Name: luminescence lifetime imaging of o2 with a frequency-domain-based camera system
Uploaded: 2019-12-16T14:00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Luminescence Lifetime Imaging of O2 with a Frequency-Domain-Based Camera System at JoVE.com

Vi tackar Sofie Lindegaard Jakobsen (Köpenhamns universitet) och Lars Borregaard Pedersen (Århus universitet) för teknisk assistans. Finansieringen av denna studie erhölls från en Sapere-aude Advanced Grant från den oberoende forskningsfonden Danmark (DFF-1323-00065B; MK), projektbidrag från den oberoende forskningsfonden Danmark | Naturvetenskap (DFF-8021-00308B; MK) & teknisk-och Produktionsvetenskap (DFF-8022-00301B och DFF-4184-00515B; MK), Danmarks nationella forskningsstiftelse (DNRF136) och Poul Due Jensen Foundation (KK).

1. tillverkning av planar O2 optode
<ol><li>Lös upp 1,5 mg av självlysande O2 Indicator Dye Platinum (II)-5, 10, 15, 20-tetrakis-(2, 3, 4, 5, 6-pentafluorphenyl)-porphyrin (pttfpp) och 100 mg polystyren (PS) i 1 g kloroform för att få den så kallade "sensor cocktail". Obs: cocktail kan förvaras i en sluten, gas-tight glas flaska för ett par timmar i kylskåpet och mörkret tills vidare användning.</li>
	<li>Fäst en ren, dammfri polyetylentereftalat (PET) folie (storlek beroende på ansökan) på en rengjord glasplatta med hjälp av en vatten eller etanol (70%) Film (figur 1a).</li>
	<li>Placera den rengjorda kniv beläggnings anordningen (120 μm) på folien och applicera en linje av sensorn cocktail framför enheten med hjälp av en glaspipett (figur 1B). Dra sedan kniv beläggnings anordningen långsamt och enhetligt över PET-folie för att sprida cocktail jämnt. Anmärkning: alla material och verktyg måste rengöras grundligt och tillverkningen bör ske i en dammfri miljö, såsom en draghuv, flödes bänk eller under en punkt suganordning. För att undvika olikheter i den slutliga sensorn folie, bör stegen efter applicering av sensorn cocktail på folien göras snabbt, eftersom kloroform avdunstar snabbt.</li>
	<li>Torka den färdiga planar O2-känsliga optode i luften för 1 h och sedan över natten i ett värmeskåp vid 50-60 ° c, vilket resulterar i en slutlig skikttjocklek efter lösningsmedels avdunstning av ~ 12 μm. Förvara de producerade optoderna i mörker (t. ex. i ett papperskuvert) tills den används ytterligare (figur 1C). Obs: planar O2 Optoder kan förvaras torrt och i mörker i flera månader till år före användning. En slutlig skikttjocklek som sträcker sig från 1-20 μm har visat sig ge goda resultat, med tillräcklig luminiscens signal och lämpliga svarstider.</li>
</ol>2. Rhizo-Sandwich kammare
<ol><li>Rengör två Glasplattor (24,5 x 14 cm2, tjocklek: 4 mm) med 96% etanol.</li>
	<li>Använd ljus-curable, akryl-baserade Instant lim (se tabell över material) för att limma Mikroskop diabilder (76 x 26 mm2, tjocklek: 1 mm) längs kanterna på den första glasplattan (dvs, den bakre kammaren sidan), samtidigt som en lång kant öppen. Använd en glasscutter för att förkorta Mikroskop diabilder vid behov. Varning: skär glaset kan orsaka vassa kanter och ska hanteras varsamt. Obs: mikroskopet glider fungerar som distantar mellan fram och bak, och beroende på tjockleken på rötterna och anläggningens storlek, kan flera skikt av Mikroskop diabilder limmas ovanpå varandra.</li>
	<li>Skär planar optode i önskad form och storlek för att passa in i utrymmet mellan limmade Mikroskop diabilder. Placera den på insidan av den främre glasplattan med den belagda sidan uppåt, för att tillåta kontakt med urvalet av intresse när den trycks mot den.</li>
	<li>Tejpa ena kanten av optode folie till glasplattan och tillsätt några droppar kranvatten i mellan glasplattan och optode folie (figur 2a). Sakta sänka folien på dessa vattendroppar gör det möjligt att räta ut sig på glasytan.</li>
	<li>Ta försiktigt bort luftbubblor fångade i-mellan planar optode och glasplattan med hjälp av en mjuk vävnad, samtidigt som man undviker repor på sensorn beläggningen. Torka av glasplattan torrt och tejpa resterande kanter på optodfolien till glasplattan (figur 2B). Obs: ett band med lämplig vidhäftning under vatten ska väljas.</li>
	<li>Sålla sedimentet med en maskstorlek på 0,5 mm. Placera en sked våt sediment på den första glasplattan (figur 2C). Anmärkning: maskstorleken får inte vara större än halva distans tjockleken.</li>
	<li>Fördela sedimenten jämnt och justera den till samma tjocklek som mikroskopets glid distaner med en platt glasplatta. Rengör mikroskopets övre yta omsorgsfullt så att den andra glasplattan tätar kammaren ordentligt.</li>
	<li>Applicera kisel fett på mikroskopet glidyta. Täck sedimentet med en tunn vattenfilm, samtidigt som du försiktigt undviker bildandet av luftbubblor.</li>
	<li>Tvätta försiktigt ett enda skott av Littorella uniflora och placera det på sedimentet, med växten lämnar sticker ut från den övre öppna sidan (figur 2D).</li>
	<li>Placera den andra glasplattan, med optode fäst vid den, på sedimentet och applicera mjukt tryck för att få optode i nära kontakt med växternas rötter och omgivande sediment. Observera: luftbubblor fångade i sedimentet kan avlägsnas genom att luta glasplattorna samtidigt föra dem samman.</li>
	<li>Fäst glasplattorna tillsammans med klämmor (figur 2E). Torka ytterkanterna med mjukpapper. Håll bladen återfuktade genom hela monteringen av Rhizo-Sandwich (t. ex. genom täta tillägg av några droppar vatten).</li>
	<li>Dra åt Rhizo-Sandwich kammaren med hjälp av vinyl eltejp. Täta kanterna med modellering lera och dessutom tejpa dem med vinyl eltejp (figur 2F). Anmärkning: om det finns många luftbubblor i sedimentet, eller sediment korn mellan spacer Mikroskop diabilder och den andra glasplattan, bör kammaren återmonteras som porvatten kan läcka ut (Upprepa steg 2,4-2,8).</li>
