Name: luminescence lifetime imaging of o2 with a frequency-domain-based camera system
Uploaded: 2019-12-16T14:00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Luminescence Lifetime Imaging of O2 with a Frequency-Domain-Based Camera System at JoVE.com

Мы благодарим Софи Линдегор Якобсен (Копенгагенский университет) и Ларса Боррегора Педерсена (Орхусский университет) за техническую помощь. Финансирование этого исследования было получено за результат гранта Sapere-Aude Advanced от Независимого исследовательского фонда Дании (DFF-1323-00065B; МК), гранты на проекты от Независимого исследовательского фонда Дании естественные науки (DFF-8021-00308B; МК) и технические и производственные науки (DFF-8022-00301B и DFF-4184-00515B; МК), Датский национальный исследовательский фонд (DNRF136) и Фонд Поул Ду Йенсена (KK).

Автор Герхард Холст является сотрудником PCO AG, который производит камеру системы, используемой в этой статье. PCO AG внесла финансовый вклад в публикацию и расходы на открытый доступ к этой статье.

В этом протоколе охватывается весь рабочий поток от подготовки оптодов к анализу изображений O2. Следуя этому протоколу, химические изображения могут быть получены с помощью новой частоты домена основе люминесценции жизни камеры. В зависимости от применения, планар оптод может быть изготовленв в различных размерах и толщиной слоя слоя сенсорного слоя, начиная от надежных 50-100 мкм толщиной планар оптод несколько десятых квадратных сантиметров до микроскопа крышка скользит с lt;1 мкм толщиной датчика слоев6,40. Потенциал этого метода был продемонстрирован с конкретным применением, но не ограничивается только O2 изображения в растениях rhizospheres12,28.
Этот метод имеет несколько преимуществ по сравнению с чистой люминесценции интенсивности на основе химических методов визуализации. Люминесценция жизни изображения не является, или, по крайней мере, гораздо меньше, пострадавших от неравномерного освещения, неравномернотолотачение толщины, и фото отбеливания25. Кроме того, этот метод позволяет избежать использования дополнительного эталонного красителя, распространенного в коэффициентеметрической визуализации17,37. По сравнению с другими системами камер на основе жизни, таких как широко используемые закрытые камеры тайм-домен8,26, новая система камеры и протокол, представленный здесь может доставить сопоставимые результаты. В недавней публикации были сопоставлены аналитические характеристики этих двух систем, и было установлено, что система люминесценции на основе частотного домена, по крайней мере, сопоставима с прекращенным предшественником на основе тайм-домена8.
Мы представили простейшую оптоду O2, состоящую только из индикатора в полимерной матрице. Помимо нескольких других возможных индикаторов O22, которые могут быть использованы добавки могут быть включены, т.е. рассеяния агентов, таких как TiO 2 или алмазный порошок2 для увеличения сигнала датчика при одновременном снижении прозрачности оптоды. Также дополнительные красители могут быть использованы для повышения интенсивности сигнала с помощью передачи энергии41.
Для изготовления планарного оптода мы рекомендуем использовать зазор в устройстве покрытия ножом 75 - 120 мкм, чтобы дать окончательный сенсорный слой толщиной около 7,5 до 12 мкм после испарения растворителя (около 10% от используемого зазора), при использовании описанного состава датчика коктейль. Это хороший компромисс между интенсивностью сигнала, который может быть изменен более высокой загрузкой красителя, или путем выбора индикатора и эталонных красителей более высокой яркости и времени отклика. Увеличение толщины слоя приводит к увеличению времени отклика, так как временной промежуток, необходимый для поиска термодинамического равновесия в сенсирующем слое с окружающими носителями, увеличивается на12.
Оптоды, как описано здесь, реагируют на изменения концентрации O2 в течение нескольких секунд17, имея при этом достаточно сильный сигнал люминесценции. Ультратонкие сенсорные покрытия с субсекундным временем отклика могут быть реализованы со спин-покрытием6. Если опоры или устройство для покрытия ножом не хорошо очищены, это может привести к неоднородным слоям датчика. Кроме того, когда коктейль не является полностью однородным или применяется слишком быстро после распространения перед устройством покрытия такой нежелательный результат может наблюдаться. Поэтому, возможно, потребуется некоторая практика для подготовки оптимальных оптодов.
Метод может быть использован для изображения образцов, которые могут быть помещены в тесном контакте с оптодой, таких как некоторые морские животные42, биопленки6 и почвы31 просто назвать несколько. Мы представляем автономную установку с помощью цели, однако, камера может быть легко соединена с микроскопом для химического изображения более высокого разрешения43.
В то время как время домена на основе люминесценции жизни изображения включенповпой фоновой флуоресценции26, это проблема при использовании новой частоты домена на основе камеры системы8. Благодаря непрерывному приобретению изображения, эта камера будет записывать любой фон флуоресценции образца, которые могут быть возбуждены по выбранному светодиоду и испускает в выбранном спектральном окне, как это определено фильтром выбросов на цели камеры. Это приведет к явно более низкому сроку службы и, следовательно, к ложным показаниям. В случае, если вы работаете с образцами со значительным внутренней флуоресценции перекрытия с O2 датчик возбуждения и выбросов, важно применять дополнительную оптическую изоляцию на верхней части оптоды, путем покрытия дополнительный слой, содержащий углеродный черный2,17. Таким образом, только люминесценция, излучаемых из планара оптод достигнет камеры. Для того, чтобы проверить на фоне люминесценции изображение без оптоды может быть принято, что затем будет исключительно показать внутреннюю люминесценцию образца. Также можно добавить рассеяния агентов, таких как TiO2 или алмазный порошок2,44, к датчику коктейль, чтобы увеличить интенсивность люминесценции красителя индикатора. Тем не менее, это также может привести к более быстрому отбеливанию фотографий и TiO2 является известным фотокатализатором, который может ухудшить фотостабильность красителя41. Еще одним аспектом для рассмотрения является фоновый свет. При визуализации люминесценции жизни, фоновый свет необходимо избегать как можно более эффективно. Таким образом, этот метод визуализации требует установки, которая будет помещена в темную среду и любой внешний источник света должен быть временно выключен во время приобретения изображения.
Таким образом, люминесценция жизни изображения является надежным химическим методом визуализации, которые могут быть адаптированы к различным приложениям. Этот протокол (см. раздел 1 - 5) охватывает все основные шаги для создания изображения O2 и использует в настоящее время наиболее гибкую систему визуализации люминесценции частотного домена, которая может заменить прекращенную закрытой временной домен камеры для 2D O2 изображений с планарными оптодами.

