Name: luminescence lifetime imaging of o2 with a frequency-domain-based camera system
Uploaded: 2019-12-16T14:00:00
Duration: 8 min 35 s
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Agradecemos a Sofie Lindegaard Jakobsen (Universidad de Copenhague) y Lars Borregaard Pedersen (Universidad de Aarhus) por la asistencia técnica. La financiación de este estudio se obtuvo de una subvención Sapere-Aude Advanced del Fondo Independiente de Investigación de Dinamarca (DFF-1323-00065B; MK), subvenciones de proyectos del Fondo Independiente de Investigación de Dinamarca Ciencias Naturales (DFF-8021-00308B; MK) y Ciencias Técnicas y de Producción (DFF-8022-00301B y DFF-4184-00515B; MK), la Fundación Nacional danesa de Investigación (DNRF136) y la Fundación Poul Due Jensen (KK).

El autor Gerhard Holst es un empleado de PCO AG que fabrica el sistema de cámara utilizado en este artículo. PCO AG contribuyó financieramente a los costos de publicación y acceso abierto de este artículo.

En este protocolo, se cubre todo el flujo de trabajo desde la preparación del optode hasta el análisis de imágenes O2. Siguiendo este protocolo, se pueden obtener imágenes químicas utilizando la nueva cámara de duración de la luminiscencia basada en el dominio de frecuencia. Dependiendo de la aplicación, los optodos planos se pueden fabricar en varios tamaños y espesores de capa de la capa del sensor que van desde pesados optodos planos de 50-100 m de espesor de varias décimas de centímetro cuadrado hasta resbalones de cubierta del microscopio con capas de sensor de <1 m de espesor6,40. El potencial de este método se demostró con una aplicación particular, pero no sólo se limita a la toma deimágenes O 2 en rizoesferas vegetales12,28.
Este método tiene varios beneficios en comparación con los métodos de imagen química basados en intensidad de luminiscencia pura. Las imágenes de por vida luminosa no se ven afectadas, o al menos mucho menos, por la iluminación desigual, el grosor desigual del piso de los pliegues y el blanqueo fotográfico25. Además, este método evita el uso de un tinte de referencia adicional común en la imagen ratiométrica17,37. En comparación con otros sistemas de cámaras basados en la vida útil, como las cámaras de dominio del tiempo cerradas de uso común8,26, el nuevo sistema de cámara y el protocolo presentado aquí pueden ofrecer resultados comparables. En una publicación reciente, se compararon las características analíticas de esos dos sistemas y se encontró que el sistema de cámaras de vida útil de luminiscencia basado en dominios de frecuencia es al menos comparable al predecesor de sintibronse basado en el dominio del tiempo8.
Hemos presentado el optode O2 más simple que consiste únicamente en un indicador en una matriz de polímeros. Además de múltiples otros posiblesindicadores O2 que podrían ser utilizados aditivos pueden incluirse, es decir, agentes de dispersión como TiO2 o polvo de diamante2 para aumentar la señal del sensor mientras se reduce la transparencia del optode. También se pueden utilizar destidados adicionales para mejorar la intensidad de la señal a través de la transferencia de energía41.
Para la fabricación de optode plano, se recomienda utilizar un hueco en el dispositivo de recubrimiento de cuchillas de 75 - 120 m para producir un espesor final de la capa del sensor de alrededor de 7,5 a 12 m después de la evaporación del disolvente (alrededor del 10% de la brecha utilizada), cuando se utiliza la composición de cóctel del sensor descrita. Este es un buen compromiso entre la intensidad de la señal, que se puede modificar mediante una mayor carga de tinte, o mediante la elección de tintes de indicador y referencia de mayor brillo, y el tiempo de respuesta. Un aumento en el espesor de la capa se traduce en un aumento en el tiempo de respuesta, ya que el intervalo de tiempo necesario para que el analito alcance un equilibrio termodinámico en la capa de sensibilidad con el medio circundante aumenta12.
Los optodes, como se describe aquí, reaccionan a los cambios en la concentración de O2 en pocos segundos17 mientras siguen teniendo una señal de luminiscencia suficientemente fuerte. Los recubrimientos de sensores ultradelgados con tiempos de respuesta de menos de un segundo se pueden realizar con recubrimiento de espín6. Si el soporte o el dispositivo de recubrimiento de cuchillo sin limpiar bien, podría dar lugar a capas de sensores no homogéneas. Además, cuando el cóctel no es completamente homogéneo o se aplica demasiado rápido después de extenderse delante del dispositivo de recubrimiento tal resultado no deseado se puede observar. Por lo tanto, es posible que necesite algo de práctica para preparar optodes óptimos.
El método se puede utilizar para tomar imágenes de muestras que se pueden poner en contacto con el optode, como ciertos animales marinos42, biopelículas6 y suelos31 sólo para nombrar unos pocos. Presentamos una configuración independiente utilizando un objetivo, sin embargo, la cámara se puede acoplar fácilmente a un microscopio para imágenes químicas de mayor resolución43.
Mientras que la imagen de vida útil de luminiscencia basada en dominio de tiempo permitió la supresión de la fluorescencia en segundo plano26,esto es un problema cuando se utiliza el nuevo sistema de cámara basado en dominio de frecuencia8. Debido a la adquisición continua de imágenes, esta cámara grabará cualquier fluorescencia de fondo de la muestra que pueda ser excitada por el LED seleccionado y emita en la ventana espectral seleccionada según lo definido por el filtro de emisión en el objetivo de la cámara. Esto resultará en una vida aparentemente más baja y, por lo tanto, en lecturas falsas. En caso de trabajar con muestras con una fluorescencia intrínseca significativa superpuesta con la excitación y emisión del sensor O2, es esencial aplicar un aislamiento óptico adicional en la parte superior del optode, recubriendo una capa adicional que contenga negro de carbono2,17. Por lo tanto, sólo la luminiscencia emitida por el optode plano llegará a la cámara. Con el fin de comprobar la luminiscencia de fondo, se puede tomar una imagen sin el optode, que luego mostraría exclusivamente luminiscencia intrínseca de la muestra. También es posible añadir agentes de dispersión como TiO2 o polvo de diamante2,44, al cóctel sensor, para aumentar la intensidad de la luminiscencia del tinte indicador. Sin embargo, esto también puede conducir a un blanqueo fotográfico más rápido y TiO2 es un fotocatalizador conocido, que puede afectar a la fotoestabilidad de un tinte41. Otro aspecto a tener en cuenta es la luz de fondo. Cuando la duración de la luminiscencia de la imagen, la luz de fondo debe evitarse de la manera más eficiente posible. Por lo tanto, este método de imagen requiere que la configuración se coloque en un entorno oscuro y cualquier fuente de luz externa debe desactivarse temporalmente durante la adquisición de la imagen.
En resumen, la imagen de por vida de luminiscencia es un método de imagen química robusto que se puede adaptar a muchas aplicaciones diferentes. Este protocolo (ver sección 1 - 5) cubre todos los pasos esenciales para generar una imagen O2 y utiliza el sistema de imágenes de vida útil de luminiscencia de dominio de frecuencia más flexible actualmente, que puede reemplazar la cámara de dominio del tiempo cerrada descontinuada para imágenes 2D O2 con optodos planos.

