>Eksporter fase levetiden og intensiteten bilder direkte fra den dedikerte Imaging programvare, ved hjelp av makroen fra kameraprodusenten.</li>
	<li>Utfør ytterligere bildeanalyse ved hjelp av et fritt tilgjengelig bildeanalyse program (se tabell over materialer).</li>
	<li>Åpne bildene for fase levetiden for kalibreringen i bildeanalyse programmet, og Bestem gjennomsnittet av hele bildet ved hjelp av målefunksjonen. Plot den målte levetid mot de kjente O2 konsentrasjoner å bestemme kalibrering funksjon (Figur 4A).</li>
	<li>Beregn τ0/τ fra alle data (τ0 er målt fase levetid i fravær av O2). Tegn disse verdiene i forhold til de kjente O2 -konsentrasjonene (Figur 4B).</li>
	<li>Bestem parametrene KSV og f fra kalibrerings plottet ved hjelp av forenklet to-site modell for dynamisk collisional slukke (ligning 3)38,39 hvor [Q] er O2 konsentrasjon. Definer Fit-funksjonen i dataanalyse programvaren, som deretter bestemmer KSV og f.</li>
</ol>3<img align="center" src="/files/ftp_upload/60191/60191eq3.jpg">
<ol start="6"><li>Åpne de kjøpte eksempel bildene i bildeanalyse programmet for å konvertere bildene til O2 -konsentrasjoner ved å bruke de fastsatte parametrene KSV, f og τ0. Merk: som en alternativ tilnærming kan også levetidsverdiene for kalibrerings fasen (Figur 4A) brukes direkte. I dette tilfellet brukes en eksponentiell passform med kurve Fit-funksjonen for kalibrering.</li>
	<li>Åpne bildet med linjalen ved siden av bildeanalyse programmet, og mål en kjent avstand ved hjelp av måleverktøyet. Angi denne målingen som global skala under angitt skala.</li>
</ol>

Forfatteren Gerhard Holst er ansatt i PCO AG som produserer kamera systemet som brukes i denne artikkelen. PCO AG bidro økonomisk til å publisere og åpne kostnader i denne artikkelen.

