Name: luminescence lifetime imaging of o2 with a frequency-domain-based camera system
Uploaded: 2019-12-16T14:00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Luminescence Lifetime Imaging of O2 with a Frequency-Domain-Based Camera System at JoVE.com

Biz Teknik yardım için Sofie Lindegaard Jakobsen (Kopenhag Üniversitesi) ve Lars Borregaard Pedersen (Aarhus Üniversitesi) teşekkür ederiz. Bu çalışmanın finansmanı, Bağımsız Araştırma Fonu Danimarka'dan (DFF-1323-00065B; MK), Bağımsız Araştırma Fonu Danimarka proje hibe | Fen Bilimleri (DFF-8021-00308B; MK) & Teknik ve Üretim Bilimleri (DFF-8022-00301B ve DFF-4184-00515B; MK), Danimarka Ulusal Araştırma Vakfı (DNRF136) ve Poul Due Jensen Vakfı (KK).

1. Düzlemsel O2 optod imalatı
<ol><li>Çözün 1.5 mg lüminesan O2 indikatör boya platin(II)-5,10,15,20-tetrakis-(2,3,4,5,6-pentaflorfenil)-porfirin (PtTFPP) ve 100 mg polistiren (PS) kloroformin 1 g olarak adlandırılan 'sensör kokteyl' almak için. NOT: Kokteyl kapalı, gaz geçirmez cam şişede buzdolabında birkaç saat bekletilebilir ve daha fazla kullanıma kadar karanlıkta.</li>
	<li>Temiz, tozsuz polietilen tereftalat (PET) folyo (uygulamaya bağlı boyut) bir su veya etanol yardımı (%70) yardımıyla temizlenmiş cam plaka üzerinde tamir film (Şekil 1A).</li>
	<li>Temizlenmiş bıçak kaplama cihazını (120 μm) folyoya yerleştirin ve sensör kokteylinin bir satırını cam pipet kullanarak cihazın önüne uygulayın(Şekil 1B). Daha sonra, kokteyli eşit olarak yaymak için bıçak kaplama cihazını PET folyoüzerinde yavaşça ve düzgün bir şekilde sürükleyin. NOT: Tüm malzeme ve aletler iyice temizlenmeli ve üretim duman kaputu, akış tezgahı veya bir nokta emme cihazının altında tozsuz bir ortamda yapılmalıdır. Son sensör folyosındaki heterojenlikleri önlemek için, kloroform hızlı buharlaştığı ndan, sensör kokteylinin folyoya uygulanmasını takip eden adımlar hızlı bir şekilde yapılmalıdır.</li>
	<li>Bitmiş düzlemsel O2-hassas optode'u ortam havasında 1 saat boyunca kurutun ve daha sonra 50-60 °C'de bir ısıtma kabininde gece boyunca, üretilen optodları karanlıkta (örneğin, kağıt zarfiçinde)daha fazla kullanıma kadar saklayın . NOT: Düzlemsel O2 optodes kuru ve karanlıkta birkaç ay için yıllar önce kullanılabilir. 1-20 μm arasında değişen son tabaka kalınlığı, yeterli parlaklık sinyali ve yeterli yanıt süreleri ile iyi sonuçlar verdiği kanıtlanmıştır.</li>
</ol>2. Rhizo-sandviç odası
<ol><li>İki cam plakayı (24,5 x 14 cm2,kalınlık: 4 mm) %96 etanol ile temizleyin.</li>
	<li>Mikroskop slaytlarını (76 x 26 mm2, kalınlık: 1 mm) ilk cam plakanın kenarları boyunca (yani arka oda kenarı) tutkallamak için hafif kürebilen, akrilik esaslı anlık yapıştırıcı (Bkz. Malzeme Tablosunabakınız) kullanın. Gerektiğinde mikroskop slaytları kısaltmak için bir cam kesici kullanın. DİkKAT: Camın kesilmesi keskin kenarlara neden olabilir ve dikkatli kullanılmalıdır. NOT: Mikroskop slaytları ön ve arka arasında boşluk işlevi görür ve köklerin kalınlığına ve bitki büyüklüğüne bağlı olarak birden fazla mikroskop slayt katmanı üst üste yapıştırılabilir.</li>
	<li>Yapıştırılmış mikroskop slaytlar arasındaki boşluğa sığacak şekilde düzlemsel optode'u gerekli şekil ve boyuta kesin. Ön cam plakanın içine, kaplamalı tarafı yukarı doğru yerleştirin, üzerine bastırıldığında ilgi örneği ile temas sağlar.</li>
	<li>Optod folyobir kenarı cam plaka ya da cam plaka ve optode folyo arasında musluk suyu birkaç damla ekleyin(Şekil 2A). Yavaşça cam yüzeyinde kendini düzeltmek için izin bu su damlacıkları üzerinde folyo indirin.</li>
	<li>Sensör kaplamasının çizilmesini önlerken, düzlemsel optod ile cam plaka arasında sıkışmış hava kabarcıklarını yumuşak bir doku kullanarak dikkatlice çıkarın. Cam plakayı kurutun ve optode folyonun kalan kenarlarını cam plakaya bantlayın(Şekil 2B). NOT: Su altında uygun yapışma içeren bir bant seçilmelidir.</li>
	<li>0,5 mm. Örgü boyutunda bir kafes boyutu kullanarak tortu elek ilk cam plaka(Şekil 2C)Üzerine ıslak tortu bir kaşık yerleştirin. NOT: Kafes boyutu spacer kalınlığının yarısından büyük olmamalıdır.</li>
	<li>Tortuyu eşit olarak dağıtın ve düz bir cam plaka kullanarak mikroskop slayt boşlukları ile aynı kalınlığa ayarlayın. İkinci cam plakanın hazneyi düzgün bir şekilde mühürlediğinden emin olmak için mikroskop slaytlarının üst yüzeyini dikkatlice temizleyin.</li>
	<li>Mikroskop slayt yüzeyine silikon gres uygulayın. Dikkatle hava kabarcıkları oluşumunu kaçınarak, ince bir su filmi ile tortu kapağı.</li>
	<li>Littorella uniflora'nın tek bir çekimini dikkatlice yıkayın ve bitki yapraklarının üst açık taraftan dışarı yapışmasıyla tortuüzerine yerleştirin(Şekil 2D).</li>
	<li>İkinci cam plakayı, optod ile birlikte tortuüzerine yerleştirin ve optodu bitki kökleri ve çevresindeki tortuile yakın temas halinde getirmek için hafif basınç uygulayın. NOT: Tortuda sıkışmış hava kabarcıkları cam plakalar yatırılarak bir araya getirilerek çıkarılabilir.</li>
	<li>Cam plakaları kelepçelerle birbirine bağlayın (Şekil 2E). Dış kenarları kağıt mendille kurulayın. Yaprakları rizo-sandviçin tüm montajı boyunca nemlendirilmiş tutun (örn. birkaç damla su ekleyerek).</li>
	<li>Vinil elektrik bandı kullanarak rizo-sandviç odası sıkın. Kenarları modelleme kil ile kapatın ve ayrıca vinil elektrik bandı ile bantlayın(Şekil 2F). NOT: Eğer tortuda çok sayıda hava kabarcığı veya boşluk mikroskop slaytları ile ikinci cam plaka arasında tortu taneleri varsa, gözenek suyu dışarı sızabileceğinden oda yeniden biraraya getirilmelidir (tekrar adımları 2.4 - 2.8).</li>