Распределение и динамика растворенных газов и ионов в отложениях и почвах обеспечивают ключевую информацию о биогеохимических процессах, таких как микробное дыхание1,2,или потеря радиального кислорода из корней растений3,4,5, и химическая микросреда микробов6,7, корневища растений5,8,9 и животных норы10, 11,12. Биологическая и химическая активность в таких средах с ограниченным диффузией может создавать крутые градиенты химических субстратов или продуктов биогеохимических процессов. В частности, доступность O2 оказывает огромное влияние на биогеохимические процессы и, таким образом, на биологию и экологию системы13. Поэтому анализ концентраций O2 при высоком пространственном и временном разрешении имеет первостепенное значение в водных и наземных науках. Во-первых, электрохимические и оптические микросенсоры14,15 были разработаны для измерения этого важного анализ. Позже, 2 мерных (2D) изображения O2 с планарными оптодами был введен12,16,17,18,19, что позволило визуализации и количественной визуализации неоднородных O2 распределения в почвах и отложениях.
Planar O2 оптод состоят из O2-чувствительныйиндикатор красителя20, который растворяется в подходящем полимере21. Краситель индикатора возбуждается на определенных оптических длинах волн и излучает красный сдвинутый свет при расслаблении в виде люминесценции. В присутствии O2, возбужденный краситель индикатора может передавать свою энергию молекуле O2 при столкновении, которая называется свечением на основе столкновений, утоляющим22. Таким образом, интенсивность люминесценции, а также люминесценции жизни снижается с увеличением концентрации O2 23. В идеальном случае изменение интенсивности и продолжительности жизни следует уравнению Стерна-Волмера (уравнение 1), используя либо интенсивность люминесценции или продолжительность жизнив отсутствие (I0;0),либо присутствие (I, q) O2 при заданной концентрации. Константа Стерн-Волмер (Ksv) является мерой для чувствительности оптода к O2; KSV зависит от экологических переменных, таких как температура и давление.
(1)<img align="center" src="/files/ftp_upload/60191/60191eq1.jpg">
Запись таких изменений в люминесценции над фольгой планарного датчика с системой камеры может быть использована для визуализации соответствующих изменений в распределении O2. Первоначально, простой интенсивности люминесценции на основе O2 изображения был использован18. Однако такая методология очень чувствительна к внешним помехам, которые ставят под угрозу надежность результатов из-за разнородного освещения, колебаний источника возбуждения или камеры, а также неравномерного распределения красителя индикатора в рамках планарного оптода.
Некоторые из этих ограничений можно облегчить с помощью планарных оптодов для социеметрической визуализации17,24, где O2-чувствительныйкраситель индикатора совместно иммобилизован в полимерном слое планарного оптода с нечувствительным эталонным красителями, испускающим в другом спектральном диапазоне, чем O2-индикатор. На основе изображений выбросов, полученных в двух спектральных окнах, сигнал O2-чувствительныйэмиссионный сигнал делится на эталонный сигнал, генерируя изображение соотношения, которое менее подвержено вышеупомянутым помехам5,17. Метод требует использования второго красителя, который в идеале может быть возбужден одним и тем же источником возбуждения, но испускает на другой длине волны (без значительного спектрального перекрытия), в другом спектральном окне камеры (например, в другом цветном канале камеры RGB).
Кроме того, Изображение O2 может быть основано на количественной оценке O2-зависимогоизменения в сроке службы свечения красителя индикатора, который не зависит от неравномерного освещения или неоднородности в концентрации индикатора25. Первый люминесценции жизни на основе O2 визуализации системы были основаны на времени домена измерений с воротами в состоянии заряженного совместного устройства (CCD) камеры системы26, где импульсный источник возбуждения используется и люминесценции изображения принимаются в течение определенных временных интервалов в пределах возбуждения или выбросовиндикатора 8,23,27. Из таких изображений, люминесценции жизни может быть определена и коррелирует с соответствующей концентрации O2 в калибровке. Впоследствии изображения люминесценции для данного образца, прижатые к планарной оптоде, могут быть преобразованы в изображения соответствующего 2D-распределения концентрации O2. Эта система была использована во многих приложениях как в лаборатории, так и на situ16,28, но основные ворота в состоянии CCD камеры больше не коммерчески доступны.
Недавно была выпущена другая система камеры люминесценции, которая приобретает изображения в частотном домене8. Система опирается на постоянно модулированный источник света для возбуждения. Это может быть синусоидальная или квадратная волна вместо импульсного возбуждения, которое используется для приобретения изображения в домене времени. Эта модуляция приводит к модулированному излучению люминесценции красителя индикатора O2, который смещается по фазе под углом, а это зависит от срока службы свечения красителя индикатора (см. уравнение 2).
(2)<img align="center" src="/files/ftp_upload/60191/60191eq2.jpg">
Изменение между возбуждением и эмиссионной амплитудой (т.е. так называемым индексом модуляции или глубиной (амплитуда, разделенная на постоянную люминесценцию) также зависит от жизни люминесценции. Таким образом, установив известную частоту модуляции, специальный датчик изображения CMOS в камере способен измерять срок службы люминесценции в диапазоне нс до диапазона,как подробно описано в другом месте 8,29,30. Общее руководство по принципу операции можно найти (с помощью следующей ссылки <a href="https://www.youtube.com/watch?v=xPAB_eVWOr8" target="_blank">https://www.youtube.com/watch?v=xPAB_eVWOr8).</a>
В следующем протоколе, мы демонстрируем использование новой системы камеры для визуализации распределения концентрации O2 вокруг корней водного пресноводного растения Littorella унифлоры в 2D9,31. Мы хотели бы подчеркнуть, что этот метод ни в коем случае не ограничивается этим приложением. Чувствительные к кислороду оптоды или сенсорные частицы27 в сочетании с различными методами визуализации были использованы в медицинских исследованиях32, в биопечати33, для чувствительных к давлению красок34,35, или для изучения фотосинтетических систем2,36,37, просто назвать несколько других областей применения.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Air pump with air stone and water pump</td>
			<td>Local aquarium store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>67-66-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC4 silicone compound</td>
			<td>Dow Corning GmbH</td>
			<td>2793695</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas mixer</td>
			<td>V&#246;gtlin Instruments GmbH</td>
			<td>red-y compact meter GCM</td>
			<td>This is just one possible instrument. Several companies offer gas mixing devices</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass plates and aquaria</td>
			<td>Local aquarium or hardware store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Freely available imaging software (imagej.nih.gov/ij/index.html)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knife-coating device</td>
			<td> 
			 