La distribución y dinámica de gases e iones disueltos en sedimentos y suelos proporcionan información clave sobre procesos biogeoquímicos como la respiración microbiana1,2, o la pérdida radial de oxígeno de las raíces de las plantas3,4,5, y el microambiente químico de microbios6,7, rizosferas vegetales5,8,9 y madrigueras animales10, 11,12. La actividad biológica y química en estos entornos limitados por difusión puede crear pendientes pronunciadas de sustratos químicos o productos de procesos biogeoquímicos. En particular, la disponibilidad de O2 tiene un gran impacto en los procesos biogeoquímicos y, por lo tanto, en la biología y ecología de un sistema13. Por lo tanto, el análisis de las concentraciones de O2 a alta resolución espacial y temporal es de suma importancia en las ciencias acuáticas y terrestres. En primer lugar, se desarrollaron microsensores electroquímicos y ópticos14,15 para medir este importante analito. Más tarde, se introdujeron imágenes en 2 dimensiones (2D) de O2 con optodes planos12,16,17,18,19, lo que permitió la visualización y cuantificación de la distribución heterogénea De2 en suelos y sedimentos.
Los optodos Planar O2 consisten en un indicador deo2sensible dye20,que se disuelve en un polímero adecuado21. El tinte indicador se excita en longitudes de onda ópticas específicas y emite luz de desplazamiento rojo tras la relajación en forma de luminiscencia. En presencia de O2,el tinte indicador excitado puede transferir su energía a la molécula O2 tras la colisión, que se conoce como enfriamiento de luminiscencia basado en colisión22. Por lo tanto, la intensidad de la luminiscencia, así como la vida útil de la luminiscencia se reducen con el aumento de la concentración de O2 2 23. En un caso ideal, el cambio de intensidad y de vida útil sigue la ecuación Stern-Volmer (ecuación 1) utilizando la intensidad de luminiscencia o la vida útil en ausencia (I0;0) o la presencia (I, ) de O2 a una concentración dada [Q]. La constante Stern-Volmer (Ksv) es una medida para la sensibilidad del optode hacia O2; KSV depende de variables ambientales como la temperatura y la presión.
(1)<img align="center" src="/files/ftp_upload/60191/60191eq1.jpg">
La grabación de estos cambios en la luminiscencia sobre una lámina plana del sensor con un sistema de cámara se puede utilizar para visualizar los cambios correspondientes en la distribución de O2. Inicialmente, se utilizaron imágenes O2 simples basadas en la intensidad de luminiscencia18. Sin embargo, esta metodología es muy sensible a las interferencias externas, que comprometen la fiabilidad de los resultados debido a la iluminación heterogénea, las fluctuaciones en la fuente de excitación o la cámara, así como la distribución desigual del tinte indicador dentro del optodo plano.
Algunas de estas limitaciones se pueden aliviar mediante el uso de optodos planos para la imagen ratiométrica17,24, donde el tinte indicador sensible O2se inmoviliza en la capa de polímero del optodo plano con un tinte de referencia insensible que emite en un rango espectral diferente al indicador O2. Basándose en imágenes de emisión adquiridas en dos ventanas espectrales, la señal de emisión sensible O2se divide por la señal de referencia, generando una imagen de relación menos propensa a las interferencias mencionadas anteriormente5,17. El método requiere el uso de un segundo tinte, que idealmente puede ser excitado por la misma fuente de excitación, pero emite a una longitud de onda diferente (sin superposición espectral significativa), en otra ventana espectral de la cámara (por ejemplo, en otro canal de color de una cámara RGB).
Alternativamente, la imagen O2 puede basarse en la cuantificación del cambio dependiente de O2en la vida útil de la luminiscencia del tinte indicador, que no se ve afectado por la iluminación desigual o las heterogeneidades en la concentración del indicador25. Los primeros sistemas de imágenes O2 basados en la duración de la luminiscencia se basaron en mediciones de dominio del tiempo con un sistema de cámara de dispositivo acoplado cargado (CCD)26,donde se utiliza una fuente de excitación pulsada y las imágenes de luminiscencia se toman sobre intervalos de tiempo definidos dentro de la excitación o emisión del indicador8,23,27. A partir de estas imágenes, la vida útil de la luminiscencia se puede determinar y correlacionar con la concentración correspondiente de O2 en una calibración. Posteriormente, las imágenes de vida útil de la luminiscencia de una muestra determinada presionada contra el optode plano se pueden convertir en imágenes de la distribución 2D correspondiente de la concentración de O2. Este sistema se ha utilizado en muchas aplicaciones tanto en el laboratorio como in situ16,28,pero la cámara CCD esencial capaz de compuerta ya no está disponible comercialmente.
Recientemente, se lanzó un sistema de cámara de vida de iluminación luminiscencia diferente, que adquiere imágenes en el dominio de frecuencia8. El sistema se basa en una fuente de luz modulada continuamente para la excitación. Esto puede ser una onda sinusoidal o cuadrada en lugar de una excitación pulsada, que se utiliza para la adquisición de imágenes en el dominio del tiempo. Esta modulación da como resultado una emisión de luminiscencia modulada del tinte indicador O2, que se desplaza por fases por un ángulo, , que depende de la vida útil de la luminiscencia del tinte indicador (véase la ecuación 2).
(2)<img align="center" src="/files/ftp_upload/60191/60191eq2.jpg">
El cambio entre la excitación y la amplitud de emisión (es decir, el denominado índice o profundidad de modulación (amplitud dividida por la parte de luminiscencia constante)) también depende de la vida útil de la luminiscencia. Por lo tanto, mediante el establecimiento de una frecuencia de modulación conocida, el sensor de imagen CMOS especial dentro de la cámara es capaz de medir la vida útil de la luminiscencia en el rango ns a s como se describe en detalle en otros lugares 8,29,30. Se puede encontrar una guía general sobre el principio de funcionamiento (utilizando el siguiente enlace <a href="https://www.youtube.com/watch?v=xPAB_eVWOr8" target="_blank">https://www.youtube.com/watch?v=xPAB_eVWOr8</a>).
En el siguiente protocolo, demostramos el uso del novedoso sistema de cámaras para la toma de imágenes de la distribución de la concentración de O2 alrededor de las raíces de la planta de agua dulce acuática Littorella uniflora en 2D9,31. Nos gustaría hacer hincapié en que este método no se limita de ninguna manera a esta aplicación. Los optodos sensibles al oxígeno o las partículas desensores 27 en combinación con diversos métodos de imagen se han utilizado en la investigación médica32,en la bioimpresión33,para pinturas sensibles a la presión34,35,o para estudiar sistemas fotosintéticos2,36,37, sólo para nombrar algunos otros campos de aplicación.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Air pump with air stone and water pump</td>
			<td>Local aquarium store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>67-66-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC4 silicone compound</td>
			<td>Dow Corning GmbH</td>
			<td>2793695</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas mixer</td>
			<td>V&#246;gtlin Instruments GmbH</td>
			<td>red-y compact meter GCM</td>
			<td>This is just one possible instrument. Several companies offer gas mixing devices</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass plates and aquaria</td>
			<td>Local aquarium or hardware store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Freely available imaging software (imagej.nih.gov/ij/index.html)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knife-coating device</td>
			<td> 
			 