	<li>Använd en ogenomskinlig plast för att täcka Rhizo-Sandwich, men lämna en slits i folien för plantan bladen att sticka ut. Skär ett fönster i plastfolie, så det kan öppnas för experiment genom att utspelas. Stäng fönstret under acklimatiseringstider med hjälp av gummiband (figur 2G) för att skydda optode från foto blekning medan anläggningen inkuberas. Obs: som algtillväxt kan potentiellt störa O2 koncentrationer mätt, rekommenderar vi att försöka minimera det, genom att använda filtrerat vatten, pre-rengöras experimentell utrustning och ta bort alger vid bildandet.</li>
</ol>3. Rhizo-Sandwich kammare inkubation
<ol><li>Placera Rhizo-sandwichkammaren i en vattentank (32 x 7 x 28 cm3) i en något lutande läge för att uppmuntra rottillväxt mot planar optode.</li>
	<li>Fyll vattenbehållaren med tillräckligt med vatten för att helt dränera anläggningen bladen.</li>
	<li>Etablera en 14 h ljus, 10 h mörk cykel för acklimatisering av anläggningen med hjälp av en tidsstyrd lampa. Placera en luft-sten eller en vattenpump i tanken för att säkerställa luftning och blandning av vattnet (figur 2H).</li>
</ol>4. Imaging
<ol><li>Installationsprogrammet för Imaging
	<ol>
<li>Ta bort plastfolie som täcker planar optode i Rhizo-Sandwich kammaren. Placera kammaren med glasväggen med optode upprätt mot akvarium väggen. Använd en spacer för att trycka på Rhizo-sandwichkammaren mot akvarieväggen. Obs: den totala tjockleken på akvariet väggen plus Rhizo-Sandwich kammar väggen bör inte bli för tjock, dock, glas tjocklekar för Aquaria väggar för Luminiscens Imaging rekommenderas med > 1 cm, för att minska rumsliga Cross-Talk genom att öka försvagningen av det spridda ljuset. Det är viktigt, att använda samma material för båda glasväggarna (samma eldfasta index), för att minimera ljusspridning på materialet gränssnittet; eftersom detta skulle leda till en suddig bild och12.</li>
		<li>Placera frekvens-domänbaserade luminiscens livstid kamera utrustad med ett mål (se tabell över material) framför akvariet och området av intresse (rötter av vattenlevande växt Littorella uniflora, som är i direkt kontakt med planar optode) (figur 3). Obs: kameran kan placeras på ett labb stativ för att möjliggöra enkel höjdjustering av kameran. Placeringen av Lab Stand bör märkas och hållas fast. Dessutom kan kameran tejpade till labb stativet för att undvika oavsiktlig förflyttning av kameran under experimentet.</li>
		<li>Skruva ett lämpligt avgasrenings filter för avbildning PtTFPP som indikator färg (se tabell över material) på kamerans mål, för att ta bort slutsatser från magnetiseringen källan. Obs: skruv filter är idealiska, men fyrkantiga filter kan också användas med antingen en lämplig adapter, eller genom noggrann tejvning dem till målet.</li>
		<li>Anslut en LED excitation källa (se tabell över material) till modulering och Dark Gate utgången av kameran. Anmärkning: den förstnämnda levererar modulerings signalen för ljuskällan, medan den senare stänger av ljuset under bildavläsning av bildsensorn. Anslut LED excitation källa och kamera till en dator. Bakgrundsljus bör minimeras under bildavläsning, genom att antingen mörklägga hela rummet eller sätta en tät, svart trasa över hela set-up. I det senare fallet är det viktigt att säkerställa tillräcklig ventilation för att undvika uppvärmning av kameran.</li>
		<li>Fäst ljusledaren i LED excitation källa och placera den för att jämnt belysa planar optode folie som täcker området av intresse. Anmärkning: i den använda LED excitation källa är det möjligt att växla mellan 3 olika lysdioder (460 Nm, 528 nm, 625 nm), vars intensitet kan justeras via styr programvaran.</li>
	</ol></li>
	<li>Inställningar och kamera drift Anmärkning: för de beskrivna experimenten använde vi en frekvens-domänbaserad livstids kamera i kombination med en dedikerad modul för livstids avbildning i ett kommersiellt tillgängligt programpaket (se tabell över material).<ol>
<li>Välj kameran i den valda programvaran före användning. Obs: programvaran och kamerans drivrutiner måste installeras före avbildning enligt tillverkarens riktlinjer.</li>
		<li>Öppna LED-kontrollprogramvaran (installeras igen innan experimentet påbörjas) och välj lämplig lysdiod (här: 528 nm) genom att kryssa av standby. Ställ in LYSDIODSINTENSITETEN efter behov (här till 30%). Se till att lysdioden utlöses av den externa TTL; Detta görs genom att markera analog och synk för lysdioden. Obs: LED-intensitet måste justeras individuellt, eftersom alltför hög lasereffekt kan leda till accelererad foto blekning av indikatorn eller referens färgämne.</li>
		<li>Fokusera kameran och justera bländaren för målet manuellt (i den nuvarande studien används f = 2,8). Obs: det är viktigt att fokusera kameran på planar optode och inte på akvariet glaset; Detta kan säkerställas genom att ta en bild med en linjal för skala, och fokusera på skuggan av linjalen på optode, snarare än på den faktiska linjalen.</li>
		<li>Ställ in följande parametrar i kamerans kontrollpanel: intern modulerings källa; sinuskurva för den utgående vågform; ytterligare fas provtagning (Ja); 8 fas prov, fas ordning motsatt, tryck på A + B avläsning; 5 kHz modulerings frekvens. Obs: dessa parametrar påverkar bildkvaliteten och kan ändras om det behövs. Tillverkaren av kameran ger riktlinjer om de enskilda parametrarna (kameratillverkaren släpper riktlinjer och uppdateringar när programvaran uppdateras).</li>