			BYK-GARDNER GMBH byk.com</td>
			<td>2021</td>
			<td>This is a four sided film applicator enabling easy variation of the film thickness. Other versions are also available. We recommend a thickness of the applied film between 75-120 &#181;m, which yields a final sensor layer thickness of ~10% of the applied thickness before solvent evaporation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED lamp, Reflector PAR38</td>
			<td>Megaman</td>
			<td>MM17572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED LEDHUB</td>
			<td>Omicon Laserage, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Can be configured with a variety of LEDs. For the presented example, the green LED (528 nm) is essential</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LOCTITE AA 3494</td>
			<td>Henkel AG &#38; Co. KGaA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Acrylic-based instant adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements AR Software</td>
			<td>Nikon Inc</td>
			<td></td>
			<td>Software package used for image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pco.flim</td>
			<td>PCO AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Frequency domain based luminescence lifetime camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>platinum(II)-5,10,15,20-tetrakis-(2,3,4,5,6-pentafluorphenyl)-porphyrin (PtTFPP)</td>
			<td>Frontier Scientific</td>
			<td>PtT975</td>
			<td>O2 indicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene terephthalate (PET) foil</td>
			<td>Goodfellow</td>
			<td>320-992-72</td>
			<td>Such foils might also be found from other providers and serve as solid support</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene (PS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9003-53-6</td>
			<td>Polymer matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schott RG610 filter</td>
			<td>www.uviroptics.com</td>
			<td></td>
			<td>Here 52mm screw on Filters can obtained. Other sources offer square glass filters from Schott glass that can be fixed in front of the objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl electrical tape</td>
			<td>Scotch, Super 33+</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Makro Planar 2/100 with Hama C for Nikon adaptor</td>
			<td>delivered with the camera</td>
			<td></td>
			<td>Here any other objective might also be used in combination with an adaptor if the objective does not have a C-mount</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