			BYK-GARDNER GMBH byk.com</td>
			<td>2021</td>
			<td>This is a four sided film applicator enabling easy variation of the film thickness. Other versions are also available. We recommend a thickness of the applied film between 75-120 &#181;m, which yields a final sensor layer thickness of ~10% of the applied thickness before solvent evaporation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED lamp, Reflector PAR38</td>
			<td>Megaman</td>
			<td>MM17572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED LEDHUB</td>
			<td>Omicon Laserage, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Can be configured with a variety of LEDs. For the presented example, the green LED (528 nm) is essential</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LOCTITE AA 3494</td>
			<td>Henkel AG &#38; Co. KGaA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Acrylic-based instant adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements AR Software</td>
			<td>Nikon Inc</td>
			<td></td>
			<td>Software package used for image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pco.flim</td>
			<td>PCO AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Frequency domain based luminescence lifetime camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>platinum(II)-5,10,15,20-tetrakis-(2,3,4,5,6-pentafluorphenyl)-porphyrin (PtTFPP)</td>
			<td>Frontier Scientific</td>
			<td>PtT975</td>
			<td>O2 indicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene terephthalate (PET) foil</td>
			<td>Goodfellow</td>
			<td>320-992-72</td>
			<td>Such foils might also be found from other providers and serve as solid support</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene (PS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9003-53-6</td>
			<td>Polymer matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schott RG610 filter</td>
			<td>www.uviroptics.com</td>
			<td></td>
			<td>Here 52mm screw on Filters can obtained. Other sources offer square glass filters from Schott glass that can be fixed in front of the objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl electrical tape</td>
			<td>Scotch, Super 33+</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Makro Planar 2/100 with Hama C for Nikon adaptor</td>
			<td>delivered with the camera</td>
			<td></td>
			<td>Here any other objective might also be used in combination with an adaptor if the objective does not have a C-mount</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