		<li>Ta en referensbild före experiment. Obs: Detta kan göras antingen genom att avbilda en kalibrerings standard (en självlysande färgämne med en känd livstid (NS eller μs)), eller genom att använda det reflekterade ljuset från lysdioden. I det senare fallet måste utsläpps lång pass filtret avlägsnas från målet och den kända livstiden kan ställas in på 1 ns.</li>
		<li>Justera exponeringstiden i kalibrerings delen av den dedikerade avbildningsprogram varan tills ROI- statistiken avläsning (längst ned i den här panelen) för den normaliserade luminiscens-intensiteten är i intervallet 0,68-0,72. Obs: nu anges referens livstiden (t. ex. 1 NS) som indata till programvaran.</li>
		<li>Tryck på Capture Reference för att påbörja förvärvet av en referens Mät serie. Obs: när du är klar, referensdata lagras och antingen enstaka eller tidsfördröjning mätningar kan göras på prover.</li>
	</ol></li>
	<li>Kalibrering av O2 optode
	<ol>
<li>Placera en bit av en planar O2-Sensitive optode i ett (litet) glas akvarium. Fäst planar optode på glasväggen i kalibrerings kammaren enligt beskrivningen ovan (se avsnitt 2,3). Placera kalibrerings akvariet framför kameran. Säkerställ jämn belysning av lysdioden, samt att optode fyller hela synfältet. Obs: planar optode bör vara från samma bit folie eller tillverkad av samma sensor cocktail som folien används i själva experimentet.</li>
		<li>Fyll akvariet med samma flytande medium som används i experimenten. Anmärkning: användning av olika medier för kalibreringar och experiment kan påverka mätningen (t. ex. genom att ändra sensorns respons och/eller O2 löslighet). Därför bör kalibrering göras i samma medium, och vid samma temperatur som det faktiska experimentet. Temperaturvariationer kommer att påverka Luminescens signal och bör undvikas. Men om temperaturen inte kan hållas stabil, måste Temperaturkompensering göras genom att kalibrera O2-känsliga optode (flera punkter) vid olika (relevanta) temperaturer och efterföljande omräkning av värdena.</li>
		<li>Justera O2 koncentrationen i kalibrerings akvariet genom att spola vattnet med en luft/N2 gasblandning av känd O2 koncentration, med hjälp av en gas-blandningsenhet. Se till att vattnet är väl skakad med den använda gas-blandningen genom luftning under en tillräckligt tid (beror på flödet och storleken på akvariet). Obs: Vi rekommenderar att du övervakar O2 -nivån i kalibrerings akvariet med en extern, kalibrerad o2 -sensor med Temperaturkompensering (t. ex. med en fiberoptik eller elektrokemisk O2 -sensor).</li>
		<li>Ta en serie bilder vid olika O2 -koncentrationer i kalibrerings kammaren. Anmärkning: minst fem olika O2 -koncentrationer bör mätas för att möjliggöra en lämplig kurva som passar de förvärvade kalibreringsdata. Det är viktigt att mäta vid 0 hPa (anoxic villkor), och sedan fördela de andra värdena över det dynamiska omfånget av din specifika indikator färg. Här har vi använt pttfpp som O2-Sensitive indikator färg immobiliserade i en polystyren matris. Bilder togs vid 0, 48, 102, 156 och 207 hPa; 207 hPa motsvarar 100% luftmättnad vid given salthalt och tryck.</li>
	</ol></li>
	<li>Avbildning av provet
	<ol>
<li>Placera provet framför kameran och säkerställ jämn belysning.</li>
		<li>Stäng av ljuset som levererar bestrålning till anläggningen (och alla andra ljuskällor) strax innan förvärva luminiscens livstid bild av anläggningen. Justera förvärvs tiden baserat på intensiteten bilden, se till att signalen är varken övermättad eller för svag för en bra signal till brus (S/N) förhållande i livstid bestämning.</li>
		<li>Utsätt anläggningen för varierande ljusförhållanden (t. ex. ljus/mörker) och få en uppsättning bilder.</li>
		<li>Slå på ljuset i rummet för att få en strukturell bild. Obs: när bakgrundsbelysningen slås på kommer kameran inte att mäta en realistisk livstids bild. Dock visar intensiteten bilden nu hela synfält som ses genom halvtransparent optode.</li>
		<li>Ta en bild med en linjal eller liknande i synfältet för att möjliggöra senare skalning av de förvärvade bilderna.</li>
	</ol></li>
</ol>5. analys av data
<ol><li>Exportera fasens livstid och intensitetsbilder direkt från den dedikerade avbildningsprogram varan med hjälp av makrot som tillhandahålls av kameratillverkaren.</li>
	<li>Utför ytterligare bildanalys med hjälp av en fritt tillgänglig bildanalysprogram vara (se tabell över material).</li>
	<li>Öppna fasens livstids bilder av kalibreringen i bildanalys programmet och Bestäm medelvärdet av hela bilden med hjälp av mätfunktionen. Rita de uppmätta livstider mot de kända O2 -koncentrationerna för att bestämma kalibreringsfunktionen (figur 4A).</li>
	<li>Beräkna τ0/τ från alla data (τ0 är den uppmätta fasens livstid i frånvaro av O2). Rita dessa värden kontra de kända O2 -koncentrationerna (figur 4B).</li>
	<li>Bestäm parametrarna Ksv och f från kalibreringsområdet med hjälp av den förenklade modellen med två modeller för dynamisk kollisionsläckning (ekvation 3)38,39 där [Q] är koncentrationen O2 . Definiera Fit-funktionen i dataanalysprogram varan, som sedan bestämmer Ksv och f.</li>
</ol>3<img align="center" src="/files/ftp_upload/60191/60191eq3.jpg">
<ol start="6"><li>Öppna de förvärvade exempelbilderna i bildanalys programmet för att omvandla de avbildade livstider till O2 -koncentrationer, med hjälp av de fastställda parametrarna Ksv, f och τ0. Anmärkning: som en alternativ metod också den förvärvade kalibreringsfas livstid värden (figur 4A) kan användas direkt. I detta fall används en exponentiell passform med funktionen kurvpassning för kalibrering.</li>
	<li>Öppna bilden med linjalen nästa i bildanalys programmet och Mät ett känt avstånd med mätverktyget. Ange den här mätningen som global skala under Ange skala.</li>
</ol>