luminescence lifetime imaging of o2 with a frequency-domain-based camera system

Мы описываем метод изображения растворенного кислорода (O2),в 2D при высоком пространственном (Злт; 50-100 мкм) и временном (Злт; 10 с) разрешением. Метод использует O2 чувствительных люминесцентных фольги датчика (планар оптод) в сочетании со специализированной системой камеры для визуализации люминесценции жизни в частотном домене. Планарные оптоиды готовятся путемрастворения O 2-чувствительного крася индикатора в полимере и распространения смеси на твердую опору в определенной толщине через покрытие ножом. После испарения растворителя планарная оптода помещается в тесном контакте с образцом интереса - здесь продемонстрированы корни водного растения Littorella uniflora. O2 концентрации-зависимых изменений в люминесценции жизни индикатора красителя в планере оптод изображен через заднюю часть прозрачной фольги перевозчика и аквариумстены стены с помощью специальной камеры. Эта камера измеряет срок службы люминесценции (к) через сдвиг в фазе угла между модулированным сигналом возбуждения и сигналом выбросов. Этот метод превосходит методы визуализации интенсивности люминесценции, так как сигнал не зависит от концентрации красителя или интенсивности источника возбуждения, и опирается исключительно на время распада люминесценции, которое является внутренне ссылкапара. Следовательно, дополнительный эталонный краситель или другие средства ссылки не нужны. Мы демонстрируем использование системы для макроскопической визуализации Ризосферы растений O2, но система камеры также может быть легко соединена с микроскопом.