	<li>Rizo-sandviç kapsayacak şekilde opak bir plastik kullanın, ancak bitki dışarı sopa yaprakları için folyo bir yarık bırakın. Plastik folyo bir pencere kesin, böylece açılmak tarafından deneyler için açılabilir. Bitki kuluçkaya yatarken optodu fotoğraf ağartmaya karşı korumak için kauçuk bantlar(Şekil 2G)kullanarak klimalama süreleri boyunca pencereyi kapatın. NOT: Alg büyümesi ölçülen O2 konsantrasyonlarını potansiyel olarak etkileyebileceğiiçin, filtrelenmiş su, önceden temizlenmiş deneysel ekipman lar kullanarak ve formasyon üzerine yosunları çıkararak bunu en aza indirmeye çalışmanızı öneririz.</li>
</ol>3. Rhizo-sandviç odası kuluçka
<ol><li>Rhizo-sandwich haznesini bir su tankına (32 x 7 x 28 cm3)düzlemsel optode karşı kök büyümesini teşvik etmek için hafif eğimli bir konuma yerleştirin.</li>
	<li>Su haznesini bitki yapraklarını tamamen batıracak kadar su yla doldurun.</li>
	<li>Zaman kontrollü bir lamba kullanarak bitkinin iklimlendirme için 14 saat ışık, 10 saat karanlık döngüsü kurun. Havalandırma ve su karıştırma sağlamak için tanka bir hava taşı veya su pompası yerleştirin(Şekil 2H).</li>
</ol>4. Görüntüleme
<ol><li>Görüntüleme kurulumu
	<ol>
<li>Rhizo-sandviç odasında düzlemsel optode kapsayan plastik folyo çıkarın. Akvaryum duvarına dik optode ile cam duvar ile oda yerleştirin. Akvaryum duvarına rhizo-sandviç odası basın için bir spacer kullanın. NOT: Akvaryum duvarının genel kalınlığı artı rizo-sandviç odası duvarı çok kalın olmamalıdır, ancak, parlaklık görüntüleme için aquaria duvarlar için cam kalınlıkları > 1 cm, dağınık ışığın zayıflamasını artırarak mekansal çapraz konuşma azaltmak için tavsiye edilir. Malzeme arabirimindeki ışık saçılımını en aza indirmek için her iki cam duvar (aynı refrakter indeks) için aynı malzemeyi kullanmak önemlidir; bu da bulanık bir görüntü yol açacağı gibi12.</li>
		<li>Akvaryumun ve ilgi alanının (düzlemsel optod ile doğrudan temas halinde olan su bitkilittorella uniflorakökleri) önünde bir amaç ile donatılmış frekans-etki alanı tabanlı parlaklık ömür boyu kamera (Malzemeler Tablosubakınız) yerleştirin (Şekil 3). NOT: Kamera, kameranın kolay yükseklik ayarı için bir laboratuar standına yerleştirilebilir. Laboratuvar standının konumu işaretlenmeli ve sabit tutulmalıdır. Ayrıca, kamera deney sırasında kameranın kazara hareket etmesini önlemek için laboratuvar standına bantlanabilir.</li>
		<li>Uyarma kaynağından çıkarımları kaldırmak için, gösterge boyası olarak PtTFPP görüntüleme için uygun bir emisyon filtresi (bkz. Malzeme Tablosu)kamera objektifine vidalandı. NOT: Vidalı filtreler idealdir, ancak kare filtreler uygun bir adaptörle veya hedefe dikkatlice kaydedilerek de kullanılabilir.</li>
		<li>Bir LED uyarma kaynağını (Bkz. Malzeme Tablosu)kameranın modülasyonuna ve karanlık kapı çıkışına bağlayın. NOT: Eski ışık kaynağı için modülasyon sinyali sunar, ikinci görüntü sensörü görüntü okuma sırasında ışık kapatır. LED uyarma kaynağını ve kamerayı bilgisayara bağlayın. Tüm odayı karartarak veya tüm kuruluma yoğun, siyah bir bez koyarak görüntü okuma sırasında arka plan ışığı en aza indirilmelidir. İkinci durumda, kameranın ısınmasını önlemek için yeterli havalandırma sağlamak önemlidir.</li>
		<li>LED uyarma kaynağındaki ışık kılavuzunu düzeltin ve ilgi alanını kaplayan düzlemsel optode folyoyu eşit şekilde aydınlatmak için yerleştirin. NOT: Kullanılan LED uyarma kaynağında 3 farklı LED (460 nm, 528 nm, 625 nm) arasında geçiş yapmak mümkündür ve bunların yoğunluğu kontrol yazılımı ile ayarlanabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Ayarlar ve kamera çalışması NOT: Açıklanan deneyler için, ticari olarak kullanılabilen bir yazılım paketinde yaşam boyu görüntüleme için özel bir modülle birlikte frekans alan tabanlı bir yaşam boyu kamera kullandık (bkz.<ol>
<li>Kullanmadan önce seçilen yazılımdaki kamerayı seçin. NOT: Yazılım ve kamera sürücülerinin, üreticilerin yönergelerine uygun görüntülemeden önce yüklenmesi gerekir.</li>
		<li>LED kontrol yazılımını açın (denemeyi başlatmadan önce tekrar yüklenir) ve bekleme deyanarak uygun LED'i (burada: 528 nm) seçin. LED yoğunluğunu gerektiği gibi ayarlayın (%burada %30'a). LED'in harici TTL tarafından tetiklediğinden emin olun; bu, LED için analog ve senkronizasyon işaretleyerek yapılır. NOT: ÇOK yüksek lazer gücü göstergenin veya referans boyanın hızlandırılmış fotoğraf ağartılmasına yol açabileceğinden, LED yoğunluğunun ayrı ayrı ayarlanması gerekir.</li>
		<li>Kamerayı odakla ve hedefin diyafram açıklığını manuel olarak ayarlayın (mevcut çalışmada f = 2.8 kullanın). NOT: Kamerayı akvaryum camına değil düzlemsel optode odaklamak önemlidir; bu ölçek için bir cetvel ile bir görüntü alarak ve optode üzerinde cetvel gölgesi üzerinde odaklanarak, gerçek cetvel yerine sağlanabilir.</li>
		<li>Yazılımın kamera kontrol paneli içinde aşağıdaki parametreleri ayarlayın: dahili modülasyon kaynağı; çıkış dalga formu için sinüs dalgası; ek faz örneklemesi (Evet); 8 faz örnekleri, faz sırası karşıt, A + B okuma dokunun; 5 kHz modülasyon frekansı. NOT: Bu parametreler görüntü kalitesini etkiler ve gerekirse değiştirilebilir. Kameranın üreticisi tek tek parametreler hakkında yönergeler sağlar (Kamera üreticisi yazılım güncellendiğinde yönergeleri ve güncellemeleri yayımlamaktadır).</li>
		<li>Denemelerden önce bir referans görüntüsü alın. NOT: Bu, bir kalibrasyon standardının (bilinen bir ömür boyu (ns veya μs) ile Parlak boyanın görüntülenmesi yle veya LED'in yansıyan ışığıkullanılarak yapılabilir. İkinci durumda, emisyon uzun geçiş filtresi objektiften kaldırılması gerekir ve bilinen ömür 1 ns ayarlanabilir.</li>