I denne protokollen er hele arbeidsflyten fra optode forberedelser til O2 bildeanalyse dekket. Ved å følge denne protokollen, kan kjemiske bilder fås ved hjelp av romanen frekvens-domene-baserte luminescence livstids kamera. Avhengig av programmet, Planar optodes kan være fabrikkert i ulike størrelser og lag tykkelse på sensor laget fra robuste 50-100 μm tykk Planar optodes av flere tiendedeler av kvadratcentimeter til mikroskop dekke slips med < 1 μm tykk sensor lag6,40. Potensialet i denne metoden ble demonstrert med en spesiell anvendelse, men er ikke bare begrenset til O2 Imaging ianlegget rhizospheres.
Denne metoden har flere fordeler sammenlignet med ren luminescence intensitet-baserte kjemiske Imaging metoder. Luminescence levetid Imaging er ikke, eller i det minste langt mindre, påvirket av ujevn belysning, ujevn optode tykkelse, og foto bleking25. Dessuten unngår denne metoden bruk av en ekstra referanse fargestoff vanlig i ratiometrisk Imaging17,37. I forhold til andre levetid basert kamera systemer, for eksempel brukte gated time-domene kameraer8,26, romanen kamera system og protokoll som presenteres her kan levere sammenlignbare resultater. I en fersk publikasjon ble de analytiske egenskapene til de to systemene sammenlignet, og det ble funnet at frekvens-domene-basert luminescence livstids kamera system er minst sammenlignbare med den utgåtte tids domenebasert forgjenger8.
Vi har presentert den enkleste O2 optode bestående bare av en indikator i en polymer matrise. Foruten flere andre mulige O2 indikatorer20 som kan brukes tilsetningsstoffer kan inkluderes, dvs., spredning agenter som TiO2 eller diamantpulver2 for å øke sensor signal samtidig redusere gjennomsiktigheten av optode. Også flere fargestoffer kan brukes til å forbedre signal intensiteten via energi overføring41.
For Planar optode fabrikasjon, anbefaler vi å bruke et gap i kniv-belegg enhet av 75-120 μm å gi en endelig sensor lag tykkelse på rundt 7,5 til 12 μm etter løsemiddel fordampning (rundt 10% av brukt gap), når du bruker den beskrevne sensoren cocktail komposisjon. Dette er et godt kompromiss mellom signal intensitet, som kan endres ved høyere fargestoff lasting, eller ved å velge indikator og referanse fargestoffer av høyere lysstyrke, og responstid. En økning i lag tykkelse resulterer i en økning i responstid, som tidsrommet som er nødvendig for analytt å nå en termodynamisk likevekt i sensing laget med omkringliggende medier øker12.
Optodes, som beskrevet her, reagerer på endringer i O2 konsentrasjon innen noen få sekunder17 , mens fortsatt har et tilstrekkelig sterkt luminescence signal. Ultratynne sensor belegg med sub-sekunders responstid kan realiseres med spin-belegg6. Hvis støtte eller kniv belegg enheten ikke er godt rengjort, kan det føre til inhomogen sensor lag. Også når cocktail er ikke helt homogen eller påføres for raskt etter spredning foran belegget enheten slik en uønsket resultat kan observeres. Derfor kan det trenge litt øvelse å forberede optimal optodes.
Metoden kan brukes til bilde prøver som kan settes i nær kontakt til optode, for eksempel visse marine dyr42, biofilm6 og jord31 bare for å nevne noen. Vi presenterer et frittstående oppsett ved hjelp av en objektiv, men kameraet kan enkelt kobles til et mikroskop for høyere oppløsning kjemisk Imaging43.
Stund tid-domenen basert luminescence levetid tenkelig satt i stand til undertrykkelse av miljøet fluorescens26, denne er en utsendelse når benytter det ny hyppigheten-domenen-basert kameraet system8. På grunn av den kontinuerlige bilde oppkjøpet, vil dette kameraet registrere eventuelle bakgrunns fluorescens av prøven som kan bli opphisset av den valgte LED og avgir i den valgte Spectral vinduet som definert av utslipps filteret på kameraet målet. Dette vil resultere i en tilsynelatende lavere levetid og følgelig i falske avlesninger. I tilfelle du arbeider med prøver med en betydelig iboende fluorescens overlapper med O2 sensor eksitasjon og utslipp, er det viktig å bruke en ekstra optisk isolasjon på toppen av optode, ved å belegg et ekstra lag som inneholder Carbon Black2,17. Således, bare luminescence utsendt fra det Planar optode ville rekkevidde kameraet. For å se etter bakgrunn luminescence et bilde uten optode kan tas, som da ville utelukkende viser iboende luminescence av prøven. Det er også mulig å legge til spredning agenter som TiO2 eller diamantpulver2,44, til sensoren cocktail, for å øke luminescence intensitet av indikatorfarge stoff. Men dette kan også føre til raskere Foto bleking og TiO2 er en kjent Foto-katalysator, som kan svekke photostability av et fargestoff41. Et ytterligere aspekt å vurdere er bakgrunnslys. Når Imaging luminescence levetid, bakgrunnslys må unngås så effektivt som mulig. Derfor krever denne bildebehandlings metoden at oppsettet plasseres i et mørkt miljø, og at en ekstern lyskilde må slås av midlertidig under bildeinnhenting.
Oppsummert er luminescence livstidsprevalens en robust kjemisk bildebehandlings metode som kan tilpasses mange forskjellige bruksområder. Denne protokollen (se avsnitt 1-5) dekker alle de grunnleggende trinnene for å generere en O2 bilde og bruker tiden mest fleksible frekvens-domene luminescence levetid Imaging system, som kan erstatte nedlagte gated time-domene kamera for 2D O2 Imaging med Planar optodes.