luminescence lifetime imaging of o2 with a frequency-domain-based camera system

Describimos un método para la imagen de oxígeno disuelto (O2), en 2D a alta resolución espacial (< 50-100 m) y temporal (< 10 s). El método emplea láminas de sensor luminiscentes sensibles O2 (optodos planos) en combinación con un sistema de cámara especializado para la vida útil de la luminiscencia de imágenes en el dominio de frecuencia. Los optodos planos se preparan disolviendo el tinte indicador sensible O2en un polímero y extendiendo la mezcla sobre un soporte sólido en un espesor definido a través del recubrimiento de cuchillo. Después de la evaporación del disolvente, el optode plano se pone en estrecho contacto con la muestra de interés - aquí demostrado con las raíces de la planta acuática Littorella uniflora. El cambio dependiente de la concentración O2 en la vida útil de la luminiscencia del tinte indicador dentro del optode plano se toma una imagen a través de la parte posterior de la lámina portadora transparente y la pared del acuario utilizando una cámara especial. Esta cámara mide la vida útil de la luminiscencia a través de un cambio en el ángulo de fase entre una señal de excitación modulada y la señal de emisión. Este método es superior a los métodos de imagen de intensidad de luminiscencia, ya que la señal es independiente de la concentración o intensidad del tinte de la fuente de excitación, y se basa únicamente en el tiempo de decaimiento de la luminiscencia, que es un parámetro referenciado intrínsecamente. Por consiguiente, no se necesita un tinte de referencia adicional u otros medios de referencia. Demostramos el uso del sistema para la toma de imágenes macroscópicas O2 de rizoesferas vegetales, pero el sistema de cámara también se puede acoplar fácilmente a un microscopio.