		<li>Normalleştirilmiş parlaklık yoğunluğu görüntüsü için YG İstatistikleri okuması (bu panelin alt kısmında) 0,68 - 0,72 aralığında olana kadar özel görüntüleme yazılımının kalibrasyon bölümündeki pozlama süresini ayarlayın. NOT: Şimdi referans ömrü (örneğin, 1 ns) yazılıma giriş olarak verilir.</li>
		<li>Bir referans ölçüm serisinin edinimini başlatmak için Capture tuşuna basın. NOT: Tamamlandığında, referans verileri depolanır ve numuneler üzerinde tek veya zaman atlamalı ölçümler yapılabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>O2 optodkalasyonunun kalibrasyonu
	<ol>
<li>Düzlemsel O2duyarlı optod parçasını (küçük) bir cam akvaryuma yerleştirin. Kalibrasyon odasının cam duvarındaki düzlemsel optodayı daha önce açıklandığı gibi düzeltin (bkz. bölüm 2.3). Kalibrasyon akvaryumu kameranın önüne yerleştirin. LED ile bile aydınlatma sağlamak, hem de optod görüş alanının tamamını doldurur. NOT: Düzlemsel optod, aynı folyo parçasından veya gerçek deneyde kullanılan folyoile aynı sensör kokteylinden yapılmalıdır.</li>
		<li>Akvaryumu deneylerde kullanılan aynı sıvı ortamla doldurun. NOT: Kalibrasyonlar ve deneyler için farklı ortamlar kullanmak ölçümü etkileyebilir (örneğin, sensör yanıtını ve/veya O2 çözünürlüğünü değiştirerek). Bu nedenle, kalibrasyon aynı ortamda ve gerçek deney ile aynı sıcaklıkta yapılmalıdır. Sıcaklıkdalgalanmaları parlaklık sinyalini etkileyecek ve kaçınılmalıdır. Ancak, sıcaklık sabit tutulamıyorsa, O2-hassasoptod (birden fazla nokta) farklı (ilgili) sıcaklıklarda kalibre ve değerlerin sonraki yeniden hesaplanması ile sıcaklık telafisi yapılmalıdır.</li>
		<li>Bir gaz karıştırma cihazı kullanarak, bilinen O2 konsantrasyonunun hava/N2 gaz karışımı ile suyu yıkayarak kalibrasyon akvaryumu içindeki O2 konsantrasyonunu ayarlayın. Suyun yeterli bir süre için havalandırarak kullanılan gaz karışımı ile iyi dengelenir emin olun (akvaryum akış hızı ve boyutuna bağlıdır). NOT: Kalibrasyon akvaryumundaki O2 seviyesinin harici, kalibre edilmiş O2 sensörlü ve sıcaklık düşük bir şekilde izlenmesinizi öneririz (örn. fiber optik veya elektrokimyasal O2 sensörü kullanarak).</li>
		<li>Kalibrasyon odasında farklı O2 konsantrasyonlarında bir dizi görüntü alın. NOT: Elde edilen kalibrasyon verilerine uygun bir eğri sağlamak için en az beş farklı O2 konsantrasyonu ölçülmelidir. 0 hPa (anoksik koşullar) olarak ölçmek ve daha sonra belirli bir gösterge boya dinamik aralığı üzerinde diğer değerleri dağıtmak önemlidir. Burada PtTFPP'yi polistiren matrisinde hareketsiz hale getirilen O2duyarlı gösterge boyası olarak kullandık. Görüntüler 0, 48, 102, 156 ve 207 hPa olarak alınmıştır; 207 hPa verilen tuzluluk ve basınçta % 100 hava doygunluğu karşılık gelir.</li>
	</ol></li>
	<li>Numunenin görüntülenmesi
	<ol>
<li>Örneği kameranın önüne yerleştirin ve hatta aydınlatmayı sağlayın.</li>
		<li>Tesisin ışılışı ömür boyu görüntüsünü edinmeden hemen önce, tesise (ve diğer tüm tüm ışık kaynaklarına) ışınlama sağlayan ışığı kapatın. Satın alma süresini yoğunluk görüntüsüne göre ayarlayın ve sinyalin ömür boyu tayinde iyi bir sinyal için aşırı doymamış veya çok zayıf olmasını sağlar.</li>
		<li>Bitkiyi değişen ışık koşullarına (örn. ışık/ karanlık) maruz bırakın ve bir dizi görüntü elde edin.</li>
		<li>Yapısal bir görüntüelde etmek için odadaki ışığı açın. NOT: Arka plan ışığı açıldığında, kamera gerçekçi bir ömür boyu görüntü ölçmez. Ancak, yoğunluk görüntüsü şimdi yarı saydam optod aracılığıyla görüldüğü gibi tüm görüş alanını gösterir.</li>
		<li>Edinilen görüntülerin daha sonra ölçeklemesini sağlamak için görüş alanında cetvel veya benzer bir görüntü alın.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Veri analizi
<ol><li>Kamera üreticisi tarafından sağlanan makroyu kullanarak faz ömrü ve yoğunluk görüntülerini doğrudan ilgili görüntüleme yazılımından dışa aktarın.</li>
	<li>Serbestçe kullanılabilen bir görüntü analizi yazılımı kullanarak daha fazla görüntü analizi gerçekleştirin (bkz. Malzemeler Tablosu).</li>
	<li>Görüntü analizi yazılımındaki kalibrasyonun faz ömrü ndeki görüntülerini açın ve ölçü işlevini kullanarak görüntünün tamamının ortalamasını belirleyin. Ölçülen yaşam sürelerini bilinen O2 konsantrasyonlarına göre çizin ve kalibrasyon fonksiyonunu belirleyin(Şekil 4A).</li>
	<li>Tüm verilerden 0 /τ hesaplayın (τ0, O2'ninyokluğunda ölçülen faz ömrüdür). Bu değerleri bilinen O2 konsantrasyonlarına göre çizin (Şekil 4B).</li>
	<li>Dinamik çarpışma söndürme (denklem 3)38,39 [Q] O2 konsantrasyonu için basitleştirilmiş iki sitemodeli kullanarak, kalibrasyon çiziminden Ksv ve f parametrelerini belirleyin. Daha sonra Ksv ve f'yi belirleyen veri analizi yazılımındaki uyum işlevini tanımlayın.</li>
</ol>(3)<img align="center" src="/files/ftp_upload/60191/60191eq3.jpg">
<ol start="6"><li>Belirlenen parametreleri kullanarak görüntülenmiş yaşam ömürlerini O2 konsantrasyonlarına dönüştürmek için görüntü analiz yazılımında edinilmiş örnek görüntüleri açın, Ksv, f ve τ 0. NOT: Alternatif bir yaklaşım olarak edinilmiş kalibrasyon fazı ömür değerleri(Şekil 4A)doğrudan kullanılabilir. Bu durumda, kalibrasyon için eğri sığdırım işlevini kullanan üstel bir uyum kullanılır.</li>
	<li>Görüntü analizi yazılımında sonraki cetvel ile görüntüyü açın ve ölçüm aracını kullanarak bilinen bir mesafeyi ölçün. Bu ölçüyü Küme ölçeğialtında genel ölçek olarak ayarlayın.</li>
</ol>