Fordelingen og dynamikken i oppløste gasser og ioner i sedimenter og jord gir viktig informasjon om biokjemiske prosesser som mikrobiell åndedrett1,2, eller radial oksygen tap fra planterøtter3,4,5, og den kjemiske mikromiljøet av mikrober6,7, plante rhizospheres5,8,9 og Animal Burrows10, 11,12. Biologisk og kjemisk aktivitet i slike diffusjon-begrensede miljøer kan skape bratte graderinger av kjemiske underlag eller produkter av biokjemiske prosesser. Spesielt har O2 tilgjengelighet en stor innvirkning på biokjemiske prosesser og dermed biologi og økologi av et system13. Derfor er det å analysere O2 konsentrasjoner ved høy romlig og timelig resolusjon av førsteklasses betydning i akvatiske og terrestriske vitenskaper. Først ble elektrokjemiske og optisk mikrosensorer14,15 utviklet for å måle denne viktige analytt. Senere, 2 dimensjonale (2D) Imaging av O2 med Planar optodes ble innført12,16,17,18,19, som aktiverte visualisering og kvantifisering av heterogen O2 distribusjon i jord og sedimenter.
Planar O2 optodes består av en O2-følsom indikatorfarge stoff20, som er oppløst i en passende polymer21. Indikatoren fargestoff er spent på bestemte optiske bølgelengder og avgir rød-forskjøvet lys ved avslapping i form av luminescence. I nærvær av O2, den spent indikatorfarge stoff kan overføre sin energi til O2 molekylet ved kollisjon, som er referert til som kollisjon-baserte luminescence slukke22. Derfor reduseres luminescence intensitet og luminescence levetid med økende O2 konsentrasjon23. I et ideelt tilfelle endringen i intensitet og levetid følger Stern-volmer ligningen (ligning 1) ved hjelp av enten luminescence intensitet eller levetid i fravær (I0; τ0) eller tilstedeværelse (i, τ) av O2 ved en gitt konsentrasjon [Q]. Stern-volmer-konstanten (KSV) er et mål for følsomheten til Optode mot O2; KSV er avhengig av miljøvariabler som temperatur og trykk.
1<img align="center" src="/files/ftp_upload/60191/60191eq1.jpg">
Opptak slike endringer i luminescence over en Planar sensor folie med et kamera system kan brukes til å visualisere de tilsvarende endringene i O2 Distribution. I utgangspunktet ble enkle luminescence intensitet-baserte O2 Imaging brukt18. Imidlertid er slik metodikk svært følsom for ytre forstyrrelser, som kompromiss påliteligheten av resultatene på grunn av heterogen belysning, svingninger i eksitasjon kilde eller kamera, samt ujevn fordeling av indikatorfarge stoff innenfor Planar optode.
Noen av disse begrensningene kan lindres ved hjelp av Planar optodes for ratiometrisk Imaging17,24, der o2-følsom indikatorfarge stoff er co-immobilisert i polymer laget av Planar optode med en ufølsom referanse fargestoff emitting i en annen Spectral rekkevidde enn O2-indikator. Basert på utslipps bilder ervervet i to Spectral Windows, er O2-sensitive utslipp signal delt av referanse signalet, genererer et forhold bilde som er mindre utsatt for ovennevnte forstyrrelser5,17. Metoden krever bruk av en andre fargestoff, som ideelt sett kan bli begeistret av den samme eksitasjon kilde, men avgir en annen bølgelengde (uten signifikant Spectral overlapping), i en annen Spectral vindu av kameraet (f. eks, i en annen fargekanal på et RGB kamera).
Alternativt kan O2 Imaging baseres på kvantifisere o2-avhengig endring i luminescence levetid for indikatorfarge, som ikke påvirkes av ujevn belysning eller heterogeniteter i indikator konsentrasjonen25. Første luminescence livstids BAS ertO 2 Imaging-systemer var basert på tids domene målinger med en gate-stand ladet koblet enhet (CCD) kamera system26, hvor en pulserende eksitasjon kilde brukes og luminescence bilder er tatt over definerte tidsintervaller innenfor eksitasjon eller utslipp av indikatoren8,23,27. Fra slike bilder, kan luminescence levetid fastsettes og korrelert til tilsvarende O2 konsentrasjon i en kalibrering. Deretter kan luminescence livstids bilder for et gitt utvalg presset mot Planar optode konverteres til bilder av den tilsvarende 2D-fordelingen av O2 -konsentrasjonen. Denne system er blitt anvendt inne mange søknadene begge to inne laboratoriet og inne situ16,28, bortsett fra det vesentlige gate-dugelig CCD kameraet er ikke lenger kommersielt anvendelig.
Nylig ble en annen luminescence levetid kamera systemet lansert, som kjøper bilder i frekvens-domene8. Systemet er avhengig av en kontinuerlig modulert lys kilde for eksitasjon. Dette kan enten være en sinusformet eller firkantet bølge i stedet for en pulserende eksitasjon, som brukes til bildeoppkjøp i tids domenet. Dette modulering resulterer i en modulert luminescence utslipp av O2 indikatorfarge stoff, som er fase-forskjøvet ved en vinkel, φ, som er avhengig av luminescence levetid av indikatoren fargestoff (τ) (se ligning 2).
2<img align="center" src="/files/ftp_upload/60191/60191eq2.jpg">
Endringen mellom eksitasjon og utslipps amplitude (dvs. den såkalte modulerings indeksen eller dybden (amplitude delt på den konstante luminescence delen)) er også avhengig av luminescence levetid. Så, ved å sette en kjent modulering frekvens den spesielle CMOS bildesensor i kameraet er i stand til å måle luminescence levetid i NS til μs rekkevidde som beskrevet i detalj andre steder 8,29,30. En generell veiledning om operasjonen prinsippet kan bli funnet (ved hjelp av følgende link <a href="https://www.youtube.com/watch?v=xPAB_eVWOr8" target="_blank">https://www.youtube.com/watch?v=xPAB_eVWOr8</a>).
I følgende protokoll, viser vi bruk av romanen kamera system for Imaging fordelingen av O2 konsentrasjon rundt røttene av akvatiske ferskvann anlegget Littorella uniflora i 2D9,31. Vi ønsker å understreke at denne metoden er på ingen måte begrenset til dette programmet. Oksygen følsomme optodes eller sensor partikler27 i kombinasjon med ulike Imaging metoder har blitt brukt i medisinsk forskning32, i bioprinting33, for trykkfølsomme malinger34,35, eller å studere fotosyntetiske systemer2,36,37, bare for å nevne noen andre felt av programmet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Air pump with air stone and water pump</td>
			<td>Local aquarium store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>67-66-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC4 silicone compound</td>
			<td>Dow Corning GmbH</td>
			<td>2793695</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas mixer</td>
			<td>V&#246;gtlin Instruments GmbH</td>
			<td>red-y compact meter GCM</td>
			<td>This is just one possible instrument. Several companies offer gas mixing devices</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass plates and aquaria</td>
			<td>Local aquarium or hardware store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Freely available imaging software (imagej.nih.gov/ij/index.html)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knife-coating device</td>
			<td> 
			 