Como ejemplo de aplicación para el nuevo sistema de imágenes, mostramos imágenes 2D O2 de una muestra biológica compleja (es decir, la rizoesfera de la planta acuática Littorella uniflora).
En primer lugar, el método describe la fabricación de una película de sensor plano, un llamado optode plano. Como se ve en la Figura 1,tal optode está hecho de una capa delgada de un indicador óptico en una matriz de polímero que se extiende sobre un soporte transparente. Siguiendo el protocolo descrito, se obtiene una película de sensor homogénea con un espesor uniforme, tal como se define por la separación del dispositivo de recubrimiento de cuchillo. Si el optode producido tiene una distribución irregular del material del sensor (por ejemplo, agujeros en el recubrimiento, muestra rayas o agregados de tinte (esto se puede evaluar visualmente y visualmente con la ayuda de una lámpara UV) ), el protocolo debe repetirse y todos los materiales deben limpiarse a fondo con acetona.
Una vez preparado el optode plano, la muestra se puede poner en contacto con la capa de sensación del optode plano, como se muestra aquí con el optode plano integrado en una cámara de rhizo-sandwich, donde las raíces de una planta dentro de una matriz sedimentaria circundante se pueden colocar en estrecho contacto con el optode plano(Figura 2). Si se prepara correctamente, la cámara de rizo-sandwich debe ser fácilmente movible de un acuario (incubación) al otro (medida). Si no se construye correctamente, la cámara de rizo-sandwich puede ser inestable, perder sedimentos o contener burbujas de aire. Por lo tanto, se recomienda el examen visual de la cámara rizo-sandwich directamente después del montaje.
El protocolo dado permite la toma de imágenes de duración de la luminiscencia basada en dominio de frecuencia de la muestra en contacto con el optode plano mediante la cámara de vida útil de luminiscencia basada en dominio de frecuencia. En las publicaciones recientes8,29se ofrecen más detalles sobre este sistema de cámaras, como el modo de adquisición de imágenes y las características científicas complementarias de la cámara de óxido metálico(SCMOS).
La configuración en sí es bastante simple y sólo incluye la cámara que controla una fuente de luz (en este caso, una fuente de excitación LED) y la muestra con el optode(Figura 3). Asegúrese de que todas las piezas estén correctamente conectadas y de que la muestra esté iluminada de forma homogénea. Es necesario evitar la luz de fondo mientras se preforman las mediciones.
Antes de tomar imágenes de la muestra, el optode debe calibrarse. Como se ve en la Figura 4A, la vida útil de la luminiscencia medida disminuye con el aumento de la concentración de O2 después de una decadencia casi exponencial. Esta relación también se puede describir mediante el modelo simplificado de dos sitios(Figura 4B y ecuación 3). En el ejemplo dado, los parámetros necesarios para calcular posteriormente la concentración de O2 fueron los siguientes; á0 a 56,26 s, Ksv a 0,032 hPa-1 y f a 0,86.
Realizar una calibración también es una manera ideal de probar que el sistema funciona correctamente. Si todos los componentes se instalan como se describe aquí (o dentro de las directrices de los fabricantes), la vida útil medida debe mostrar la misma dependencia de O2 como se ve en la Figura 4. Además, para la misma combinación de materiales de sensor O2 (polímero y tinte), el medida0 debe estar en el mismo rango (a unos pocos s) que se mide aquí (principalmente influenciado por la temperatura experimental). Si no puede obtener una curva de calibración similar, asegúrese de que todos los pasos se han seguido correctamente. A veces el optode se fija accidentalmente con el lado sensible frente a la pared de vidrio en lugar de la muestra, o las imágenes adquiridas están sobreexpuestas o subexpuestas.