Yazar Gerhard Holst bu makalede kullanılan kamera sistemi üreten PCO AG bir çalışanıdır. PCO AG, bu makalenin yayınlanmasına ve açık erişim maliyetlerine mali katkıda bulunmuştur.

Bu protokolde optode hazırlığından O2 görüntü analizine kadar tüm iş akışı ele alınmıştır. Bu protokolü izleyerek, kimyasal görüntüler yeni frekans-etki alanı tabanlı lüminesans ömür boyu kamera kullanılarak elde edilebilir. Uygulamaya bağlı olarak, düzlemsel optodlar sensör tabakasının çeşitli boyutlarda ve katman kalınlığında, santimetre karesantimetrenin birkaç onda birinden mikroskop kapak lı ve <1 μm kalınlığında sensör katmanları6,40arasında değişen katman kalınlığında imal edilebilir. Bu yöntemin potansiyeli belirli bir uygulama ile gösterilmiştir, ancak bitki rizosferlerinde O2 görüntüleme ile sınırlı değildir12,28.
Bu yöntem, saf parlaklık yoğunluğu tabanlı kimyasal görüntüleme yöntemleri ile karşılaştırıldığında çeşitli faydaları vardır. Luminescence ömür boyu görüntüleme değil, ya da en azından çok daha az, düzensiz aydınlatma, düzensiz optod kalınlığı etkilenen ve fotoğraf ağartma25. Ayrıca, bu yöntem oranmetrik görüntüleme17,37ortak ek bir referans boya kullanımını önler. Diğer yaşam boyu tabanlı kamera sistemleri ile karşılaştırıldığında, yaygın olarak kullanılan gated zaman-etki alanı kameralar gibi8,26, burada sunulan yeni kamera sistemi ve protokol karşılaştırılabilir sonuçlar sunabilir. Yakın tarihli bir yayında, bu iki sistemin analitik özellikleri karşılaştırıldı ve frekans-etki alanı tabanlı parlaklık ömür boyu kamera sistemi en azından durdurulan zaman etki alanı tabanlı selefi8karşılaştırılabilir olduğu bulundu .
Sadece polimer matristeki bir göstergeden oluşan en basit O2 optod'u sunduk. Birçok olası O2 göstergeleri yanı sıra20 bu katkı maddeleri kullanılabilir, yani, tio2 veya elmas tozu2 gibi saçılma ajanları sensör sinyalini artırmak için optod şeffaflığı azaltırken. Ayrıca ek boyalar enerji transferi41ile sinyal yoğunluğunu artırmak için kullanılabilir.
Düzlemsel optode imalatı için, tarif edilen sensör kokteyl bileşimini kullanırken, solvent buharlaşmasından sonra 7,5 ila 12 μm civarında son sensör tabakası kalınlığı nı (kullanılan boşluğun yaklaşık %10'u) vermek için 75 - 120 μm'lik bıçak kaplama cihazında bir boşluk kullanmanızı öneririz. Bu, daha yüksek boya yüklemesi veya daha yüksek parlaklık gösterge ve referans boyaları ve yanıt süresi seçilerek değiştirilebilen sinyal yoğunluğu arasında iyi bir uzlaşmadır. Katman kalınlığındaki artış tepki süresinin artmasına neden olur, çünkü analitin çevredeki ortamla algılama katmanında termodinamik dengeye ulaşması için gereken zaman aralığı12'yeçıkar.
Burada açıklandığı gibi optodeler, o2 konsantrasyonundaki değişikliklere birkaç saniye içinde tepkiverirler 17. Ultraince sensör kaplamaları ile saniyenin altında tepki süreleri spin kaplama6ile gerçekleştirilebilir. Destek veya bıçak kaplama cihazı iyi temizlenmemişse, homojen sensör katmanlarına neden olabilir. Ayrıca, kokteyl tamamen homojen olmadığında veya kaplama cihazının önüne yayıldıktan sonra çok hızlı uygulandığında böyle istenmeyen bir sonuç görülebilir. Bu nedenle, en iyi optodes hazırlamak için bazı uygulama gerekebilir.
Bu yöntem, optode yakın temas halinde konulabilir görüntü örnekleri için kullanılabilir, bazı deniz hayvanları gibi42, biyofilm6 ve toprak31 sadece birkaç isim. Biz bir amaç kullanarak bağımsız bir kurulum mevcut, ancak, kamera kolayca daha yüksek çözünürlüklü kimyasal görüntüleme için bir mikroskop birleştiğinde olabilir43.
Zaman etki tabanlı lüminesans ömür boyu görüntüleme arka plan floresan26bastırılması etkin iken, bu yeni frekans etki alanı tabanlı kamera sistemi kullanırken bir sorundur8. Sürekli görüntü edinimi sayesinde, bu kamera seçilen LED tarafından heyecanlanabilecek herhangi bir arka plan floresanını kaydeder ve seçilen spektral pencereye kamera hedefindeki emisyon filtresi tarafından tanımlandığı şekilde yayır. Bu görünüşte daha düşük bir ömür boyu ve sonuç olarak yanlış okumalar neden olacaktır. O2 sensör uyarma ve emisyon ile örtüşen önemli bir içfloresan floresan örnekleri ile çalışmak durumunda, karbon siyahı içeren ek bir tabaka kaplama tarafından optod üstüne ekstra bir optik izolasyon uygulamak esastır2,17. Böylece, sadece düzlemsel optod yayılan parlaklık kamera ulaşacaktır. Arka plan parlaklığını kontrol etmek için optode olmayan bir görüntü alınabilir, bu da sadece numunenin içsel parlaklığını gösterir. Gösterge boyanın parlaklık yoğunluğunu artırmak için sensör kokteyline TiO2 veya elmas tozu2,44gibi saçılma ajanları eklemek de mümkündür. Ancak, bu da daha hızlı fotoğraf ağartma yol açabilir ve TiO2 bilinen bir fotoğraf katalizörü, bir boya fotostabilite bozabilir41. Göz önünde bulundurulması gereken bir başka yönü de arka plan ışığıdır. Parlaklık yaşam ları görüntülendiğinde, arka plan ışığının mümkün olduğunca verimli bir şekilde kaçınılması gerekir. Bu nedenle, bu görüntüleme yöntemi kurulumun karanlık bir ortama yerleştirilmesini gerektirir ve görüntü edinimi sırasında herhangi bir dış ışık kaynağının geçici olarak kapatılması gerekir.
Özetle, parlaklık ömür boyu görüntüleme birçok farklı uygulamalara adapte edilebilir sağlam bir kimyasal görüntüleme yöntemidir. Bu protokol (bkz. bölüm 1 - 5) Bir O2 görüntüsü oluşturmak için gerekli tüm adımları kapsar ve 2D O2 görüntüleme için durdurulan devre arası kameranın yerine düzlemsel optodeler ile değiştirebilen şu anda en esnek frekans etki alanı parlaklık ömür boyu görüntüleme sistemini kullanır.