			BYK-GARDNER GMBH byk.com</td>
			<td>2021</td>
			<td>This is a four sided film applicator enabling easy variation of the film thickness. Other versions are also available. We recommend a thickness of the applied film between 75-120 &#181;m, which yields a final sensor layer thickness of ~10% of the applied thickness before solvent evaporation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED lamp, Reflector PAR38</td>
			<td>Megaman</td>
			<td>MM17572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED LEDHUB</td>
			<td>Omicon Laserage, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Can be configured with a variety of LEDs. For the presented example, the green LED (528 nm) is essential</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LOCTITE AA 3494</td>
			<td>Henkel AG &#38; Co. KGaA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Acrylic-based instant adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements AR Software</td>
			<td>Nikon Inc</td>
			<td></td>
			<td>Software package used for image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pco.flim</td>
			<td>PCO AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Frequency domain based luminescence lifetime camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>platinum(II)-5,10,15,20-tetrakis-(2,3,4,5,6-pentafluorphenyl)-porphyrin (PtTFPP)</td>
			<td>Frontier Scientific</td>
			<td>PtT975</td>
			<td>O2 indicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene terephthalate (PET) foil</td>
			<td>Goodfellow</td>
			<td>320-992-72</td>
			<td>Such foils might also be found from other providers and serve as solid support</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene (PS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9003-53-6</td>
			<td>Polymer matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schott RG610 filter</td>
			<td>www.uviroptics.com</td>
			<td></td>
			<td>Here 52mm screw on Filters can obtained. Other sources offer square glass filters from Schott glass that can be fixed in front of the objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl electrical tape</td>
			<td>Scotch, Super 33+</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Makro Planar 2/100 with Hama C for Nikon adaptor</td>
			<td>delivered with the camera</td>
			<td></td>
			<td>Here any other objective might also be used in combination with an adaptor if the objective does not have a C-mount</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

luminescence lifetime imaging of o2 with a frequency-domain-based camera system

Vi beskriver en metode for å avbilde oppløst oksygen (O2), i 2D ved høy romlig (< 50-100 μm) og temporal (< 10 s) oppløsning. Metoden sysselsetter O2 følsom selvlysende sensor folier (Planar optodes) i kombinasjon med et spesialisert kamera system for Imaging luminescence levetid i frekvens-domene. Planar optodes er utarbeidet ved å oppløse O2-sensitive indikatorfarge stoff i en polymer og spre blandingen på en solid støtte i en definert tykkelse via kniv belegg. Etter fordampning av løsemiddel, er den Planar optode plassert i nær kontakt med prøven av interesse-her demonstrert med røttene av vann anlegget Littorella uniflora. O2 konsentrasjon-avhengig endring i luminescence levetid av indikatoren fargestoff innenfor Planar optode er avbildet via baksiden av gjennomsiktig bærer folie og akvarium veggen ved hjelp av et spesielt kamera. Dette kameraet måler luminescence levetid (μs) via en forskyvning i fasevinkelen mellom et modulert eksitasjon signal og utslipps signal. Denne metoden er overlegen luminescence intensitet Imaging metoder, som signalet er uavhengig av fargestoff konsentrasjon eller intensiteten av eksitasjon kilden, og utelukkende er avhengig av luminescence forfall tid, som er en ubetinget referert parameter. Følgelig, en ekstra referanse fargestoff eller andre former for henvisning er ikke nødvendig. Vi viser bruken av systemet for makroskopisk O2 Imaging av anlegget rhizospheres, men kameraet systemet kan også enkelt kobles til et mikroskop.