Författaren Gerhard Holst är anställd hos PCO AG som tillverkar det kamerasystem som används i denna artikel. PCO AG bidrog finansiellt till publiceringen och Open Access-kostnaderna för denna artikel.

I detta protokoll är hela arbetsflödet från optode förberedelse till O2 bildanalys täckt. Genom att följa detta protokoll, kemiska bilder kan erhållas med hjälp av den nya frekvens-domänbaserade luminiscens livstid kamera. Beroende på ansökan, kan planar Optoder tillverkas i olika storlekar och skikttjockleken på sensorn skikt från robust 50-100 μm tjocka plana Optoder av flera tiondelar av kvadratcentimeter till Mikroskop täcka glider med < 1 μm tjock sensorlager6,40. Potentialen för denna metod visades med en viss applikation, men är inte bara begränsad till O2 avbildning i växtrhizospheres12,28.
Denna metod har flera fördelar jämfört med ren luminiscens intensitetsbaserade kemiska avbildningsmetoder. Luminescence livstid avbildning är inte, eller åtminstone mycket mindre, påverkas av ojämn belysning, ojämn optode tjocklek, och foto blekning25. Denna metod undviker också användning av ytterligare en referens färg som är vanlig i ratiometriska bilder17,37. I jämförelse med andra livstids baserade kamerasystem, såsom vanligt förekommande gated Time-domän kameror8,26, den nya kamerasystem och protokoll som presenteras här kan ge jämförbara resultat. I en nyligen publicerades de analytiska egenskaperna hos dessa två system jämfördes och det konstaterades att frekvens-domänbaserade luminiscens livstid kamerasystem är minst jämförbar med den avvecklade tidsdomänbaserade föregångare8.
Vi har presenterat den enklaste O2 optode som endast består av en indikator i en polymermatris. Förutom flera andra möjliga O2 indikatorer20 som kan användas tillsatser kan inkluderas, dvs spridning agenter såsom tio2 eller diamant pulver2 för att öka sensorn signalen samtidigt minska insynen i optode. Ytterligare färgämnen kan också användas för att öka signalintensiteten via energiöverföring41.
För planar optode Fabrication, rekommenderar vi att använda en lucka i kniv-beläggning enhet av 75-120 μm för att ge en slutlig sensor skikttjockleken på cirka 7,5 till 12 μm efter lösningsmedels avdunstning (ca 10% av den använda klyftan), när du använder den beskrivna sensorn cocktail komposition. Detta är en bra kompromiss mellan signalintensitet, som kan ändras genom högre färgämne lastning, eller genom att välja indikator och referens färgämnen av högre ljusstyrka, och svarstid. En ökning av skikttjockleken resulterar i en ökning av svarstiden, eftersom den tidsperiod som krävs för analyten att nå en termodynamisk jämvikt i Avkännings skiktet med omgivande Media ökar12.
Optoder, som beskrivs här, reagerar på förändringar i O2 koncentrationen inom några sekunder17 medan den fortfarande har en tillräckligt stark luminiscens signal. Ultratunna sensor beläggningar med sub-Second responstid kan realiseras med spinn-Coating6. Om stödet eller kniv beläggnings anordningen inte är väl rengjorda, kan det resultera i inhomogena sensor skikt. Också, när cocktail är inte helt homogen eller appliceras för snabbt efter spridning framför beläggnings anordningen ett sådant oönskat resultat kan observeras. Därför kan det behöva lite övning för att förbereda optimala Optoder.
Metoden kan användas för att avbilda prover som kan sättas i nära kontakt med optode, såsom vissa marina djur42, biofilmer6 och jordar31 bara för att nämna några. Vi presenterar en fristående installation med hjälp av ett mål, men kameran kan enkelt kopplas till ett mikroskop för högre upplösning kemisk avbildning43.
Fördriva tiden-domän baserat luminiscens livstid tänkbar sättet i stånd till undertryckande av bakgrunden fluorescens26, den här er en lämna ut när användande den ny frekvens-domän-baserat kamerasystem8. På grund av det kontinuerliga bild förvärvet kommer denna kamera att spela in alla bakgrundsfluorescens av provet som kan exciteras av den valda lysdioden och avger i det valda spektrala fönstret som definieras av utsläpps filtret på kamerans mål. Detta kommer att resultera i en till synes lägre livstid och följaktligen i felaktiga avläsningar. Om du arbetar med prover med en betydande inneboende fluorescens överlappar med O2 sensor excitation och emission, är det viktigt att tillämpa en extra optisk isolering ovanpå optode, genom att täcka ett ytterligare skikt som innehåller kimrök2,17. Således, endast luminiscens avges från planar optode kommer att nå kameran. För att kontrollera bakgrunden luminiscens en bild utan optode kan tas, som sedan skulle uteslutande Visa inneboende luminiscens av provet. Det är också möjligt att lägga till spridnings agenter som tio2 eller diamantpulver2,44, till sensorn cocktail, för att öka luminiscens intensiteten av indikatorn färgämne. Detta kan dock också leda till snabbare foto blekning och TiO2 är en känd foto-katalysator, som kan försämra foto stabilitet av ett färgämne41. En annan aspekt att tänka på är bakgrundsljus. Vid bild Luminescens livslängd måste bakgrundsbelysningen undvikas så effektivt som möjligt. Därför kräver denna avbildningsmetod att installationen placeras i en mörk miljö och att alla externa ljuskällor måste stängas av tillfälligt under bild anskaffningen.
Sammanfattnings, luminiscens Lifetime Imaging är en robust kemisk avbildning metod som kan anpassas till många olika tillämpningar. Detta protokoll (se avsnitt 1-5) omfattar alla väsentliga steg för att generera en O2 bild och använder den för närvarande mest flexibla frekvens-domän luminiscens Lifetime Imaging system, som kan ersätta den avvecklade gated Time-domän kamera för 2D O2 avbildning med planar optodes.