Tortular ve topraklarda çözünmüş gazların ve iyonların dağılımı ve dinamiği mikrobiyal solunum1,2veya bitki köklerinden radyal oksijen kaybı3,4,5gibi biyojeokimyasal süreçler hakkında önemli bilgiler sağlar ve mikropların kimyasal mikroortamı6,7, bitki rizosferleri5,8,9 ve hayvan yuvaları10, 11,12. Bu tür difüzyon sınırlı ortamlarda biyolojik ve kimyasal aktivite kimyasal yüzeyler veya biyojeokimyasal süreçlerin ürünlerinin dik gradyanlar oluşturabilirsiniz. Özellikle, O2 kullanılabilirliği biyojeokimyasal süreçler ve böylece biyoloji ve bir sistemin ekoloji üzerinde büyük bir etkisi vardır13. Bu nedenle, yüksek mekansal ve zamansal çözünürlükte O2 konsantrasyonlarının analizi su ve karasal bilimlerde büyük önem taşımaktadır. İlk olarak, elektrokimyasal ve optik mikrosensörler14,15 bu önemli analit ölçmek için geliştirilmiştir. Daha sonra, 2 boyutlu (2D) düzlemsel optodlar ile O2 görüntüleme tanıtıldı12,16,17,18,19, hangi görüntüleme ve toprak ve tortularda heterojen O2 dağılımı nın niceleme sağladı.
Düzlemsel O2 optodes uygun bir polimer21içinde çözünmüş bir O2-hassas gösterge boya20oluşur. Gösterge boya belirli optik dalga boylarında heyecanlı ve parlaklık şeklinde gevşeme üzerine kırmızı kaydırılmış ışık yayan. O2varlığında , heyecanlı gösterge boya çarpışma üzerine O2 molekülüne enerji aktarabilirsiniz, çarpışma tabanlı lüminesans söndürme olarak adlandırılır22. Bu nedenle, parlaklık yoğunluğu yanı sıra parlaklık ömrü artan O2 konsantrasyonu ile azalır23. İdeal bir durumda yoğunluk ve yaşam süresindeki değişim, belirli bir konsantrasyonda Parlaklık yoğunluğunu veya yaşam sürelerini (I0; τ0) veya O2'nin varlığını (I, τ) kullanarak Stern-Volmer denklemini (denklem 1) takip eder [Q]. Stern-Volmer sabiti (Ksv),optodun O2'yekarşı duyarlılığıiçin bir ölçüdür; KSV sıcaklık ve basınç gibi çevresel değişkenlere bağlıdır.
(1)<img align="center" src="/files/ftp_upload/60191/60191eq1.jpg">
O2 dağılımındaki ilgili değişiklikleri görselleştirmek için düzlemsel sensör folyosu üzerinden kamera sistemi ile bu tür değişikliklerin kaydedilmesi kullanılabilir. Başlangıçta basit parlaklık yoğunluğu tabanlı O2 görüntüleme18kullanılmıştır. Ancak, bu tür metodoloji, heterojen aydınlatma, uyarma kaynağı veya kameradaki dalgalanmalar ve düzlemsel optod içinde gösterge boyasının düzensiz dağılımı nedeniyle sonuçların güvenilirliğini tehlikeye sokan dış parazitlere karşı çok hassastır.
Bu sınırlamalardan bazıları, O 2 duyarlı gösterge boyasının,O2-göstergesinden farklıbir spektral aralıkta yayılan duyarsız bir referans boya ile düzlemsel optodun polimer tabakasında birlikte immobilize edildiği ratiometrik görüntüleme17,24için düzlemsel optodlar kullanılarak hafifletilebilir. İki spektral pencerede edinilen emisyon görüntülerine dayanarak, O2duyarlı emisyon sinyali referans sinyali ile bölünür ve yukarıda belirtilen parazitlere daha az yatkın bir oran görüntüsü oluşturur5,17. Bu yöntem, ideal olarak aynı uyarma kaynağı tarafından heyecanlanabilen, ancak kameranın başka bir spektral penceresinde (örneğin, bir RGB kameranın başka bir renk kanalında) farklı bir dalga boyunda (önemli bir spektral çakışma olmaksızın) yayan ikinci bir boyanın kullanılmasını gerektirir.
Alternatif olarak, O2 görüntüleme gösterge konsantrasyonu25'tekidüzensiz aydınlatma veya heterojenliklerden etkilenmeyen gösterge boyanın parlaklık ömründeki O2'yebağımlı değişimin ölçülmeye dayandırılabilir. İlk parlaklık ömür boyu o2 görüntüleme sistemleri bir kapı şarj lı cihaz (CCD) kamera sistemi26ile zaman etki alanı ölçümleri dayalı, bir darbeli uyarma kaynağı kullanılır ve parlaklık görüntüleri göstergesi 8 uyarma veya emisyon içinde tanımlanmış zaman aralıkları üzerinden alınır8,23,27. Bu görüntülerden, parlaklık ömrü belirlenebilir ve bir kalibrasyonda ilgili O2 konsantrasyonu ile ilişkili olabilir. Daha sonra, düzlemsel optoda karşı preslenmiş belirli bir örnek için parlaklık ömrü görüntüleri O2 konsantrasyonu karşılık gelen 2D dağılımı görüntüleri dönüştürülebilir. Bu sistem laboratuvar ve yerinde16,28,birçok uygulamada kullanılmıştır, ancak temel kapı-mümkün CCD kamera artık ticari olarak kullanılabilir.
Son zamanlarda, frekans-etki alanı8görüntüleri elde eden farklı bir parlaklık ömür boyu kamera sistemi, serbest bırakıldı. Sistem uyarma için sürekli olarak modüle edilmiş bir ışık kaynağına dayanır. Bu ya zaman alanında görüntü edinimi için kullanılan bir darbeli uyarma yerine bir sinüzoidal veya kare dalga olabilir. Bu modülasyon, o2 gösterge boyasının modüle edilmiş bir parlaklık salınımı ile sonuçlanır, bu da bir açı ile faz-shifted, φ, hangi gösterge boya parlaklık ömrüne bağlıdır (τ) (bkz. denklem 2).
(2)<img align="center" src="/files/ftp_upload/60191/60191eq2.jpg">
Uyarma ve emisyon genliği arasındaki değişim (yani, modülasyon indeksi veya derinliği (genlik sabit parlaklık parçasıile bölünür)) arasındaki değişim de parlaklık ömrüne bağlıdır. Yani, bilinen bir modülasyon frekansı ayarlayarak kamera içinde özel CMOS görüntü sensörü başkabir yerde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi ns içinde parlaklık ömrünü ölçmek mümkün 8,29,30. Çalışma prensibi hakkında genel bir kılavuz bulunabilir (aşağıdaki bağlantı <a href="https://www.youtube.com/watch?v=xPAB_eVWOr8" target="_blank">https://www.youtube.com/watch?v=xPAB_eVWOr8</a>kullanılarak).
Aşağıdaki protokolde, biz 2D9,31suda tatlı su bitki Littorella uniflora kökleri etrafında O2 konsantrasyonu dağılımı görüntüleme için yeni kamera sisteminin kullanımını göstermektedir. Bu yöntemin hiçbir şekilde bu uygulamayla sınırlı olmadığını vurgulamak isteriz. Oksijene duyarlı optodlar veya sensör parçacıkları27 çeşitli görüntüleme yöntemleri ile birlikte tıbbi araştırmakullanılmıştır 32, biyobaskı33, basınca duyarlı boyalar için34,35, veya fotosentetik sistemleri incelemek için2,36,37, sadece uygulamanın birkaç diğer alanları isim.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Air pump with air stone and water pump</td>
			<td>Local aquarium store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>67-66-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC4 silicone compound</td>
			<td>Dow Corning GmbH</td>
			<td>2793695</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas mixer</td>
			<td>V&#246;gtlin Instruments GmbH</td>
			<td>red-y compact meter GCM</td>
			<td>This is just one possible instrument. Several companies offer gas mixing devices</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass plates and aquaria</td>
			<td>Local aquarium or hardware store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Freely available imaging software (imagej.nih.gov/ij/index.html)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knife-coating device</td>
			<td> 
			 
			BYK-GARDNER GMBH byk.com</td>
			<td>2021</td>
			<td>This is a four sided film applicator enabling easy variation of the film thickness. Other versions are also available. We recommend a thickness of the applied film between 75-120 &#181;m, which yields a final sensor layer thickness of ~10% of the applied thickness before solvent evaporation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED lamp, Reflector PAR38</td>
			<td>Megaman</td>
			<td>MM17572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED LEDHUB</td>
			<td>Omicon Laserage, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Can be configured with a variety of LEDs. For the presented example, the green LED (528 nm) is essential</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LOCTITE AA 3494</td>
			<td>Henkel AG &#38; Co. KGaA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Acrylic-based instant adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements AR Software</td>
			<td>Nikon Inc</td>
			<td></td>
			<td>Software package used for image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pco.flim</td>
			<td>PCO AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Frequency domain based luminescence lifetime camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>platinum(II)-5,10,15,20-tetrakis-(2,3,4,5,6-pentafluorphenyl)-porphyrin (PtTFPP)</td>
			<td>Frontier Scientific</td>
			<td>PtT975</td>
			<td>O2 indicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene terephthalate (PET) foil</td>
			<td>Goodfellow</td>
			<td>320-992-72</td>
			<td>Such foils might also be found from other providers and serve as solid support</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene (PS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9003-53-6</td>
			<td>Polymer matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schott RG610 filter</td>
			<td>www.uviroptics.com</td>
			<td></td>
			<td>Here 52mm screw on Filters can obtained. Other sources offer square glass filters from Schott glass that can be fixed in front of the objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl electrical tape</td>
			<td>Scotch, Super 33+</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Makro Planar 2/100 with Hama C for Nikon adaptor</td>
			<td>delivered with the camera</td>
			<td></td>
			<td>Here any other objective might also be used in combination with an adaptor if the objective does not have a C-mount</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

luminescence lifetime imaging of o2 with a frequency-domain-based camera system

Çözünmüş oksijeni (O2),2B'de yüksek uzamsal (< 50-100 μm) ve zamansal (< 10 s) çözünürlükte görüntülemek için bir yöntem tanımlıyoruz. Bu yöntem, frekans etki alanında parlaklık ömrünü görüntülemek için özel bir kamera sistemi ile birlikte O2 hassas Parlak sensör folyoları (düzlemsel optodlar) kullanır. Düzlemsel optodeler, O2-hassasgösterge boyasının bir polimer içinde çözülmesi ve karışımın bıçak kaplaması ile tanımlanmış bir kalınlıkta katı bir destek üzerine yayılması ile hazırlanır. Çözücü buharlaşma sonra, düzlemsel optode ilgi örneği ile yakın temas yerleştirilir - burada su bitki Littorella uniflorakökleri ile gösterilmiştir. Düzlemsel optod içindeki gösterge boyanın parlaklık ömründeki O2 konsantrasyonuna bağlı değişim, şeffaf taşıyıcı folyo ve akvaryum duvarının arka tarafı üzerinden özel bir kamera kullanılarak görüntülenir. Bu kamera, modüle edilmiş bir uyarma sinyali ile emisyon sinyali arasındaki faz açısındaki bir kayma yla parlaklık ömrünü (μs) ölçer. Bu yöntem, sinyal uyarma kaynağının boya konsantrasyonu veya yoğunluğundan bağımsız olduğundan ve sadece doğal olarak başvurulan bir parametre olan lüminesans bozunma süresine dayandığından, lüminesans yoğunluğu görüntüleme yöntemlerinden daha üstündür. Sonuç olarak, ek bir başvuru boyası veya diğer başvuru araçları gerekmez. Biz bitki rizosferlerin makroskopik O2 görüntüleme için sistemin kullanımını göstermek, ancak kamera sistemi de kolayca bir mikroskop ile birleştiğinde olabilir.