Som et program eksempel for den nye Imaging system, viser vi 2D O2 Imaging av en kompleks biologisk utvalg (dvs. rhizosphere av vann anlegget Littorella uniflora).
For det første beskriver metoden fabrikasjon av en Planar sensor film, en såkalt Planar optode. Som sett i figur 1, er en slik optode laget av et tynt lag av en optisk indikator i en polymer matrise som er spredt på en transparent støtte. Ved å følge den beskrevne protokollen, en homogen sensor film med en jevn tykkelse, som definert av gapet av kniven belegg enhet, er innhentet. Hvis den produserte optode har en usammenhengende sensor materiale fordeling (f. eks, hull i belegget, viser striper, eller Dye aggregater (dette kan evalueres visuelt, og visuelt ved hjelp av en UV-lampe)), må protokollen skal gjentas og alle materialer må rengjøres grundig ved hjelp av aceton.
Når Planar optode er forberedt, kan prøven bringes i nær kontakt med sensing laget av Planar optode, som vist her med Planar optode integrert i et rhizo-sandwich kammer, hvor røttene av en plante innenfor en omkringliggende sediment matrise kan plasseres i nær kontakt til Planar optode (figur 2). Hvis forberedt på riktig måte, bør rhizo-sandwich kammeret enkelt kan bevegelig fra et akvarium (inkubasjons) til det andre (måling). Hvis den ikke er konstruert riktig, kan det rhizo-sandwich kammeret bli ustabil, miste sediment eller inneholde luftbobler. Visuell undersøkelse av rhizo-sandwich kammeret rett etter monteringen er derfor anbefalt.
Den gitte protokollen muliggjør frekvens-domene-basert luminescence levetid Imaging av prøven i kontakt med Planar optode ved hjelp av frekvens-domene-basert luminescence livstids kamera. Flere detaljer om dette kameraet systemet som modus for bildeoppkjøp og vitenskapelige komplementære metall-oksid-Semiconductor (SCMOS) kameraegenskaper er gitt i nyere publikasjoner8,29.
Det setup selv er temmelig enkel og bare inkluderer kameraet det kontroller en lyset kilde (i dette tilfellet, en smal avsats eksitasjon kilde) og prøven med det optode (skikkelsen 3). Kontroller at alle delene er riktig tilkoblet og at prøven er opplyst homogent. Bakgrunnslys må unngås mens preforming målinger.
Optode må kalibreres før du kan avbilde prøven. Som sett i Figur 4A, den målte luminescence levetid avtar med økende O2 konsentrasjon etter en kvasi-eksponentiell forfall. Dette forholdet kan også beskrives ved hjelp av forenklet to-område-modellen (Figur 4B og ligning 3). I det gitte eksempelet er parametrene som trengs for å senere beregne O2 -konsentrasjonen var som følger; τ0 = 56,26 μs, KSV = 0,032 HPA-1 og f = 0,86.
Å utføre en kalibrering er også en ideell metode for å teste at systemet fungerer som det skal. Hvis alle komponentene er installert som beskrevet her (eller innenfor produsentens retningslinjer), skal den målte levetiden vise samme O2 -avhengighet som vist i Figur 4. I tillegg, for den samme kombinasjonen av O2 sensing materialer (polymer og fargestoff), den målte τ0 bør være i samme område (± noen μs) som måles her (hovedsakelig påvirket av eksperimentell temperatur). Hvis du ikke får tak i en lignende kalibrerings kurve, må du kontrollere at alle trinnene ble fulgt på riktig måte. Noen ganger optode er tilfeldigvis festet med den følsomme siden mot glassveggen i stedet for prøven, eller ervervet bildene er over-eller undereksponert.
Med kalibrerings parametrene er det mulig å bestemme O2 -konsentrasjonen ved å avbilde luminescence levetid (τ). Dette er demonstrert i figur 5A, B, der fordelingen av O2 konsentrasjon i rhizosphere av Littorella uniflora ble avbildet i mørket og etter lys eksponering til 500 mikromol fotoner m-2 s-1 for 12 h, henholdsvis. På grunn av den fotosyntetiske aktiviteten til anlegget, økte O2 -konsentrasjonen i rhizosphere etter lys eksponering. Foruten levetid bilder, også "strukturelle" bilder kan anskaffes under ekstern belysning, mens du holder Imaging geometri fast. På denne måten kan O2 bilder være nøyaktig korrelert til det strukturelle bildet (figur 5C), tverrsnitt eller regioner av interesse. Som et eksempel ble O2 konsentrasjon profiler over en enkelt rot Hentet fra bildet ervervet i mørke og lys, henholdsvis (figur 5D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60191/60191fig1a.jpg"> Figur 1: fabrikasjon av en Planar O2 optode. (A) et kjæledyr folie er festet på en glassplate og kniv-belegg enheten er plassert på folien. (B) den tilberedte sensor cocktail er SPREDT på pet-folien som en tynn linje foran kniv belegg enheten. (C) kniv-belegg enheten er flyttet nedover for å spre sensoren cocktail som en tynn film på pet folie, som etter løsemiddel fordampning resulterer i en klar til bruk Planar optode. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60191/60191fig1alarge.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60191/60191fig2a.jpg"> Figur 2: Rhizo-sandwich kammer montering med integrering av en Planar O2 optode. (A) optode er festet på en av glass platene ved hjelp av en vann film. (B) optode limes til platen med elektrisk tape. (C) sediment er fylt inn i motstanderens plate med vedlagte avstandsstykker (dvs. mikroskop lysbilder). (D) planterøttene er plassert på jevnt fordelt sediment. (E) rhizo-sandwich kammeret er lukket og midlertidig festet med klemmer. (F) helt lukket og montert rhizo-sandwich kammer. (G) for å beskytte optode mot lys eksponering av inkubasjons lampe og for å unngå alger vekst er et plast deksel plassert over det monterte rhizo-sandwich kammeret. (H) rhizo-sandwich kammer inkubert i et akvarium. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60191/60191fig2alarge.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60191/60191fig3a.jpg"> Figur 3: Imaging setup inneholder frekvens-domene-basert luminescence levetid kamera, med mål fokusert på prøven med optode bakfra via det gjennomsiktige akvariet og rhizo-sandwich kammervegger. Lys føreren til LED-eksitasjon er plassert for å lyse opp prøven jevnt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60191/60191fig3alarge.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60191/60191fig4a.jpg"> Figur 4: kalibrerings kurver for Planar O2 optode. (A) ulike Morelden levetid målt ved de respektive O2 konsentrasjoner i vann fylte kalibrerings kammeret. (B) Stern-volmer plott av kalibreringsdata montert ved hjelp av forenklet to-site modell for dynamisk collisional slukke (ligning 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60191/60191fig4alarge.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60191/60191fig5a.jpg"> Figur 5: Lifetime Imaging av O2 fordelingen i rhizosphere av vann anlegget Littorella uniflora. (A) O2 fordeling etter å ha holdt anlegget under lys i 12 timer ved ca. 500 mikromol fotoner m-2 s-1. (B) O2 fordeling etter å ha holdt anlegget i mørket for 1 h. (C) strukturelle bildet av planterøttene sett gjennom Planar optode. (D) tverrsnitt O2 konsentrasjons profil (plasseringen indikeres av den gule linjen i panel A og B) etter 12 timer i lys (rød) og 1 t i mørket (svart). Tilpasset med tillatelse fra (Koren, K., Moßhammer, M., Scholz, V. V., Borisov, S.M., Holst, G., Kühl, M. luminescence Lifetime Imaging av kjemiske sensorer-en sammenligning mellom tids-domene og frekvens-Domain baserte kamera systemer. Analytisk kjemi. 91 (5), 3233-3238, Doi: 10.1021/ACS. analchem. 8b05869 (2019)). Copyright (2019) American Chemical Society. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60191/60191fig5alarge.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Luminescence Lifetime Imaging of O2 with a Frequency-Domain-Based Camera System at JoVE.com