В качестве примера применения новой системы визуализации мы показываем 2D O2 изображения сложного биологического образца (т.е. ризосферы водного растения Littorella uniflora).
Во-первых, метод описывает изготовление пленки датчика планара, так называемой планарной оптоды. Как видно на рисунке 1,такая оптода изготовлена из тонкого слоя оптического индикатора в полимерной матрице, которая распространяется на прозрачную опору. Следуя описанному протоколу, получается однородная сенсорная пленка с равномерной толщиной, определяемая зазором устройства покрытия ножом. Если произведенная оптода имеет пятнистое распределение материала датчика (например, отверстия в покрытии, показывает полоски, или агрегаты красителя (это можно оценить визуально, и визуально with the help of лампа UV)), то протокол нужно повторить и все материалы нужно тщательно очистить используя ацетон.
После того, как планар оптод подготовлен, образец может быть приведен в тесном контакте с зондирующим слоем планарной оптоды, как показано здесь с планарным оптодом, интегрированным в rhizo-сэндвич камеру, где корни растения в окружающей матрице осадочных отложений могут быть расположены в тесном контакте с планарной оптодой(рисунок 2). При правильном приготовлении, rhizo-сэндвич камера должна быть легко подвижна из одного аквариума (инкубация) в другой (измерение). Если не сконструировано правильно, то rhizo-sandwich камера может быть нестабильна, потерять осадок или содержать пузырьки воздуха. Таким образом, рекомендуется визуальное обследование rhizo-сэндвичской камеры непосредственно после сборки.
Данный протокол позволяет частотно-домен основе люминесценции жизни изображения образца в контакте с планарной оптод с помощью частоты домена основе люминесценции жизни камеры. Более подробная информация об этой системекамеры,такие как режим приобретения изображения и научно-дополнительные металлооксид-полупроводниковые (SCMOS) характеристики камеры приведены в последних публикациях8,29.
Сама установка довольно проста и включает в себя только камеру, которая управляет источником света (в данном случае, светодиодный источник возбуждения) и образец с оптодой(рисунок 3). Убедитесь, что все части правильно соединены и что образец освещается однородно. Фоновый свет следует избегать при преформировании измерений.
Перед визуализацией образца необходимо откалибровать оптоду. Как видно на рисунке 4A, измеренный срок службы люминесценции уменьшается с увеличением концентрации O2 после квазиэкспоненциального распада. Эта взаимосвязь также может быть описана с помощью упрощенной двухузловой модели(рисунок 4B и уравнение 3). В данном примере параметры, необходимые для последующего расчета концентрации O2, были следующими; 0 - 56,26 х, Ксв 0,032 hPa-1 и f 0,86.
Выполнение калибровки также является идеальным способом проверки правильной работы системы. Если все компоненты установлены, как описано здесь (или в рамках руководящих принципов производителей), измеренный срок службы должен показать ту же зависимость O2, как видно на рисунке 4. Кроме того, для той же комбинации материалов зондирования O2 (полимер и краситель) измеренныйq 0 должен находиться в том же диапазоне (несколько сея), как измеряется здесь (главным образом под влиянием экспериментальной температуры). Если не удается получить аналогичную кривую калибровки, убедитесь, что все шаги были выполнены правильно. Иногда оптод случайно фиксируется с чувствительной стороной, обращенной к стеклянной стене, а не образец, или приобретенные изображения чрезмерно или недоэкспонированных.
С параметрами калибровки, можно определить концентрацию O2 путем визуализации люминесценции жизни (я). Это показано на рисунке 5A,B, где распределение концентрации O2 в rhizosphere унифлоры Littorella был изображен в темноте и после воздействия света на 500 фотонов м-2 s-1 на 12 ч, соответственно. Из-за фотосинтетической активности растения концентрация O2 в ризосфере увеличилась после воздействия света. Помимо изображений, также "структурные" изображения могут быть приобретены под внешним освещением, сохраняя при этом геометрию изображения фиксированной. Таким образом, изображения O2 могут быть точно коррелированы со структурным изображением(рисунок 5C),поперечными секциями или областями интереса. Например, профили концентрации O2 на одном корне были извлечены из изображения, полученного в темноте и свете, соответственно(рисунок 5D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60191/60191fig1a.jpg"> Рисунок 1: Изготовление планара O2 оптода. (A) ПЭТ-фольга фиксируется на стеклянной пластине и устройство для покрытия ножом помещается на фольгу. (B) Подготовленный датчик коктейль распространяется на ПЭТ фольги, как тонкая линия перед ножом покрытия устройства. (C) Устройство для покрытия ножом перемещается вниз, чтобы распространить датчик коктейль как тонкая пленка на ПЭТ фольги, которая после растворителя испарения приводит к готовым к использованию планарной оптоды. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60191/60191fig1alarge.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60191/60191fig2a.jpg"> Рисунок 2: Ризо-сэндвич камерная сборка с интеграцией планара O2 оптод. (A) Оптод фиксируется на одной из стеклянных пластин с помощью водяной пленки. (B) Оптод приклеен к пластине с электрической лентой. (C) Осадок заполняется в противоположной пластине с прикрепленными прокладками (т.е. слайдами микроскопа). (D) Корни растений помещаются на равномерно распределенные осадки. (E) Rhizo-сэндвич камера закрыта и временно закреплена с зажимами. (F) Полностью закрытая и собранная rhizo-сэндвич камера. (G) Для защиты оптод от воздействия света инкубационной лампой и во избежание роста водорослей пластиковая крышка помещается над собранной rhizo-сэндвич камеры. (H) Rhizo-сэндвич камеры инкубируется в аквариуме. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60191/60191fig2alarge.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60191/60191fig3a.jpg"> Рисунок 3: Установка изображения, содержащая частоту домена основе люминесценции жизни камеры, с целью сосредоточены на образец с оптод сзади через прозрачный аквариум и rhizo-сэндвич камерных стен. Световое руководство источника светодиодного возбуждения расположено для равномерного освещения образца. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60191/60191fig3alarge.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60191/60191fig4a.jpg"> Рисунок 4: Кривые калибровки для планара O2 оптода. (A) Различные фосфоресценции жизни измеряется в соответствующих Концентрации O2 в заполненной водой калибровочной камере. (B) Стерн-Волмер участок калибровочных данных, установленных с использованием упрощенной двухузловой модели для динамического закалки коллизии (уравнение 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60191/60191fig4alarge.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60191/60191fig5a.jpg"> Рисунок 5: Пожизненная визуализация распределения O2 в rhizosphere водного растения Littorella uniflora. (A) O2 распределение после поддержания завода под светом в течение 12 ч при примерно 500 фотонов м-2 s-1. (B) O2 распределения после сохранения завода в темноте в течение 1 ч. (C) Структурное изображение корней растений, как видно через планар оптоды. (D) Поперечный профиль концентрации O2 (место указывается желтой линией в панели A и B) после 12 ч в свете (красный) и 1 ч в темноте (черный). Адаптированс с разрешения (Корен, К., Мохаммер, М., Шольц, В.В., Борисов, С.М., Холст, Г., Кюль, М. Люминесценция Пожизненная Изображение химических датчиков - Сравнение между time-Domain и частотно-домен систем ы камеры. Аналитическая химия. 91 (5), 3233-3238, doi: 10.1021/acs.analchem.8b05869 (2019)). Авторское право (2019) Американское химическое общество. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60191/60191fig5alarge.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Luminescence Lifetime Imaging of O2 with a Frequency-Domain-Based Camera System at JoVE.com