Distribution och dynamik av lösta gaser och joner i sediment och jordar ger viktig information om biogeokemiska processer såsom mikrobiell andning1,2, eller radiell syre förlust från växternas rötter3,4,5, och den kemiska mikromiljön av mikrober6,7, växtrhizospheres5,8,9 och djurburrows10, 11,12. Biologisk och kemisk aktivitet i sådana diffusions begränsade miljöer kan skapa branta lutningar av kemiska substrat eller produkter av biogeokemiska processer. I synnerhet, O2 tillgängligheten har en enorm inverkan på biogeokemiska processer och därmed biologi och ekologi i ett system13. Därför, analysera O2 koncentrationer vid hög spatial och temporal upplösning är av största vikt i akvatiska och terrestra vetenskaper. För det första utvecklades elektrokemiska och optiska mikrosensorer14,15 för att mäta denna viktiga analyt. Senare introducerades 2 dimensionell (2D) avbildning av o2 med planar Optoder12,16,17,18,19, vilket möjliggjorde visualisering och kvantifiering av den heterogena O2 -fördelningen i jordar och sediment.
Planar O2 Optoder består av en O2-känslig indikator färg20, som löses upp i en lämplig polymer21. Indikatorn färg är upphetsad vid specifika optiska våglängder och avger rödförskjuten ljus vid avslappning i form av luminescence. I närvaro av O2, upphetsad indikator färgämne kan överföra sin energi till O2 molekylen vid kollision, som kallas kollision-baserade luminiscens kylning22. Därför reduceras Luminescens intensitet och Luminescens livstid med ökande O2 koncentration23. I ett idealfall följer förändringen i intensitet och livstid den Stern-Volmer ekvation (ekvation 1) med antingen luminiscens intensitet eller livstid i frånvaro (i0; τ0) eller närvaro (i, τ) av O2 vid en given koncentration [Q]. Den stränga-Volmer konstanten (Ksv) är en mäta för känsligheten av optoden in mot nolla2; Ksv är beroende av miljövariabler som temperatur och tryck.
1<img align="center" src="/files/ftp_upload/60191/60191eq1.jpg">
Inspelning av sådana förändringar i Luminescens över en planar sensor folie med ett kamerasystem kan användas för att visualisera motsvarande förändringar i O2 distribution. Initialt användes enkel Luminescens intensitetsbaserad O2 -avbildning18. En sådan metod är dock mycket känslig för yttre interferenser, som äventyrar tillförlitligheten hos resultaten på grund av heterogen belysning, fluktuationer i exciteringskällan eller kameran, samt ojämn fördelning av indikator färg inom planar optode.
Några av dessa begränsningar kan lindras genom att använda planar Optoder för ratiometriska Imaging17,24, där O2-Sensitive indikator färg är co-immobilized i polymerskiktet av planar optode med en okänslig referens färg som avger i ett annat spektralområde än O2-indikatorn. Baserat på utsläpps bilder förvärvade i två spektrala fönster, den O2-känsliga emissions signal divideras med referens signalen, genererar en förhållande bild som är mindre benägna att de ovan nämnda interferenser5,17. Metoden kräver användning av en andra färg, som helst kan vara upphetsad av samma excitation källa, men avger på en annan våglängd (utan betydande spektrala överlappning), i ett annat spektralfönster av kameran (t. ex. i en annan färgkanal i en RGB-kamera).
Alternativt kan O2 avbildning baseras på att kvantifiera den o2-beroende förändringen i Luminescens livstid för indikator färgen, som inte påverkas av ojämn belysning eller heterogen i indikator koncentrationen25. Första luminiscens Lifetime-baserade O2 Imaging system baserades på tidsdomän mätningar med en grind-able laddade kopplad enhet (CCD) kamerasystem26, där en pulsad excitation källa används och luminiscens bilder tas över definierade tidsintervall inom excitation eller emission av indikatorn8,23,27. Från sådana bilder kan luminiscens-livstiden bestämmas och korreleras till motsvarande O2 -koncentration i en kalibrering. Därefter kan luminiscens livstids bilder för ett givet prov pressas mot planar optode omvandlas till bilder av motsvarande 2D-distribution av O2 koncentration. Detta system har använts i många tillämpningar både i laboratorium och på plats16,28, men den väsentliga porten-kan CCD-kamera är inte längre kommersiellt tillgänglig.
Nyligen släpptes en annan luminiscens livstid kamerasystem, som förvärvar bilder i frekvens-domän8. Systemet förlitar sig på en kontinuerligt modulerad ljuskälla för excitation. Detta kan antingen vara en sinusformad eller fyrkantig våg i stället för en pulsad excitation, som används för bild förvärv i tidsdomänen. Denna modulering resulterar i en modulerad luminiscens emission av O2 -indikatorn färgämne, som är fas förskjuten med en vinkel, φ, som är beroende av luminiscens livslängden för indikatorn färg (τ) (se ekvation 2).
2<img align="center" src="/files/ftp_upload/60191/60191eq2.jpg">
Förändringen mellan excitation och emissions amplitud (dvs. det så kallade modulations indexet eller djupet (amplitud dividerat med konstanten luminiscens del)) är också beroende av luminiscens livstid. Så, genom att ställa in en känd modulerings frekvens den speciella CMOS-bildsensorn inom kameran kan mäta luminiscens livstid i NS till μs intervall som beskrivs i detalj någon annanstans 8,29,30. En allmän vägledning om Funktionsprincipen finns (med hjälp av följande länk <a href="https://www.youtube.com/watch?v=xPAB_eVWOr8" target="_blank">https://www.youtube.com/watch?v=xPAB_eVWOr8</a>).
I följande protokoll visar vi användningen av det nya kamerasystemet för avbildning av distributionen av O2 -koncentrationen kring rötterna till den akvatiska sötvatten växten Littorella uniflora i 2D9,31. Vi vill betona att denna metod inte på något sätt är begränsad till denna ansökan. Syre känsliga Optoder eller sensor partiklar27 i kombination med olika avbildningsmetoder har använts i medicinsk forskning32, i bioprinting33, för tryckkänslig färg34,35, eller att studera fotosyntetiska system2,36,37, bara för att nämna några andra användningsområden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Air pump with air stone and water pump</td>
			<td>Local aquarium store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>67-66-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC4 silicone compound</td>
			<td>Dow Corning GmbH</td>
			<td>2793695</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas mixer</td>
			<td>V&#246;gtlin Instruments GmbH</td>
			<td>red-y compact meter GCM</td>
			<td>This is just one possible instrument. Several companies offer gas mixing devices</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass plates and aquaria</td>
			<td>Local aquarium or hardware store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Freely available imaging software (imagej.nih.gov/ij/index.html)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knife-coating device</td>
			<td> 
			 
			BYK-GARDNER GMBH byk.com</td>
			<td>2021</td>
			<td>This is a four sided film applicator enabling easy variation of the film thickness. Other versions are also available. We recommend a thickness of the applied film between 75-120 &#181;m, which yields a final sensor layer thickness of ~10% of the applied thickness before solvent evaporation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED lamp, Reflector PAR38</td>
			<td>Megaman</td>
			<td>MM17572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED LEDHUB</td>
			<td>Omicon Laserage, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Can be configured with a variety of LEDs. For the presented example, the green LED (528 nm) is essential</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LOCTITE AA 3494</td>
			<td>Henkel AG &#38; Co. KGaA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Acrylic-based instant adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements AR Software</td>
			<td>Nikon Inc</td>
			<td></td>
			<td>Software package used for image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pco.flim</td>
			<td>PCO AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Frequency domain based luminescence lifetime camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>platinum(II)-5,10,15,20-tetrakis-(2,3,4,5,6-pentafluorphenyl)-porphyrin (PtTFPP)</td>
			<td>Frontier Scientific</td>
			<td>PtT975</td>
			<td>O2 indicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene terephthalate (PET) foil</td>
			<td>Goodfellow</td>
			<td>320-992-72</td>
			<td>Such foils might also be found from other providers and serve as solid support</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene (PS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9003-53-6</td>
			<td>Polymer matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schott RG610 filter</td>
			<td>www.uviroptics.com</td>
			<td></td>
			<td>Here 52mm screw on Filters can obtained. Other sources offer square glass filters from Schott glass that can be fixed in front of the objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl electrical tape</td>
			<td>Scotch, Super 33+</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Makro Planar 2/100 with Hama C for Nikon adaptor</td>
			<td>delivered with the camera</td>
			<td></td>
			<td>Here any other objective might also be used in combination with an adaptor if the objective does not have a C-mount</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

luminescence lifetime imaging of o2 with a frequency-domain-based camera system

Vi beskriver en metod för att bilden upplöst syre (O2), i 2D vid hög spatial (< 50-100 μm) och temporal (< 10 s) upplösning. Metoden sysselsätter O2 känsliga självlysande sensor folier (planar optodes) i kombination med ett specialiserat kamerasystem för avbildning luminiscens livstid i frekvens-domän. Planar Optoder bereds genom upplösning av O2-känsliga indikator färg i en polymer och sprider blandningen på ett stabilt stöd i en definierad tjocklek via kniv beläggning. Efter avdunstning av lösningsmedlet, är planar optode placerad i nära kontakt med urvalet av intresse-här demonstreras med rötterna av vattenlevande växt Littorella uniflora. Den O2 koncentrationsberoende förändringen i Luminescens livstid för indikator färgen inom planar optode är avbildad via baksidan av den genomskinliga bärarfolien och akvarium väggen med hjälp av en speciell kamera. Denna kamera mäter luminiscens livstid (μs) via en förskjutning i fasvinkel mellan en modulerad excitation signal och emissions signal. Denna metod är överlägsen luminiscens intensitet Imaging metoder, eftersom signalen är oberoende av färgämnes koncentrationen eller intensiteten i excitation källa, och enbart förlitar sig på luminiscens förfall tid, vilket är en egen refererade parameter. En ytterligare referens färg eller andra metoder för referering behövs därför inte. Vi visar användningen av systemet för makroskopisk O2 avbildning av växtrhizospheres, men kamerasystemet kan också enkelt kopplas till ett mikroskop.