Con los parámetros de calibración, es posible determinar la concentración de O2 mediante la toma de imágenes de la vida útil de la luminiscencia. Esto se demuestra en la Figura 5A,B, donde la distribución de la concentración de O2 en la rizoesfera de Littorella uniflora se imaginó en la oscuridad y después de la exposición a la luz a 500 fotones de molm m-2 s-1 para 12 h, respectivamente. Debido a la actividad fotosintética de la planta, la concentración de O2 en la rizoesfera aumentó después de la exposición a la luz. Además de las imágenes de por vida, también se pueden obtener imágenes "estructurales" bajo iluminación externa, manteniendo la geometría de imagen fija. De este modo, las imágenes de O2 se pueden correlacionar con precisión con la imagen estructural(Figura 5C),secciones transversales o regiones de interés. Por ejemplo, los perfiles de concentración de O2 a través de una sola raíz se extrajeron de la imagen adquirida en oscuridad y luz, respectivamente(Figura 5D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60191/60191fig1a.jpg"> Figura 1: Fabricación de un optodo plano O2. (A) Se fija una lámina PET en una placa de vidrio y el dispositivo de recubrimiento de cuchillo se coloca en la lámina. (B) El cóctel del sensor preparado se extiende sobre la lámina PET como una línea delgada delante del dispositivo de recubrimiento de cuchillo. (C) El dispositivo de recubrimiento de cuchillo se mueve hacia abajo para extender el cóctel del sensor como una película delgada en la lámina PET, que después de la evaporación del disolvente resulta en un optode plano listo para usar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60191/60191fig1alarge.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60191/60191fig2a.jpg"> Figura 2: Montaje de cámara Rhizo-sandwich con integración de un optode O2 plano. (A) El optode se fija en una de las placas de vidrio utilizando una película de agua. (B) El optode se pega a la placa con cinta eléctrica. (C) El sedimento se rellena en la placa opuesta con los espaciadores conectados (es decir, portaobjetos de microscopio). (D) Las raíces de las plantas se colocan en el sedimento uniformemente extendido. (E) La cámara de rizo-sandwich está cerrada y fijada temporalmente con abrazaderas. (F) Cámara de rizo-sandwich totalmente cerrada y montada. (G) Para proteger el optode de la exposición a la luz por la lámpara de incubación y para evitar el crecimiento de algas se coloca una cubierta de plástico sobre la cámara de rizo-sandwich montada. (H) La cámara rizo-sandwich incubada en un acuario. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60191/60191fig2alarge.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60191/60191fig3a.jpg"> Figura 3: Configuración de imágenes que contiene la cámara de vida de la luminiscencia basada en el dominio de frecuencia, con el objetivo centrado en la muestra con el optode desde atrás a través del acuario transparente y las paredes de la cámara de rizo-sandwich. La guía de luz de la fuente de excitación LED se coloca para iluminar la muestra uniformemente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60191/60191fig3alarge.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60191/60191fig4a.jpg"> Figura 4: Curvas de calibración para optode planar O2. (A) Diferentes vidas de fosforescencia medidas en las respectivas concentraciones de O2 en la cámara de calibración llena de agua. (B) Gráfica Stern-Volmer de los datos de calibración ajustados utilizando el modelo simplificado de dos sitios para el enfriamiento dinámico de colisiones (ecuación 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60191/60191fig4alarge.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60191/60191fig5a.jpg"> Figura 5: Imagen de por vida de la distribución O2 en la rizoesfera de la planta acuática Littorella uniflora. (A) O2 distribución después de mantener la planta bajo luz durante 12 h a aproximadamente 500 mmol fotones m-2 s-1. (B) O2 distribución después de mantener la planta en tinieblas durante 1 h. (C) Imagen estructural de las raíces de la planta como se ve a través del optode plano. (D) Perfil de concentración O2 transversal (la ubicación se indica mediante la línea amarilla en el panel A y B) después de 12 h de luz (rojo) y 1 h en oscuridad (negro). Adaptado con el permiso de (Koren, K., Mo-hammer, M., Scholz, V. V., Borisov, S.M., Holst, G., K-hl, M. Luminescence Lifetime Imaging of Chemical Sensors - A Comparison between Time-Domain and Frequency-Domain Based Camera Systems. Química Analítica. 91 (5), 3233-3238, doi: 10.1021/acs.analchem.8b05869 (2019)). Copyright (2019) American Chemical Society. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60191/60191fig5alarge.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Luminescence Lifetime Imaging of O2 with a Frequency-Domain-Based Camera System