Luminescence Lifetime Imaging of O2 with a Frequency-Domain-Based Camera System

Vi beskriver bruken av en roman, frekvens-domene luminescence livstids kamera for kartlegging 2D O2 distribusjoner med optisk sensor folier. Kamera system og bildeanalyse prosedyrer er beskrevet sammen med utarbeidelse, kalibrering og anvendelse av sensor folier for å visualisere O2 mikromiljøet i rhizosphere av vannplanter.

Luminescence Lifetime Imaging av O2 med en frekvens-domene-basert kamera system

We describe a method to image dissolved oxygen (O2), in 2D at high spatial (&#60; 50-100 &#181;m) and temporal (&#60; 10 s) resolution. The method employs ...

Som den beste elektron-akseptoren spiller oksygen en avgjørende rolle i biologiske systemer. Med denne protokollen kan du se av oksygenfordelingen i 2D ved hjelp av en optode. I tillegg til sin høye romlige og timelige oppløsning, krever denne metoden ikke et ekstra referansefargestoff, er ekstremt robust, og tillater oppkjøp av strukturelt bilde.Denne metoden kan brukes på ulike forskningsområder der oksygen spiller en nøkkelrolle, inkludert økologi, medisinsk forskning, bioprinting og trykkfølsom utskrift. Optode fabrikasjonen kan være utfordrende som mengden cocktail lagt til støtte folie og kniv belegg enheten drag hastighet kan kreve optimalisering og praksis. Med dette videobidraget ønsker vi å gjøre denne kraftige teknikken tilgjengelig for forskere fra andre fagområder.For å forberede en planar oksygen optode, først bruke en film av vann eller 70% etanol for å fikse en ren støvfri PET folie på en ren glassplate. Plasser en ren 120 mikrometerknivbelegg på folien og bruk en glasspipette til å bruke en sensorcocktail foran enheten. Deretter drar du knivbelegget sakte og jevnt over PET-folien for å spre cocktailen jevnt.Tørk deretter den ferdige planar oksygenfølsomme optode i omgivelsesluft i en time før tørking over natten i et oppvarmet skap ved 50 til 60 grader Celsius. Neste morgen vil et ca. 12 mikrometer tykt lag ha blitt oppnådd. Oppbevar optodeen beskyttet mot lys inntil videre bruk.For å forberede et rhizo-sandwichkammer, bruk lett herdbar akrylbasert øyeblikkelig lim for å lime mikroskopsklier langs kantene på en glassplate og la en lang kant være åpen. Skjær planar optode i ønsket form og størrelse for å passe inn i mellomrommet mellom limt mikroskop lysbilder og plassere optoden på innsiden av frontglassplaten med den belagte siden oppover. Tape den ene kanten av optodefolien til glassplaten og tilsett vann fra springen mellom glassplaten og optodefolien.Senk forsiktig folien på vanndråpene slik at optoden kan rette seg ut på glassoverflaten og bruke et mykt vev til å forsiktig fjerne en luftbobler fanget mellom optode og platen. Tørk deretter av glassplaten tørr og teip de resterende kantene av folien til platen. Deretter bruker du en flat glassplate til å fordele 0,5 millimeter silesediment jevnt over platen til samme tykkelse som mikroskopsklie avstandsstykkene.Rengjør forsiktig den øvre overflaten av mikroskopet lysbildet for å sikre at den andre glassplaten forsegler kammeret riktig og bruke silikon fett på mikroskopet lysbildeoverflaten. Dekk deretter sedimentet med en tynn film av vann samtidig som det forsiktig unngår dannelsen av luftbobler. Før du plasserer en prøve på sedimentet, vask forsiktig en enkelt shoot av Littorella uniflora og plasser skuddet på et sediment med bladene som stikker ut fra den øvre åpne siden.Når prøven er på plass, legg glassplaten med optoden på sedimentet og påfør mildt trykk for å bringe optoden i nær kontakt med planterøttene og det omkringliggende sedimentet. Bruk klemmer til å feste platene sammen og tørke de ytre kantene med silkepapir. Legg gjentatte ganger noen dråper vann til bladene for å holde planten hydrert gjennom hele monteringen av rhizo-sandwich og bruk vinyl elektrisk tape for å stramme rhizo-sandwichkammeret.Deretter forsegle kantene med modellering leire og ekstra