Luminescence Lifetime Imaging of O2 with a Frequency-Domain-Based Camera System

Мы описываем использование новой, частотно-домен люминесценции жизни камеры для отображения 2D O2 распределения с оптическим датчиком фольги. Описаны камеры системы и процедуры анализа изображений наряду с подготовкой, калибровкой и применением сенсорной фольги для визуализации микросреды O2 в rhizosphere водных растений.

Люминесценция Пожизненное изображение O2 с частотой домена на основе камеры системы

We describe a method to image dissolved oxygen (O2), in 2D at high spatial (&#60; 50-100 &#181;m) and temporal (&#60; 10 s) resolution. The method employs ...

Как лучший электронный прием, кислород играет решающую роль в биологических системах. С помощью этого протокола вы можете изображение распределения кислорода в 2D с помощью оптода. В дополнение к высокому пространственному и временному разрешению, этот метод не требует дополнительного эталонного красителя, является чрезвычайно надежным и позволяет получить структурное изображение.Этот метод может быть применен к различным областям исследований, в которых кислород играет ключевую роль, включая экологию, медицинские исследования, биопечать и чувствительные к давлению печати. Изготовление оптода может быть сложной задачей, так как количество коктейля, добавленного в опорную фольгу и скорость перетаскивания ножного покрытия, может потребовать оптимизации и практики. С помощью этого видео вклад, мы хотим сделать этот мощный метод доступным для исследователей из других областей исследования.Чтобы подготовить планарный кислородный оптод, сначала используйте пленку воды или 70% этанола, чтобы зафиксировать чистую без пыли ПЭТ-фольгу на чистой стеклянной пластине. Поместите чистый 120-метровый нож покрытие устройства на фольгу и использовать стеклянную пипету для нанесения линии сенсорного коктейля перед устройством. Далее, перетащите нож покрытие устройства медленно и равномерно над ПЭТ фольги для равномерного распространения коктейля.Затем высушите готовый планарный кислород чувствительный оптод в окружающем воздухе в течение одного часа перед сушкой на ночь в нагретом шкафу при температуре от 50 до 60 градусов по Цельсию. К следующему утру будет получен слой толщиной около 12 микрометров. Храните оптод, защищенный от света, до дальнейшего использования.Для подготовки rhizo-сэндвич камеры, использовать свет излечимый акрил на основе мгновенного клея клей микроскоп слайды по краям стеклянной пластины оставляя один длинный край открытым. Вырезать планар optode в требуемой форме и размере, чтобы вписаться в пространство между клееным микроскопом слайды и место оптоды на внутренней стороне передней стеклянной пластины с покрытием стороны вверх. Лента один край оптоды фольги на стеклянную тарелку и добавить водопроводную воду между стеклянной пластины и оптоды фольги.Медленно опустите фольгу на капли воды, позволяя оптоду выпрямиться на поверхности стекла и использовать мягкую ткань, чтобы тщательно удалить пузырьки воздуха, захваченные между оптодом и пластиной. Затем протрите стеклянную пластину сухой и ленты оставшиеся края фольги на тарелку. Далее используйте плоскую стеклянную пластину, чтобы равномерно распределить 0,5 миллиметра сито по всей пластине до той же толщины, что и микроскоп слайд-промечений.Тщательно очистите верхнюю поверхность слайда микроскопа, чтобы убедиться, что вторая стеклянная пластина уплотняет камеру должным образом и нанесите силиконовую смазку на поверхность слайда микроскопа. Затем накройте осадок тонкой пленкой воды, тщательно избегая образования пузырьков воздуха. Перед тем, как поместить образец на осадок, тщательно промойте один выстрел из Littorella uniflora и располагайте стрелять по отложениям с листьями, торчащими из верхней открытой стороны.Когда образец на месте, поместите стеклянную пластину с оптодом на осадок и применить мягкое давление, чтобы привести оптоду в тесном контакте с корнями растений и окружающих отложений. Используйте зажимы, чтобы закрепить пластины вместе и высушить внешние края салфеткой. Неоднократно добавляйте несколько капель воды в листья, чтобы сохранить растение гидратированных всей сборки ризо-сэндвич и использовать виниловую электрическую ленту, чтобы затянуть rhizo-сэндвич камеры.