Yeni görüntüleme sistemi için bir uygulama örneği olarak, karmaşık bir biyolojik numunenin 2D O2 görüntülemesini (yani, su bitkisi Littorella uniflora'nınrizosferini) gösteriyoruz.
İlk olarak, yöntem bir düzlemsel sensör film, sözde düzlemsel optode imalatı açıklar. Şekil 1'degörüldüğü gibi, böyle bir optod şeffaf bir destek üzerine yayılan bir polimer matrisoptik gösterge ince bir tabakadan yapılır. Açıklanan protokoliz uyarınce, bıçak kaplama cihazının boşluğunda tanımlandığı gibi tek tip kalınlığa sahip homojen bir sensör filmi elde edilir. Üretilen optod yamalı bir sensör malzeme dağılımına sahipse (örn. kaplamadaki delikler, çizgiler veya boya agregaları (bu görsel olarak ve görsel olarak uv lambası yardımıyla değerlendirilebilir)), protokolün tekrarlanması ve tüm malzemelerin aseton kullanılarak iyice temizlenmesi gerekir.
Düzlemsel optod hazırlandıktan sonra, numune düzlemsel optodun algılama tabakası ile yakın temas halinde getirilebilir, burada bir rizo-sandviç odasına entegre düzlemsel optod ile gösterildiği gibi, çevredeki bir tortu matrisi içindeki bir bitkinin kökleri düzlemsel optoda yakın temas içinde konumlandırılabilir(Şekil 2). Doğru hazırlanırsa, rizo-sandviç odası bir akvaryumdan (kuluçka) diğerine (ölçüm) kolayca taşınabilir olmalıdır. Doğru inşa edilmezse, rizo-sandviç odası kararsız olabilir, tortu kaybedebilir veya hava kabarcıkları içerebilir. Bu nedenle, rizo-sandwich haznesinin montajdan hemen sonra görsel muayenesi önerilir.
Verilen protokol, frekans etki alanı tabanlı lüminesans ömür boyu kamerayı kullanarak düzlemsel optoda ile temas eden numunenin frekans-etki alanı tabanlı parlaklık ömür boyu görüntülemesini sağlar. Görüntü edinme modu ve bilimsel tamamlayıcı metal-oksit-yarı iletken (SCMOS) kamera özellikleri gibi bu kamera sistemi hakkında daha fazla bilgi son yayınlarda verilmiştir8,29.
Kurulumun kendisi oldukça basittir ve sadece bir ışık kaynağını (bu durumda, bir LED uyarma kaynağı) ve optodlu örneği kontrol eden kamerayı içerir (Şekil 3). Tüm parçaların doğru bir şekilde bağlandığından ve numunenin homojen bir şekilde aydınlatıldığından emin olun. Ölçümleri önceden şekillendirirken arka plan ışıklarından kaçınılmalıdır.
Numunenin görüntülenmesinden önce, optodun kalibre edilmesi gerekir. Şekil 4A'dagörüldüğü gibi, ölçülen lüminesans ömrü yarı-üstel bozunmayı takiben artan O2 konsantrasyonu ile azalır. Bu ilişki basitleştirilmiş iki siteli model(Şekil 4B ve denklem 3) kullanılarak da tanımlanabilir. Verilen örnekte, O2 konsantrasyonu daha sonra hesaplamak için gerekli parametreler aşağıdaki gibidir; τ0 = 56,26 μs, Ksv = 0,032 hPa-1 ve f = 0,86.
Kalibrasyon yapmak, sistemin doğru çalıştığını test etmek için de ideal bir yoldur. Tüm bileşenler burada açıklandığı şekilde (veya üreticilerin yönergeleri dahilinde) yüklenmişse, ölçülen ömür Şekil 4'tegörüldüğü gibi aynı O2 bağımlılığını göstermelidir. Buna ek olarak, O2 algılama malzemelerinin (polimer ve boya) aynı kombinasyonu için, ölçülen τ0 burada ölçülen (özellikle deneysel sıcaklıktan etkilenmiş) aynı aralıkta (± birkaç μs) olmalıdır. Benzer bir kalibrasyon eğrisi elde edemiyorsanız, tüm adımların doğru şekilde izlendirilip izlendirildik. Bazen optode yanlışlıkla örnek yerine cam duvara bakan hassas tarafı ile sabitlenir, ya da elde edilen görüntüler üzerinde veya az pozlanmış.
Kalibrasyon parametreleri ile Lüminesans ömrünü (τ) görüntüleyerek O2 konsantrasyonu belirlemek mümkündür. Bu şekil 5A, Bgösterilmiştir , Littorella uniflora rizosferde O2 konsantrasyonunun dağılımı karanlıkta görüntülendi ve ışık maruziyeti sonra 500 μmol fotonm m -2 s-1 için 12 saat, sırasıyla. Bitkinin fotosentetik aktivitesi nedeniyle, rizosferdeki O2 konsantrasyonu ışığa maruz kaldıktan sonra artmıştır. Yaşam boyu görüntülerin yanı sıra, görüntüleme geometrisi sabit tutarken, dış aydınlatma altında da "yapısal" görüntüler elde edilebilir. Bu şekilde, O2 görüntüleri yapısal görüntü(Şekil 5C),kesitler veya ilgi bölgeleri ile tam olarak ilişkili olabilir. Örnek olarak, tek bir kök üzerindeki O2 konsantrasyon profilleri sırasıyla karanlık ve ışıkta elde edilen görüntüden çıkarılabilmiştir (Şekil 5D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60191/60191fig1a.jpg"> Şekil 1: Düzlemsel O2 optod imalatı. (A) Pet folyo cam bir plaka üzerine sabitlenir ve bıçak kaplama cihazı folyoüzerine yerleştirilir. (B) Hazırlanan sensör kokteyli, pet folyoya bıçak kaplama cihazının önünde ince bir çizgi olarak yayılır. (C) Bıçak kaplama cihazı, sensör kokteylini PET folyo üzerinde ince bir film olarak yaymak için aşağıya doğru hareket ettirilir ve solvent buharlaşması düzlemsel optode kullanmaya hazır olur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60191/60191fig1alarge.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60191/60191fig2a.jpg"> Şekil 2: Bir düzlemsel O2 optod entegrasyonu ile rhizo-sandviç oda montaj. (A) Optode bir su filmi kullanılarak cam plakalardan birine sabitlenir. (B) Optod elektrikli bant ile plakaya yapıştırılır. (C) Tortu, bağlı boşluklarla (yani mikroskop slaytları) karşı plakaya doldurulur. (D) Bitki kökleri eşit şekilde yayılan tortu üzerine yerleştirilir. (E) Rhizo-sandwich haznesi kapatılır ve geçici olarak kelepçelerle sabitlenir. (F) Tamamen kapalı ve monte rhizo-sandviç odası. (G) Optoda'yı kuluçka lambası ile ışığa maruz kalmaktan korumak ve alg büyümesini önlemek için monte edilmiş rhizo-sandviç odasının üzerine plastik bir kapak yerleştirilir. (H) Rhizo-sandviç odası bir akvaryumda kuluçkaya yatırılabıdır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60191/60191fig2alarge.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60191/60191fig3a.jpg"> Şekil 3: Frekans-etki alanı tabanlı lüminesans ömür boyu kamera içeren görüntüleme kurulumu, amaç şeffaf akvaryum ve rizo-sandviç odası duvarları ile arkadan optode ile örnek odaklanmış. LED uyarma kaynağının ışık kılavuzu, numuneyi eşit olarak aydınlatmak için konumlandırılır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60191/60191fig3alarge.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60191/60191fig4a.jpg"> Şekil 4: Düzlemsel O2 optod için kalibrasyon eğrileri. (A) Su dolu kalibrasyon odasındaki ilgili O2 konsantrasyonlarında ölçülen farklı fosforluk ömürleri. (B) Dinamik çarpışma söndürme için basitleştirilmiş iki siteli model kullanılarak donatılmış kalibrasyon verilerinin Stern-Volmer çizimi (denklem 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60191/60191fig4alarge.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60191/60191fig5a.jpg"> Şekil 5: Su bitkilittorella uniflorarizosferde O2 dağılımıömür boyu görüntüleme . (A) O2 dağılımı yaklaşık 500 μmol fotonm -2 s-1 de 12 saat boyunca ışık altında bitki tuttuktan sonra . (B) O2 dağılımı, bitkiyi 1 saat karanlığa tuttuktan sonra (C) Düzlemsel optoddan görülen bitki köklerinin yapısal görüntüsü. (D) Kesitsel O2 konsantrasyon profili (konum A ve B panelindeki sarı çizgi ile gösterilir) 12 saat açık (kırmızı) ve 1 saat karanlıkta (siyah) sonra. (Koren, K., Moßhammer, M., Scholz, V. V., Borisov, S.M., Holst, G., Kühl, M. Luminescence Yaşam Boyu Kimyasal SensörlerGörüntüleme - Zaman-Etki Alanı ve Frekans-Etki Alanı Tabanlı Kamera Sistemleri arasında bir karşılaştırma izni ile uyarlanmıştır. Analitik Kimya. 91 (5), 3233-3238, doi: 10.1021/acs.analchem.8b05869 (2019)). Telif Hakkı (2019) Amerikan Kimya Derneği. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60191/60191fig5alarge.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Luminescence Lifetime Imaging of O2 with a Frequency-Domain-Based Camera System at JoVE.com