elektrisk tape. For å forberede bildebehandling, fjern dekkfolie fra optodeområdet etter inkubasjon og plasser rhizo-sandwichkammeret med glassveggen med optode oppreist mot akvarieveggen. Bruk en avstandsstr til å trykke jordsten-sandwich kammeret mot veggen.Plasser det frekvensdomenebaserte luminescence lifetime-kameraet utstyrt med et mål foran akvariet og interesseområdet. Fest et passende utslippsfilter for å avbilde indikatorfargen til kameramålet og fest lysføreren i LED-eksitasjonskilden. Plasser deretter guiden slik at den jevnt lyser opp planar optode folie som dekker interesseområdet.I bildebehandlingsprogramvaren velger du kameraet og velger LED-lampen i LED-kontrollprogramvaren. Still inn LED-intensiteten etter behov, og kryss analog og synkroniser for å bekrefte at LED-lampen utløses av den eksterne transistortransistorlogikken. Fokuser kameraet manuelt og juster objektiv blenderåpningen og sett den interne modulasjonskilden, sinusbølgen for utgangsbølgeformen, ekstra faseprøvetaking, åttefasede prøver, faserekkefølge motsatt, trykk på A B-avlesning og fem kilohertzmodulasjonsfrekvens.Juster eksponeringstiden til interessestatistikkens områdeavlesning for det normaliserte luminescence-intensitetsbildet er i området 0,68 til 0,72. Klikk deretter på opptaksreferanse for å starte oppkjøpet av en referansemåleserie. For å kalibrere optoden, bruk en gassblandingsenhet til å skylle vannet i et kalibreringsakvarium med en omgivelsesluftnitrogengassblanding med en kjent oksygenkonsentrasjon som overvåker oksygenkonsentrasjonen med en ekstern sonde med en oksygensensor.Deretter får du en rekke bilder ved forskjellige oksygenkonsentrasjoner i kalibreringskammeret for å oppnå en riktig kurve som passer til de oppkjøpte kalibreringsdataene. Når systemet er kalibrert, slår du av lysene ved bruk av bestråling på anlegget og alle de andre lyskildene og justerer oppkjøpstiden basert på intensiteten av bildet for å sikre at signalet verken er overmettet eller for svakt for et godt signal-til-støy-forhold i levetidsbestemmelsen. Når alle oksygenlevetidsbildene er anskaffet, slår du på lysene igjen for å få et strukturelt bilde og får et bilde med en linjal i synsfeltet for å muliggjøre etterfølgende skalering av de oppkjøpte bildene.Før prøven avbildning må optoden kalibreres. Etter en kvasi-eksponentiell forfall reduseres den målte luminescencelevetid etter hvert som oksygenkonsentrasjonen øker. Denne relasjonen kan også beskrives ved hjelp av den forenklede to-områdemodellen.Når optoden er kalibrert, er det mulig å bestemme oksygenkonsentrasjonen ved å avbilde luminescence levetiden som observert i disse bildene der fordelingen av oksygenkonsentrasjonen i rhizosphere av Littorella uniflora ble avbildet etter lyseksponering for 500 mikromol fotoner per meter kvadrert per sekund i 12 timer og etter 12 timer i mørket. I tillegg til livstidsbilder kan strukturelle bilder også anskaffes under ekstern belysning samtidig som bildegeometrien er fast for å tillate oksygenavbildningen å være nøyaktig korrelert med det strukturelle bildet. Oksygenkonsentrasjonsprofiler over en enkelt rot kan for eksempel deretter trekkes ut fra bildene som er oppnådd i mørke og lys.Det er viktig å ha god kontakt mellom prøvematrisen og optode for å unngå unødvendige artefakter. Hvis du er i tvil, remake sandwich. Det øyeblikkelige oppkjøpet av et bilde på en ikke-destruktiv måte muliggjør overvåking av oksygenmiljøet.Metoden kan like godt kombineres med andre optoder for pH eller andre analyser. Sørg for å utføre optode fabrikasjon i en røykhette som sensorcocktailen inneholder kloroform. Planar optodes kan brukes til å identifisere mikrobielle samfunn i sedimentet.Og etter avbildning kan smørbrødet åpnes opp for å prøve disse hot spots for mikrobiell samfunnsanalyse.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Luminescence Lifetime Imaging of O2 with a Frequency-Domain-Based Camera System