Som ett applikationsexempel för det nya avbildnings systemet, visar vi 2D O2 avbildning av ett komplext biologiskt prov (dvs. den rhizosfären av vattenlevande växten Littorella uniflora).
Först beskriver metoden tillverkningen av en planar sensor film, en så kallad planar optode. Som framgår av figur 1, en sådan optode är gjord av ett tunt skikt av en optisk indikator i en polymer matris som sprids på ett transparent stöd. Genom att följa det beskrivna protokollet erhålls en homogen sensor film med en enhetlig tjocklek, enligt definitionen i gapet på kniv beläggnings anordningen. Om den producerade optode har en ojämn sensor material fördelning (t. ex. hål i beläggningen, visar ränder eller färgämnen aggregat (detta kan utvärderas visuellt, och visuellt med hjälp av en UV-lampa)), måste protokollet upprepas och alla material måste rengöras grundligt med hjälp av aceton.
När planar optode bereds, kan provet bringas i nära kontakt med det Avkännings skikt av planar optode, som visas här med planar optode integreras i en Rhizo-Sandwich kammare, där rötterna av en anläggning i en omgivande sediment matris kan placeras i nära kontakt med planar optode (figur 2). Om förberedd korrekt, bör Rhizo-Sandwich kammaren vara lätt rörliga från ett akvarium (inkubering) till den andra (mätning). Om inte konstruerad på rätt sätt, kan Rhizo-Sandwich kammaren vara instable, förlora sediment eller innehåller luftbubblor. Visuell undersökning av Rhizo-sandwichkammaren direkt efter monteringen rekommenderas därför.
Det givna protokollet möjliggör frekvens-domänbaserad Luminescens livstid avbildning av provet i kontakt med planar optode med hjälp av frekvens-domänbaserade luminiscens livstids kamera. Mer information om detta kamerasystem såsom läget för bild förvärv och vetenskapliga kompletterande metal-oxid-halvledare (sCMOS) kamerans egenskaper ges i de senaste publikationerna8,29.
Själva installationen är ganska enkel och omfattar endast den kamera som styr en ljuskälla (i detta fall, en LED excitation källa) och provet med optode (figur 3). Se till att alla delar är korrekt anslutna och att provet lyser homogent. Bakgrundsbelysningen måste undvikas vid för formning av mätningar.
Innan provet avbildas måste optode kalibreras. Som framgår av figur 4Aminskar den uppmätta Luminescens livstid med ökande koncentration av O2 efter en kvasi-exponentiell nedbrytning. Detta förhållande kan också beskrivas med hjälp av den förenklade tvåplatsmodellen (figur 4B och ekvation 3). I det givna exemplet var de parametrar som behövdes för att därefter beräkna O2 -koncentrationen som följde. τ0 = 56,26 μs, Ksv = 0,032 hPa-1 och f = 0,86.
Att utföra en kalibrering är också ett perfekt sätt att testa att systemet fungerar som det ska. Om alla komponenter installeras enligt beskrivningen här (eller inom tillverkarens riktlinjer) ska den uppmätta livstiden Visa samma O2 -beroende som framgår av figur 4. Dessutom, för samma kombination av O2 Avkännings material (polymer och färgämne), bör den uppmätta τ0 vara i samma område (± några μs) som mäts här (främst påverkad av försöks temperaturen). Om det inte går att få en liknande kalibreringskurva, se till att alla steg följdes korrekt. Ibland optode är oavsiktligt fast med den känsliga sidan vänd mot glasväggen i stället för provet, eller de förvärvade bilderna är över-eller underexponerade.
Med kalibrerings parametrarna är det möjligt att bestämma koncentrationen O2 genom att avbilda Luminescens livstid (τ). Detta visas i figur 5A, B, där fördelningen av O2 -koncentrationen i den rhizosfären av Littorella uniflora var avbildad i mörker och efter ljus exponering för 500 μmol fotoner m-2 s-1 för 12 h, respektive. På grund av anläggningens fotosyntetiska aktivitet ökade O2 -koncentrationen i rhizosfären efter ljus exponering. Förutom livstids bilder kan även "strukturella" bilder förvärvas under extern belysning, samtidigt som bild geometrin hålls fast. På detta sätt kan O2 bilder vara exakt korrelerade till den strukturella bilden (figur 5C), tvärsnitt eller regioner av intresse. Som ett exempel, O2 koncentrations profiler över en enda rot extraherades från den bild som förvärvats i mörker och ljus, respektive (figur 5D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60191/60191fig1a.jpg"> Figur 1: tillverkning av en planar O2 optode. AenPET-folie fixeras på en glasplatta och kniv beläggnings anordningen placeras på folien. (B) den förberedda sensorn cocktail sprids på PET folie som en tunn linje framför kniven-beläggning enhet. (C) kniv beläggnings anordningen flyttas nedåt för att sprida sensor cocktail som en tunn film på PET-folie, som efter lösningsmedels avdunstning resulterar i en klar att använda planar optode. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60191/60191fig1alarge.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60191/60191fig2a.jpg"> Figur 2: Rhizo-Sandwich kammare församling med integration av en planar O2 optode. Aoptode är fixerad på en av glasplattorna med hjälp av en vattenfilm. (B) optode limmas på plattan med eltejp. C) sedimentet fylls i den motsatta plattan med de bifogade distanten (dvs. Mikroskop rutschbanor). Dväxtrötterna placeras på det jämnt utspridda sedimentet. Eden Rhizo-sandwichkammaren är stängd och tillfälligt fixerad med klämmor. (F) helt sluten och monterad Rhizo-Sandwich kammare. (G) för att skydda optode från ljus exponering genom inkubations Lyktan och för att undvika algtillväxt placeras ett plasthölje över den monterade Rhizo-sandwichkammaren. Hden Rhizo-sandwichkammare som inkuberas i ett akvarium. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60191/60191fig2alarge.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60191/60191fig3a.jpg"> Bild 3: bildinställning som innehåller den frekvens-domänbaserade Luminescens livstids kamera, med målet fokuserat på provet med optode bakifrån via det transparenta akvariet och de Rhizo-sandwichkamväggarna. Ljusledaren för LED-magnetiseringen är placerad för att belysa provet jämnt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60191/60191fig3alarge.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60191/60191fig4a.jpg"> Figur 4: kalibreringskurvor för planar O2 optode. A) olika fosforescenslivstider som mäts vid respektive O2 -koncentration i den vattenfyllda kalibrerings kammaren. B) akter-Volmer-området med kalibreringsdata som monterats med hjälp av den förenklade modellen med två modeller för dynamisk kollisionsläckning (ekvation 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60191/60191fig4alarge.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60191/60191fig5a.jpg"> Figur 5: livstids avbildning av O2 -distributionen i den rhizosfären av vattenanläggningen Littorella uniflora. (A) O2 fördelning efter att ha hållit anläggningen under ljus i 12 h vid ca 500 μmol fotoner m-2 s-1. (B) O2 distribution efter att ha hållit anläggningen i mörker för 1 h. (C) strukturell bild av växternas rötter sett genom planar optode. D) koncentrations profil med tvärsnittsarea O2 (platsen indikeras av den gula linjen i panel A och B) efter 12 h i ljus (röd) och 1 h i mörker (svart). Anpassad med tillstånd från (Koren, K., Moßhammer, M., Scholz, V. V., Borisov, SWT, Holst, G., Kühl, M. luminescence livstid avbildning av kemiska sensorer-en jämförelse mellantid-domän och frekvens-domänbaserade kamerasystem. Analytisk kemi. 91 (5), 3233-3238, Doi: 10.1021/ACS. analchem. 8b05869 (2019)). Copyright (2019) amerikanska kemiska föreningen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60191/60191fig5alarge.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Luminescence Lifetime Imaging of O2 with a Frequency-Domain-Based Camera System at JoVE.com