Luminescence Lifetime Imaging of O2 with a Frequency-Domain-Based Camera System

Optik sensör folyoları ile 2D O2 dağıtımlarının haritalama için yeni, frekans etki alanı parlaklık ömür boyu kamera kullanımını anlatıyoruz. Kamera sistemi ve görüntü analizi prosedürleri, su bitkilerinin rizosferinde O2 mikro ortamının görselleştirilmesi için sensör folyolarının hazırlanması, kalibrasyonu ve uygulanması ile birlikte açıklanmıştır.

Frekans-Etki Alanı Tabanlı Kamera Sistemi ile O2'nin Lüminesans Yaşam Boyu Görüntülemesi

We describe a method to image dissolved oxygen (O2), in 2D at high spatial (&#60; 50-100 &#181;m) and temporal (&#60; 10 s) resolution. The method employs ...

En iyi elektron kabul edicisi olarak oksijen biyolojik sistemlerde çok önemli bir rol oynar. Bu protokol ile, bir optod kullanarak 2D oksijen dağılımı görüntüleyebilirsiniz. Yüksek mekansal ve zamansal çözünürlüğe ek olarak, bu yöntem ek bir referans boya gerektirmez, son derece sağlamdır ve yapısal görüntü nün kazanılmasını sağlar.Bu yöntem, oksijenin ekoloji, tıbbi araştırmalar, biyobaskı ve basınca duyarlı baskı gibi önemli bir rol oynadığı çeşitli araştırma alanlarına uygulanabilir. Destek folyosu ve bıçak kaplama cihazı sürükleme hızına eklenen kokteyl miktarı optimizasyon ve uygulama gerektirdiğinden, optode imalatı zor olabilir. Bu video katkısı ile, bu güçlü tekniği diğer çalışma alanlarından araştırmacılar için erişilebilir hale getirmek istiyoruz.Düzlemsel bir oksijen optodu hazırlamak için, temiz bir cam plaka üzerinde temiz bir tozsuz PET folyo düzeltmek için ilk su veya% 70 etanol bir film kullanın. Folyo üzerine temiz bir 120 mikrometre bıçak kaplama cihazı yerleştirin ve cihazın önünde sensör kokteyl bir çizgi uygulamak için cam bir pipet kullanın. Daha sonra, kokteyli eşit olarak yaymak için bıçak kaplama cihazını PET folyoüzerinde yavaşça ve düzgün bir şekilde sürükleyin.Daha sonra bitmiş düzlemsel oksijene duyarlı optode'yi bir saat boyunca ortam havasında kurutun ve bir gecede 50 ila 60 santigrat derecede ısıtılmış bir dolapta kurulayın. Ertesi sabah yaklaşık 12 mikrometre kalınlığında bir tabaka elde edilecektir. Daha fazla kullanıma kadar ışıktan korunan optode saklayın.Bir rhizo-sandviç odası hazırlamak için, bir uzun kenarı açık bırakarak bir cam plaka kenarları boyunca mikroskop slaytlar tutkal hafif kürebilir akrilik tabanlı anlık yapıştırıcı kullanın. Yapıştırılmış mikroskop slaytlar arasındaki boşluğa sığacak şekilde gerekli şekil ve boyuta düzlemsel optode kesin ve kaplamalı tarafı yukarı ile ön cam plaka nın içine optode yerleştirin. Optod folyobir kenarını cam plakaya bantlayın ve cam plaka ile optode folyo arasına musluk suyu ekleyin.Yavaş yavaş optod cam yüzeyinde kendini düzeltmek için izin su damlacıkları üzerine folyo indirin ve dikkatle optode ve plaka arasında sıkışmış bir hava kabarcıkları kaldırmak için yumuşak bir doku kullanın. Daha sonra cam plakayı kurutun ve folyonun kalan kenarlarını tabağa bantlayın. Daha sonra, 0,5 milimetrelik elek tortusunu plaka boyunca mikroskop slayt boşlukları ile aynı kalınlığa eşit olarak dağıtmak için düz bir cam plaka kullanın.İkinci cam plakanın hazneyi düzgün bir şekilde mühürlediğinden ve mikroskop slayt yüzeyine silikon gres uyguladığından emin olmak için mikroskop kaydırağının üst yüzeyini dikkatlice temizleyin. Daha sonra dikkatlice hava kabarcıkları oluşumunu kaçınarak su ince bir film ile tortu kapağı. Tortu üzerine bir örnek yerleştirmeden önce, littorella uniflora tek bir ateş dikkatlice yıkayın ve yaprakları üst açık taraftan dışarı yapışan bir tortu üzerinde ateş konumlandırın.Numune yerinde yken, optodlu cam plakayı tortuüzerine yerleştirin ve optodu bitki kökleri ve çevresindeki tortuile yakın temas ta getirmek için hafif basınç uygulayın. Plakaları birbirine bağlamak ve dış kenarları kağıt mendille kurutmak için kelepçeler kullanın. Tekrar tekrar rhizo-sandviç montaj boyunca bitki sulu tutmak ve rizo-sandviç odası sıkmak için vinil elektrik bandı kullanmak için yapraklarına su birkaç damla ekleyin.Sonra modelleme kil ve ek elektrik bandı ile kenarları mühür. Görüntülemeye hazırlanmak için, kuluçka sonrası kaplama folyoyu optod alanından çıkarın ve rhizo-sandwich odasını, optode ile cam duvarla akvaryum duvarına dik olarak yerleştirin. Rhizo-sandviç odasını duvara bastırmak için bir boşluk kullanın.Akvaryum ve ilgi alanı önünde bir amaç ile donatılmış frekans etki alanı tabanlı parlaklık ömür boyu kamera yerleştirin. Gösterge boyasını kamera hedefine görüntülemek için uygun bir emisyon filtresi takın ve LED uyarma kaynağındaki ışık kılavuzunu düzeltin. Daha sonra kılavuzu, ilgi alanını kaplayan düzlemsel optode folyoyu eşit olarak aydınlatacak şekilde yerleştirin.Görüntüleme yazılımında kamerayı seçin ve LED kontrol yazılımındaki LED'i seçin. LED'in dış transistör-transistör mantığı tarafından tetiklediğini doğrulamak için LED yoğunluğunu gerektiği gibi ayarlayın ve analog ve senkronize yi işaretleyin. Kamerayı manuel olarak odakla ve nesnel diyaframaçıklığını ayarlayın ve dahili modülasyon kaynağını, çıkış dalga formu için sinüs dalgasını, ek faz örneklemesini, sekiz fazlı örnekleri, faz sırası karşısında, A B okumasına dokunun ve beş kilohertz modülasyon frekansını ayarlayın.Normalleştirilmiş parlaklık yoğunluğu görüntüsü için ilgi istatistikleri nin okunduğu bölge 0,68 ile 0,72 aralığında olana kadar pozlama süresini ayarlayın. Ardından, bir referans ölçüm serisinin edinimini başlatmak için yakalama referansını tıklatın. Optode kalibre etmek için, bilinen bir oksijen konsantrasyonu ile bilinen bir oksijen konsantrasyonu ile bir kalibrasyon akvaryumda su floş bir gaz karıştırma cihazı kullanın bir oksijen sensörü ile harici bir prob ile oksijen konsantrasyonu izleme.Daha sonra, elde edilen kalibrasyon verilerine uygun bir eğri elde etmek için kalibrasyon odasındaki farklı oksijen konsantrasyonlarında bir dizi görüntü elde edin. Sistem kalibre edildiğinde, tesise ve diğer tüm ışık kaynaklarına ışınlama uygulayan ışıkları kapatın ve sinyalin yaşam boyu belirlenmesinde iyi bir sinyal-gürültü oranı için aşırı doymamış veya çok zayıf olduğundan emin olmak için görüntünün yoğunluğuna göre edinme süresini ayarlayın. Tüm oksijen ömrü görüntüleri elde edildiğinde, yapısal bir görüntü elde etmek için ışıkları geri açın ve elde edilen görüntülerin sonraki ölçekleme sağlamak için görüş alanında bir cetvel ile bir görüntü elde.Numune görüntülenmeden önce, optod kalibre edilmelidir. Yarı-üstel çürümenin ardından, oksijen konsantrasyonu arttıkça ölçülen parlaklık ömrü azalır. Bu ilişki, basitleştirilmiş iki site modeli kullanılarak da tanımlanabilir.Optod kalibre edildikten sonra, Littorella uniflora rizosferindeki oksijen konsantrasyonunun dağılımının 12 saat boyunca saniyede 500 mikromol foton kare ışık maruziyetinden sonra ve karanlıkta 12 saat sonra görüntülendiği bu görüntülerde gözlendiği gibi, ışıltı ömrünü görüntüleyerek oksijen konsantrasyonunun belirlenmesi mümkündür. Yaşam boyu görüntülere ek olarak, oksijen görüntülemenin yapısal görüntüyle tam olarak ilişkilendirilebilmesi için görüntüleme geometrisi sabit tutarken, yapısal görüntüler de dış aydınlatma altında elde edilebilir. Örneğin tek bir kök teki oksijen konsantrasyonprofilleri daha sonra karanlık ve ışıkta elde edilen görüntülerden çıkarılabilir.Gereksiz yapıları önlemek için örnek matris ve optod arasında iyi bir temas olması çok önemlidir. Eğer şüphen varsa, sandviçi yeniden yap. Bir görüntünün zararsız bir şekilde anlık olarak elde edilmesi oksijen ortamının izlenmesini sağlar.Yöntem de pH veya diğer analitler için diğer optodes ile kombine edilebilir. Sensör kokteyl kloroform içerdiğinden bir duman kaputunda optode imalatı gerçekleştirmek için emin olun. Düzlemsel optodes tortu mikrobiyal toplulukları tanımlamak için kullanılabilir.Ve görüntülemeden sonra, sandviç mikrobiyal toplum analizi için bu sıcak noktalar örnek açılabilir.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Luminescence Lifetime Imaging of O2 with a Frequency-Domain-Based Camera System