Затем запечатать края с моделированием глины и дополнительной электрической лентой. Чтобы подготовиться к визуализации, удалите фольгу покрытия из области оптоды после инкубации и распоимите камеру ризо-сэндвича со стеклянной стеной с оптодом вертикально к стене аквариума. Используйте спейсер, чтобы прижмить камеру ризо-сэндвича к стене.Поместите частоту домена на основе люминесценции срок службы камеры оснащены целью перед аквариумом и области интереса. Прикрепите подходящий фильтр выбросов для визуализации красителя индикатора к цели камеры и зафиксните световое руководство в источнике светодиодного возбуждения. Затем распоить руководство так, чтобы оно равномерно освещало планарную оптодовую фольгу, покрывающую область интереса.В программном обеспечении для визуализации выберите камеру и выберите светодиод в программном обеспечении для управления светодиодами. Установите интенсивность светодиодов по мере необходимости и пометьте аналоговый и синхронизированный, чтобы подтвердить, что светодиод вызывается внешней транзистор-транзисторной логикой. Вручную сосредоточьте камеру и отрегулируйте объективную диафрагму и установите внутренний источник модуляции, синусовую волну для выходной формы волны, дополнительную фазовую выборку, восьмиступные образцы, фазовой порядок напротив, кран A B считывание и частоту модуляции пяти килогерца.Отрегулируйте время экспозиции до тех пор, пока область статистики интересов для нормализованного изображения интенсивности люминесценции не будет в диапазоне от 0,68 до 0,72. Затем нажмите ссылку захвата, чтобы начать приобретение серии эталонных измерений. Для калибровки оптоды используйте газосмешивая устройство для промывки воды в калибровочном аквариуме с помощью газовой смеси окружающего воздуха с известной концентрацией кислорода, отслеживая концентрацию кислорода с помощью внешнего зонда с помощью датчика кислорода.Затем приобрети ряд изображений в различных концентрациях кислорода в калибровочной камере, чтобы получить правильную кривую, пригодную для полученных данных калибровки. Когда система была откалибровлена, выключите свет, применяя облучение завода и всех других источников света и настроить время приобретения на основе интенсивности изображения, чтобы гарантировать, что сигнал не является ни перенасыщенным, ни слишком слабым для хорошего соотношения сигнала к шуму в определении продолжительности жизни. Когда все изображения продолжительности жизни кислорода были приобретены, включите свет обратно, чтобы получить структурное изображение и получить изображение с линейкой в поле зрения, чтобы позволить последующее масштабирование приобретенных изображений.Перед визуализацией образца необходимо откалибровать оптод. После квази-экспоненциального распада, измеренная продолжительность жизни люминесценции уменьшается по мере увеличения концентрации кислорода. Эту взаимосвязь также можно описать с помощью упрощенной двухкоумной модели.После того, как оптода была откалибровирована, можно определить концентрацию кислорода путем изображения люминесценции жизни, как это наблюдается на этих изображениях, в которых распределение концентрации кислорода в корневой сфере Littorella uniflora был изображен после воздействия света до 500 микромоле фотонов на метр в квадрате в секунду в течение 12 часов и после 12 часов в темноте. В дополнение к пожизненным изображениям, структурные изображения также могут быть приобретены под внешним освещением, сохраняя при этом геометрию изображения фиксированной, чтобы кислород изображения, чтобы быть точно коррелирует со структурным изображением. Профили концентрации кислорода в одном корне, например, могут быть извлечены из изображений, полученных в темноте и свете.Очень важно иметь хороший контакт между матрицей образца и оптодом, чтобы избежать ненужных артефактов. Если вы сомневаетесь, переделать бутерброд. Мгновенное получение изображения неразрушающим образом позволяет контролировать кислородную среду.Метод также может быть объединен с другими оптодесами для рН или других аналитов. Будьте уверены, чтобы выполнить изготовление опто в дым капот, как датчик коктейль содержит хлороформ. Планарные оптоды могут быть использованы для идентификации микробных сообществ в отложениях.И после визуализации, сэндвич может быть открыт для образца этих горячих точек для анализа микробного сообщества.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Luminescence Lifetime Imaging of O2 with a Frequency-Domain-Based Camera System