Luminescence Lifetime Imaging of O2 with a Frequency-Domain-Based Camera System

Vi beskriver användningen av en roman, frekvens-domän luminiscens livstid kamera för kartläggning 2D O2 distributioner med optisk sensor folier. Kamerasystem och bildanalys förfaranden beskrivs tillsammans med förberedelse, kalibrering och tillämpning av sensor folier för att visualisera O2 mikromiljö i rhizosfären av vattenväxter.

Luminescence Lifetime Imaging av O2 med ett frekvens-domänbaserat kamera system

We describe a method to image dissolved oxygen (O2), in 2D at high spatial (&#60; 50-100 &#181;m) and temporal (&#60; 10 s) resolution. The method employs ...

Som den bästa elektronreceptorn spelar syre en avgörande roll i biologiska system. Med detta protokoll kan du avbilda syrgasfördelningen i 2D med hjälp av en optod. Förutom sin höga rumsliga och tidsmässiga upplösning, kräver denna metod inte en ytterligare referensfärgämne, är extremt robust, och tillåter förvärv av strukturell bild.Denna metod kan tillämpas på olika forskningsområden där syre spelar en nyckelroll, inklusive ekologi, medicinsk forskning, bioprinting och tryckkänsliga utskrifter. Optoden tillverkning kan vara utmanande eftersom mängden cocktail läggas till stöd folie och kniven beläggning enheten dra hastighet kan kräva optimering och praxis. Med denna video bidrag, vi vill göra denna kraftfulla teknik tillgänglig för forskare från andra studieområden.För att förbereda en planar oxygen optode, använd först en film av vatten eller 70%etanol för att fixera en ren dammfri PET-folie på en ren glasskiva. Placera en ren 120 mikrometer kniv beläggning enhet på folien och använda en glaspipett för att tillämpa en linje av sensor cocktail framför enheten. Därefter drar knivbeläggningsanordningen långsamt och jämnt över PET-folien för att sprida cocktailen jämnt.Torka sedan den färdiga planar syrekänsliga optoden i omgivningsluft i en timme innan du torkar över natten i ett uppvärmt skåp vid 50 till 60 grader Celsius. Nästa morgon kommer ett cirka 12 mikrometer tjockt lager har erhållits. Förvara optoden skyddad från ljus tills vidare användning.För att förbereda en rhizo-sandwich kammare, använd ljushärdlig akryl-baserade instant lim för att limma mikroskop glider längs kanterna på en glasskiva lämnar en lång kant öppen. Skär planar optod i den form och storlek som krävs för att passa in i utrymmet mellan limmade mikroskop diabilder och placera optod på insidan av den främre glasskivan med den belagda sidan uppåt. Tejpa fast optodfoliens ena kant på glasplattan och tillsätt kranvatten mellan glasplattan och optodfolien.Sänk långsamt folien på vattendropparna så att optoden kan räta ut sig på glasytan och använda en mjuk vävnad för att försiktigt ta bort en luftbubblor fångade mellan optod och plattan. Torka sedan glasplattan torr och tejpa foliens återstående kanter till plattan. Därefter använder en plan glasskiva för att fördela 0,5 millimeter siktsediment jämnt över plattan till samma tjocklek som mikroskopet skjutsmejslar.Rengör försiktigt den övre ytan av mikroskopet glida för att säkerställa att den andra glasskivan tätar kammaren ordentligt och tillämpa silikonfett till mikroskopet glidytan. Täck sedan sedimentet med en tunn film av vatten samtidigt som man noggrant undviker att det bildas luftbubblor. Innan du placerar ett prov på sedimentet, tvätta försiktigt en enda skott av Littorella uniflora och placera skjuta på ett sediment med bladen sticker ut från den övre öppna sidan.När provet är på plats, placera glasplattan med optoden på sedimentet och applicera skonsamt tryck för att få optoden i nära kontakt med växtrötterna och det omgivande sedimentet. Använd klämmor för att fästa plattorna tillsammans och torka ytterkanterna med silkespapper. Upprepade gånger lägga till några droppar vatten till bladen för att hålla anläggningen hydrerad under hela monteringen av rhizo-sandwich och använda vinyl eltejp för att dra åt rhizo-smörgås kammaren.Sedan försegla kanterna med modellering lera och ytterligare eltejp. För att förbereda för avbildning, ta bort täckande folie från optodområdet efter inkubation och placera rhizo-sandwichkammaren med glasväggen med optoden upprätt mot akvarieväggen. Använd ett distanssteg för att trycka rhizo-sandwich kammaren mot väggen.Placera frekvens domän-baserade luminience livstid kamera utrustad med ett mål framför akvariet och området av intresse. Fäst ett lämpligt utsläppsfilter för avbildning av indikatorfärgämnet på kameramålningen och fixera ljusledaren i LED-excitationskällan. Placera sedan guiden så att den kommer att jämnt belysa planar optod folie som täcker området av intresse.I bildhanteringsprogrammet väljer du kameran och väljer LED i LED-styrprogramvaran. Ställ in LED-intensiteten efter behov och kryssa analog och synk för att bekräfta att LED utlöses av den externa transistor-transistor logik. Manuellt fokusera kameran och justera objektiv bländare och ställa in den interna modulation källa, sinus våg för utdata vågform, ytterligare fas provtagning, åtta-fas prover, fas ordning motsatt, peka på A B avläsning, och fem kilohertz modulering frekvens.Justera exponeringstiden tills regionen intressestatistik avläsning för den normaliserade luminiscensintensens bild ligger i intervallet 0,68 till 0,72. Klicka sedan på capture-referens för att starta förvärvet av en referensmätserie. För att kalibrera optoden, använd en gasblandningsanordning för att spola vattnet i ett kalibreringsakvarium med en omgivande luftkvävgasblandning med en känd syrekoncentration som övervakar syrekoncentrationen med en extern sond med en syresensor.Sedan skaffa en serie bilder vid olika syre koncentrationer i kalibreringskammaren för att få en korrekt kurvan passar till den förvärvade kalibreringsdata. När systemet har kalibrerats, släck lamporna som applicerar bestrålning på anläggningen och alla de andra ljuskällorna och justerar förvärvstiden utifrån bildens intensitet för att säkerställa att signalen varken är övermättad eller för svag för ett bra signal-brusförhållande i livstidsbestämningen. När alla syre livstidsbilder har förvärvats, slå på lamporna igen för att få en strukturell bild och få en bild med en linjal i synfältet för att möjliggöra efterföljande skalning av de förvärvade bilderna.Innan provet avbildas måste optoden kalibreras. Efter ett kvasi-exponentiellt sönderfall minskar den uppmätta luminience-livstiden när syrekoncentrationen ökar. Den här relationen kan också beskrivas med hjälp av den förenklade tvåplatsmodellen.När optoden har kalibrerats är det möjligt att bestämma syrekoncentrationen genom att avbilda luminescensens livstid som observerats i dessa bilder där fördelningen av syrekoncentrationen i rhizosfären i Littorella uniflora avbildades efter ljusexponering för 500 mikromolfotoner per meter i kvadrat per sekund under 12 timmar och efter 12 timmar i mörker. Förutom livstidsbilder kan strukturella bilder också förvärvas under extern belysning samtidigt som bildgeometrin håller fast för att syrgasavbildningen ska kunna korreleras exakt till den strukturella bilden. Syrekoncentrationsprofiler över en enda rot till exempel kan sedan extraheras från de bilder som förvärvats i mörker och ljus.Det är kritiskt att ha god kontakt mellan provmatrisen och optoden för att undvika onödiga artefakter. Om du är osäker, remake smörgåsen. Det momentana förvärvet av en bild på ett icke-förstörande sätt möjliggör övervakning av syremiljön.Metoden kan lika gärna kombineras med andra optoder för pH eller andra analyter. Var noga med att utföra optode tillverkning i en fume huva som sensorn cocktail innehåller kloroform. Planar optodes kan användas för att identifiera mikrobiella samhällen i sedimentet.Och efter avbildning, kan smörgåsen öppnas för att prova dessa hotspots för mikrobiell gemenskap analys.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Luminescence Lifetime Imaging of O2 with a Frequency-Domain-Based Camera System