Describimos el uso de una novedosa cámara de duración de luminiscencia de dominio de frecuencia para mapear distribuciones 2D O2 con láminas de sensor óptico. El sistema de cámaras y los procedimientos de análisis de imágenes se describen junto con la preparación, calibración y aplicación de láminas de sensores para visualizar el microambiente O2 en la rizoesfera de plantas acuáticas.

Luminescence Lifetime Imaging of O2 con un sistema de cámara basado en dominio de frecuencia

We describe a method to image dissolved oxygen (O2), in 2D at high spatial (&#60; 50-100 &#181;m) and temporal (&#60; 10 s) resolution. The method employs ...

Como el mejor aceptador de electrones, el oxígeno juega un papel crucial en los sistemas biológicos. Con este protocolo, puede crear imágenes de la distribución de oxígeno en 2D utilizando un optode. Además de su alta resolución espacial y temporal, este método no requiere un tinte de referencia adicional, es extremadamente robusto y permite la adquisición de imagen estructural.Este método se puede aplicar a varias áreas de investigación en las que el oxígeno juega un papel clave, incluyendo la ecología, la investigación médica, la bioimpresión y la impresión sensible a la presión. La fabricación de optode puede ser difícil, ya que la cantidad de cóctel añadido a la lámina de soporte y la velocidad de arrastre del dispositivo de recubrimiento de cuchillo puede requerir optimización y práctica. Con esta aportación de vídeo, queremos que esta poderosa técnica sea accesible a investigadores de otros campos de estudio.Para preparar un optode de oxígeno plano, primero utilice una película de agua o 70%etanol para fijar una lámina PET limpia y libre de polvo en una placa de vidrio limpia. Coloque un dispositivo limpio de recubrimiento de cuchillo de 120 micrómetros en la lámina y utilice una pipeta de vidrio para aplicar una línea de cóctel sensor delante del dispositivo. A continuación, arrastre el dispositivo de recubrimiento del cuchillo lenta y uniformemente sobre la lámina PET para esparcir el cóctel uniformemente.A continuación, seque el optode plano sensible al oxígeno terminado en el aire ambiente durante una hora antes de secarse durante la noche en un armario calentado a 50 a 60 grados centígrados. A la mañana siguiente, se habrá obtenido una capa de aproximadamente 12 micrómetros de espesor. Almacene el optode protegido de la luz hasta su uso posterior.Para preparar una cámara de rizo-sándwich, utilice adhesivo instantáneo a base de acrílico curable ligero para pegar diapositivas de microscopio a lo largo de los bordes de una placa de vidrio dejando un borde largo abierto. Corte el optode plano en la forma y el tamaño requeridos para caber en el espacio entre los portaobjetos del microscopio pegado y coloque el optode en el interior de la placa de vidrio frontal con el lado recubierto hacia arriba. Pegue un borde de la lámina de optode a la placa de vidrio y agregue agua del grifo entre la placa de vidrio y la lámina de optode.Baje lentamente la lámina sobre las gotas de agua permitiendo que el optode se enderece en la superficie de vidrio y utilice un tejido blando para eliminar cuidadosamente las burbujas de aire atrapadas entre el optode y la placa. A continuación, seque la placa de vidrio y pegue los bordes restantes de la lámina en la placa. A continuación, utilice una placa de vidrio plana para distribuir sedimentos de tamiz de 0,5 milímetros uniformemente a través de la placa al mismo grosor que los espaciadores de diapositivas del microscopio.Limpie cuidadosamente la superficie superior de la corredera del microscopio para asegurarse de que la segunda placa de vidrio sella la cámara correctamente y aplique grasa de silicona a la superficie del portaobjetos del microscopio. A continuación, cubra el sedimento con una fina película de agua evitando cuidadosamente la formación de burbujas de aire. Antes de colocar una muestra sobre el sedimento, lave cuidadosamente un solo brote de Litoralella uniflora y coloque el brote en un sedimento con las hojas sobresaliendo desde la parte superior abierta.Cuando la muestra esté en su lugar, coloque la placa de vidrio con el optode sobre el sedimento y aplique una presión suave para poner el optode en estrecho contacto con las raíces de la planta y el sedimento circundante. Utilice abrazaderas para sujetar las placas y secar los bordes exteriores con papel tisú. Añadir repetidamente unas gotas de agua a las hojas para mantener la planta hidratada durante todo el montaje del rizo-sándwich y utilizar cinta eléctrica de vinilo para apretar la cámara de rizo-sándwich.A continuación, selle los bordes con arcilla de modelado y cinta eléctrica adicional. Para preparar la toma de imágenes, retire la lámina de recubrimiento de la zona del optode después de la incubación y coloque la