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

Kimyasal Fiksasyon X-ışını Floresans Görüntüleme Değme Hücreleri hazırlanması

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Water in Oil Emulsions: A New System for Assembling Water-soluble Chlorophyll-binding Proteins with Hydrophobic Pigments

Petrol Emülsiyonlar Su: Hidrofobik Pigmentler ile Suda çözünür Klorofil bağlayıcı Proteinler Montaj için Yeni Bir Sistem

Chlorophylls (Chls) and bacteriochlorophylls (BChls) are the primary cofactors that carry out photosynthetic light harvesting and electron transport. ...

Visualization of Ambient Mass Spectrometry with the Use of Schlieren Photography

Schlieren Fotoğraf Kullanımına Ortam kütle spektrometresi görselleştirme

This manuscript outlines how to visualize mass spectrometry ambient ionization sources using schlieren photography. In order to properly optimize the mass ...

A Simple, Low-cost, and Robust System to Measure the Volume of Hydrogen Evolved by Chemical Reactions with Aqueous Solutions

Basit, düşük maliyetli ve Sağlam Sistem Sulu Solutions ile Kimyasal Reaksiyonların tarafından Evolved Hidrojen Sesi Tedbir

There is a growing research interest in the development of portable systems which can deliver hydrogen on-demand to proton exchange membrane (PEM) ...

Measurements of Long-range Electronic Correlations During Femtosecond Diffraction Experiments Performed on Nanocrystals of Buckminsterfullerene

Bukminsterfuleren Nanocrystals üzerinde gerçekleştirilen Femtosecond kırınım deneyler sırasında uzun menzilli elektronik korelasyon ölçümleri

The precise details of the interaction of intense X-ray pulses with matter are a topic of intense interest to researchers attempting to interpret the ...

Time-resolved Photophysical Characterization of Triplet-harvesting Organic Compounds at an Oxygen-free Environment Using an iCCD Camera

Zaman karar vermek Photophysical karakterizasyonu üçlüsü-hasat organik bileşikler bir oksijensiz ortamı kullanarak bir ICCD kamera

Here, we present a sensible method of the acquisition and analysis of time-resolved photoluminescence using an ultrafast iCCD camera. This system enables ...

Regioselective O-Glycosylation of Nucleosides via the Temporary 2',3'-Diol Protection by a Boronic Ester for the Synthesis of Disaccharide Nucleosides

Regioselective O-Glycosylation of Nucleosides via the Temporary 2',3'-Diol Protection by a Boronic Ester for the Synthesis of Disaccharide Nucleosides

Regioselective O- glikozilasyon nükleozitler üzerinden geçici 2', 3'-Diol koruması tarafından Boronic Ester Disaccharide nükleozitler sentezi için

Disaccharide nucleosides, which consist of disaccharide and nucleobase moieties, have been known as a valuable group of natural products having ...

Synthesis and Structure Determination of &#181;-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities

Synthesis and Structure Determination of ÃƒÆ’Ã¢â‚¬Å¡Ãƒâ€šÃ‚Âµ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities

Sentez ve μ-Conotoxin PIIIA izomerler farklı disülfür Connectivities ile yapı belirlenmesi

Peptides with a high number of cysteines are usually influenced regarding the three-dimensional structure by their disulfide connectivity. It is thus ...

Automation of a Positron-emission Tomography (PET) Radiotracer Synthesis Protocol for Clinical Production

Automation of a Positron-emission Tomography PET Radiotracer Synthesis Protocol for Clinical Production

Klinik üretim için bir pozitron emisyon tomografi (PET) Radiotracer sentez protokolü'nün Otomasyon

The development of new positron-emission tomography (PET) tracers is enabling researchers and clinicians to image an increasingly wide array of biological ...

Solid Phase 11C-Methylation, Purification and Formulation for the Production of PET Tracers

Solid Phase 11C-Methylation, Purification and Formulation for the Production of PET Tracers

Pet İzleyicilerin Üretimi için Katı Faz 11C-Metilasyon, Arıtma ve Formülasyon

Routine production of radiotracers used in positron emission tomography (PET) mostly relies on wet chemistry where the radioactive synthon reacts with a ...