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

Подготовка прилипшие клетки для рентгеновской флуоресценции изображений по химической фиксации

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Water in Oil Emulsions: A New System for Assembling Water-soluble Chlorophyll-binding Proteins with Hydrophobic Pigments

Вода в масле: Новая система для сборки растворимых в воде Хлорофилл-связывающих белков с гидрофобными Пигменты

Chlorophylls (Chls) and bacteriochlorophylls (BChls) are the primary cofactors that carry out photosynthetic light harvesting and electron transport. ...

Visualization of Ambient Mass Spectrometry with the Use of Schlieren Photography

Визуализация Ambient масс-спектрометрии с использования шлирен Фото

This manuscript outlines how to visualize mass spectrometry ambient ionization sources using schlieren photography. In order to properly optimize the mass ...

A Simple, Low-cost, and Robust System to Measure the Volume of Hydrogen Evolved by Chemical Reactions with Aqueous Solutions

Простой, недорогой, и надежная система для измерения объема водорода, выделяемого при химических реакциях с водными растворами

There is a growing research interest in the development of portable systems which can deliver hydrogen on-demand to proton exchange membrane (PEM) ...

Measurements of Long-range Electronic Correlations During Femtosecond Diffraction Experiments Performed on Nanocrystals of Buckminsterfullerene

Измерения на большие расстояния электронной корреляции во время Фемтосекундный дифракции эксперименты, проведенные на нанокристаллов Бакминстерфуллерен

The precise details of the interaction of intense X-ray pulses with matter are a topic of intense interest to researchers attempting to interpret the ...

Time-resolved Photophysical Characterization of Triplet-harvesting Organic Compounds at an Oxygen-free Environment Using an iCCD Camera

Время решена изучены фотофизические характеристика триплет-сбор органических соединений в бескислородной среде, с использованием iCCD камеры

Here, we present a sensible method of the acquisition and analysis of time-resolved photoluminescence using an ultrafast iCCD camera. This system enables ...

Regioselective O-Glycosylation of Nucleosides via the Temporary 2',3'-Diol Protection by a Boronic Ester for the Synthesis of Disaccharide Nucleosides

Regioselective O-Glycosylation of Nucleosides via the Temporary 2',3'-Diol Protection by a Boronic Ester for the Synthesis of Disaccharide Nucleosides

Региоселективный O- гликозилирования нуклеозидов через временные 2', 3'-диол защиты борных эфира для синтеза нуклеозидов дисахарида

Disaccharide nucleosides, which consist of disaccharide and nucleobase moieties, have been known as a valuable group of natural products having ...

Synthesis and Structure Determination of &#181;-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities

Synthesis and Structure Determination of ÃƒÆ’Ã¢â‚¬Å¡Ãƒâ€šÃ‚Âµ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities

Синтез и определение структуры изомеров PIIIA µ-Conotoxin с различными дисульфида связность

Peptides with a high number of cysteines are usually influenced regarding the three-dimensional structure by their disulfide connectivity. It is thus ...

Automation of a Positron-emission Tomography (PET) Radiotracer Synthesis Protocol for Clinical Production

Automation of a Positron-emission Tomography PET Radiotracer Synthesis Protocol for Clinical Production

Автоматизация протокол синтеза радиоиндикаторных позитронно выбросов томография (ПЭТ) для клинических производства

The development of new positron-emission tomography (PET) tracers is enabling researchers and clinicians to image an increasingly wide array of biological ...

Solid Phase 11C-Methylation, Purification and Formulation for the Production of PET Tracers

Solid Phase 11C-Methylation, Purification and Formulation for the Production of PET Tracers

Твердый этап 11C-метилирование, очищение и формулирование для производства ПЭТ-трассаторов

Routine production of radiotracers used in positron emission tomography (PET) mostly relies on wet chemistry where the radioactive synthon reacts with a ...