cámara de rizo-sándwich con la pared de vidrio con el optode vertical contra la pared del acuario. Utilice un espaciador para presionar la cámara de rizo-sándwich contra la pared.Coloque la cámara de frecuencia de vida luminiscencia basada en dominio equipada con un objetivo delante del acuario y el área de interés. Conecte un filtro de emisión adecuado para obtener imágenes del tinte indicador al objetivo de la cámara y fije la guía de luz en la fuente de excitación LED. A continuación, coloque la guía de modo que ilumine uniformemente la lámina de optode plana que cubre el área de interés.En el software de imágenes, seleccione la cámara y seleccione el LED en el software de control LED. Ajuste la intensidad del LED según sea necesario y marque analógico y sincronice para confirmar que el LED es activado por la lógica transistor-transistor externo. Enfoque manualmente la cámara y ajuste la apertura del objetivo y establezca la fuente de modulación interna, la onda sinusoidal para la forma de onda de salida, el muestreo de fase adicional, las muestras de ocho fases, el orden de fase opuesto, la lectura de A B y la frecuencia de modulación de cinco kilohercios.Ajuste el tiempo de exposición hasta que la lectura de estadísticas de la región de interés para la imagen de intensidad de luminiscencia normalizada esté en el rango de 0,68 a 0,72. A continuación, haga clic en La referencia de captura para iniciar la adquisición de una serie de medición de referencia. Para calibrar el optode, utilice un dispositivo de mezcla de gas para lavar el agua en un acuario de calibración con una mezcla de gas nitrógeno de aire ambiente con una concentración de oxígeno conocida que monitorea la concentración de oxígeno con una sonda externa con un sensor de oxígeno.A continuación, adquiera una serie de imágenes a diferentes concentraciones de oxígeno en la cámara de calibración para obtener un ajuste adecuado de la curva a los datos de calibración adquiridos. Cuando el sistema haya sido calibrado, apague las luces aplicando irradiación a la planta y a todas las demás fuentes de luz y ajuste el tiempo de adquisición en función de la intensidad de la imagen para asegurarse de que la señal no está sobresaturada ni demasiado débil para una buena relación señal-ruido en la determinación de la vida útil. Cuando se hayan adquirido todas las imágenes de la vida útil del oxígeno, vuelva a encender las luces para obtener una imagen estructural y obtener una imagen con una regla en el campo de visión para permitir el escalado posterior de las imágenes adquiridas.Antes de tomar imágenes de la muestra, el optode debe calibrarse. Después de una descomposición cuasi exponencial, la vida útil de la luminiscencia medida disminuye a medida que aumenta la concentración de oxígeno. Esta relación también se puede describir mediante el modelo simplificado de dos sitios.Una vez calibrado el optode, es posible determinar la concentración de oxígeno mediante imágenes de la vida útil de la luminiscencia como se observa en estas imágenes en las que se probó la distribución de la concentración de oxígeno en la rizosfera de Litoella uniflora después de la exposición a la luz a 500 fotones de micromóculas por metro cuadrado por segundo durante 12 horas y después de 12 horas en la oscuridad. Además de las imágenes de por vida, las imágenes estructurales también se pueden adquirir bajo iluminación externa, manteniendo la geometría de imagen fija para permitir que las imágenes de oxígeno se correlacionen con precisión con la imagen estructural. Los perfiles de concentración de oxígeno a través de una sola raíz, por ejemplo, se pueden extraer de las imágenes adquiridas en la oscuridad y la luz.Es fundamental tener un buen contacto entre la matriz de muestra y la optoda para evitar artefactos innecesarios. Si tienes dudas, rehace el sándwich. La adquisición instantánea de una imagen de una manera no destructiva permite la supervisión del entorno de oxígeno.El método también podría combinarse con otros optodes para el pH u otros analitos. Asegúrese de realizar la fabricación de optode en una campana de humos, ya que el cóctel del sensor contiene cloroformo. Las optodas planas se pueden utilizar para identificar comunidades microbianas en el sedimento.Y después de la toma de imágenes, el sándwich se puede abrir para tomar muestras de estos puntos calientes para el análisis de la comunidad microbiana.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Luminescence Lifetime Imaging of O2 with a Frequency-Domain-Based Camera System

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Preparación de células adherentes, por Imágenes de fluorescencia de rayos X por Química Fijación

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Investigación

Química

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