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

Forbereder Adherent Cells for X-ray fluorescens Imaging ved Kjemisk Fixation

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Water in Oil Emulsions: A New System for Assembling Water-soluble Chlorophyll-binding Proteins with Hydrophobic Pigments

Vann i olje emulsjoner: Et nytt system for Montering Vannløselige Klorofyll bindende proteiner med Hydrofobe Pigmenter

Chlorophylls (Chls) and bacteriochlorophylls (BChls) are the primary cofactors that carry out photosynthetic light harvesting and electron transport. ...

Visualization of Ambient Mass Spectrometry with the Use of Schlieren Photography

Visualisering av Ambient massespektrometri med bruk av Schlieren Photography

This manuscript outlines how to visualize mass spectrometry ambient ionization sources using schlieren photography. In order to properly optimize the mass ...

A Simple, Low-cost, and Robust System to Measure the Volume of Hydrogen Evolved by Chemical Reactions with Aqueous Solutions

En enkel, billig og robust system for å måle volumet av Hydrogen Evolved ved kjemiske reaksjoner med vannløsninger

There is a growing research interest in the development of portable systems which can deliver hydrogen on-demand to proton exchange membrane (PEM) ...

Measurements of Long-range Electronic Correlations During Femtosecond Diffraction Experiments Performed on Nanocrystals of Buckminsterfullerene

Målinger av langtrekkende elektronisk sammenhenger under Femtosecond Diffraksjon eksperimenter utført på nanokrystaller av Buckminsterfullerene

The precise details of the interaction of intense X-ray pulses with matter are a topic of intense interest to researchers attempting to interpret the ...

Time-resolved Photophysical Characterization of Triplet-harvesting Organic Compounds at an Oxygen-free Environment Using an iCCD Camera

Tid-løst Photophysical karakteristikk av trilling-fangst organiske forbindelser på et oksygenfri miljø ved hjelp av en iCCD kamera

Here, we present a sensible method of the acquisition and analysis of time-resolved photoluminescence using an ultrafast iCCD camera. This system enables ...

Regioselective O-Glycosylation of Nucleosides via the Temporary 2',3'-Diol Protection by a Boronic Ester for the Synthesis of Disaccharide Nucleosides

Regioselective O-Glycosylation of Nucleosides via the Temporary 2',3'-Diol Protection by a Boronic Ester for the Synthesis of Disaccharide Nucleosides

Regioselective O- glykosylering av Nucleosides via den midlertidige 2', 3-Diol beskyttelse av en Boronic Ester for syntese av smakløst Nucleosides

Disaccharide nucleosides, which consist of disaccharide and nucleobase moieties, have been known as a valuable group of natural products having ...

Synthesis and Structure Determination of &#181;-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities

Synthesis and Structure Determination of ÃƒÆ’Ã¢â‚¬Å¡Ãƒâ€šÃ‚Âµ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities

Syntese og proteinstrukturer av μ-Conotoxin PIIIA isomerene med forskjellige Disulfide Connectivities

Peptides with a high number of cysteines are usually influenced regarding the three-dimensional structure by their disulfide connectivity. It is thus ...

Automation of a Positron-emission Tomography (PET) Radiotracer Synthesis Protocol for Clinical Production

Automation of a Positron-emission Tomography PET Radiotracer Synthesis Protocol for Clinical Production

Automatisering av en fantes et Positron-utslipp tomografi (PET) Radiotracer syntese protokoll for klinisk produksjon

The development of new positron-emission tomography (PET) tracers is enabling researchers and clinicians to image an increasingly wide array of biological ...

Solid Phase 11C-Methylation, Purification and Formulation for the Production of PET Tracers

Solid Phase 11C-Methylation, Purification and Formulation for the Production of PET Tracers

Solid Phase 11C-metylering, rensing og formulering for produksjon av pet Bevegelsesuskarphet

Routine production of radiotracers used in positron emission tomography (PET) mostly relies on wet chemistry where the radioactive synthon reacts with a ...