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

Förbereda Vidhäftande Cells för röntgen fluorescens avbildning av Chemical Fixering

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Water in Oil Emulsions: A New System for Assembling Water-soluble Chlorophyll-binding Proteins with Hydrophobic Pigments

Vatten i oljeemulsioner: Ett nytt system för montering Vattenlösliga klorofyllbindande proteiner med hydrofoba pigment

Chlorophylls (Chls) and bacteriochlorophylls (BChls) are the primary cofactors that carry out photosynthetic light harvesting and electron transport. ...

Visualization of Ambient Mass Spectrometry with the Use of Schlieren Photography

Visualisering av Ambient masspektrometri med användning av schlierenfotografering

This manuscript outlines how to visualize mass spectrometry ambient ionization sources using schlieren photography. In order to properly optimize the mass ...

A Simple, Low-cost, and Robust System to Measure the Volume of Hydrogen Evolved by Chemical Reactions with Aqueous Solutions

En enkel, billig och robust system för att mäta volymen av vätgas Evolved genom kemiska reaktioner med vattenlösningar

There is a growing research interest in the development of portable systems which can deliver hydrogen on-demand to proton exchange membrane (PEM) ...

Measurements of Long-range Electronic Correlations During Femtosecond Diffraction Experiments Performed on Nanocrystals of Buckminsterfullerene

Mätningar av långväga elektroniska korrelationer under femtosekund diffraktion experiment utförs på nanokristaller av Buckminsterfullerene

The precise details of the interaction of intense X-ray pulses with matter are a topic of intense interest to researchers attempting to interpret the ...

Time-resolved Photophysical Characterization of Triplet-harvesting Organic Compounds at an Oxygen-free Environment Using an iCCD Camera

Tid-löst Photophysical karakterisering av triplett-skörd organiska föreningar i en syrefri miljö med en iCCD kamera

Here, we present a sensible method of the acquisition and analysis of time-resolved photoluminescence using an ultrafast iCCD camera. This system enables ...

Regioselective O-Glycosylation of Nucleosides via the Temporary 2',3'-Diol Protection by a Boronic Ester for the Synthesis of Disaccharide Nucleosides

Regioselective O-Glycosylation of Nucleosides via the Temporary 2',3'-Diol Protection by a Boronic Ester for the Synthesis of Disaccharide Nucleosides

Regioselective O- Glycosylation av nukleosider via den tillfälliga 2', 3'-Diol skydd av en Boronic Ester för syntesen av disackarid nukleosider

Disaccharide nucleosides, which consist of disaccharide and nucleobase moieties, have been known as a valuable group of natural products having ...

Synthesis and Structure Determination of &#181;-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities

Synthesis and Structure Determination of ÃƒÆ’Ã¢â‚¬Å¡Ãƒâ€šÃ‚Âµ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities

Syntes och strukturbestämning av µ-Conotoxin PIIIA isomerer med olika disulfid Connectivities

Peptides with a high number of cysteines are usually influenced regarding the three-dimensional structure by their disulfide connectivity. It is thus ...

Automation of a Positron-emission Tomography (PET) Radiotracer Synthesis Protocol for Clinical Production

Automation of a Positron-emission Tomography PET Radiotracer Synthesis Protocol for Clinical Production

Automatisering av ett Positron-emission Tomography (PET) Radiotracer syntes protokoll för klinisk produktion

The development of new positron-emission tomography (PET) tracers is enabling researchers and clinicians to image an increasingly wide array of biological ...

Solid Phase 11C-Methylation, Purification and Formulation for the Production of PET Tracers

Solid Phase 11C-Methylation, Purification and Formulation for the Production of PET Tracers

Solid fas 11C-metylering, rening och formulering för produktion av PET-tracers

Routine production of radiotracers used in positron emission tomography (PET) mostly relies on wet chemistry where the radioactive synthon reacts with a ...