Name: nanoscopic imaging of human tissue sections via physical and isotropic expansion
Uploaded: 2019-09-25T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nanoscopic Imaging of Human Tissue Sections via Physical and Isotropic Expansion at JoVE.com

وقد تم دعم هذا العمل من قبل صندوق بدء الكلية من جامعة كارنيجي ميلون (YZ) وجائزة مدير المعهد الوطني للصحة للمبتكرين الجدد (DP2 OD025926-01 إلى YZ).

1. إعداد الكواشف والحلول للأسهم
<ol><li>
إعداد مكونات الحل الهلامي. ملاحظة: يتم إعطاء تركيزات الحل في g/mL (ث/ v في المائة).<ol>
<li>جعل حلول الأسهم التالية: 38٪ (ث / الخامس) أكريليت الصوديوم (SA)، 50٪ (ث / الخامس) أكريلاميد (AA)، 2٪ (ث / ف) N، N′-ميثيلين بياكريلاميد (بيس)، و 29.2٪ (ث / الخامس) كلوريد الصودي?...

<ol>
	<li>Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Far-Field+Optical+Nanoscopy.">Far-Field Optical Nanoscopy.</a> Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).</li><li>Combs, C. A., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy:+A+concise+guide+to+current+imaging+methods.">Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods.</a> Current Protocols in Neuroscience. 79 (1), 2.1.1-2.1.25 (2017).</li><li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy.">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).</li><li>Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy.">Expansion microscopy.</a> Science. 347 (6221), 543-548 (2015).</li><li>Tillberg, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-retention+expansion+microscopy+of+cells+and+tissues+labeled+using+standard+fluorescent+proteins+and+antibodies.">Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies.</a> Nature Biotechnology. 34, 987-992 (2016).</li><li>Chozinski, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy+with+conventional+antibodies+and+fluorescent+proteins.">Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).</li><li>Ku, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+and+scalable+super-resolution+imaging+of+three-dimensional+protein+localization+in+size-adjustable+tissues.">Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).</li><li>Truckenbrodt, S., Maidorn, M., Crzan, D., Wildhagen, H., Kabatas, S., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X10+expansion+microscopy+enables+25-nm+resolution+on+conventional+microscopes.">X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes.</a> EMBO Reports. 19 (9), e45836 (2018).</li><li>Asano, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+Microscopy:+Protocols+for+Imaging+Proteins+and+RNA+in+Cells+and+Tissues.">Expansion Microscopy: Protocols for Imaging Proteins and RNA in Cells and Tissues.</a> Current Protocols in Cell Biology. 80 (1), 1-41 (2018).</li><li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+imaging+of+RNA+with+expansion+microscopy.">Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy.</a> Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).</li><li>Tsanov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SmiFISH+and+FISH-quant+-+A+flexible+single+RNA+detection+approach+with+super-resolution+capability.">SmiFISH and FISH-quant - A flexible single RNA detection approach with super-resolution capability.</a> Nucleic Acids Research. 44 (22), e165 (2016).</li><li>Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+imaging+of+high-density+libraries+of+RNAs+with+MERFISH+and+expansion+microscopy.">Multiplexed imaging of high-density libraries of RNAs with MERFISH and expansion microscopy.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).</li><li>Chang, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+expansion+microscopy.">Iterative expansion microscopy.</a> Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).</li><li>Cipriano, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superabsorbent+hydrogels+that+are+robust+and+highly+stretchable.">Superabsorbent hydrogels that are robust and highly stretchable.</a> Macromolecules. 47 (13), 4445-4452 (2014).</li><li>Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+optimization+in+X10+expansion+microscopy.">A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy.</a> Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+imaging+of+clinical+specimens+using+pathology-optimized+expansion+microscopy.">Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy.</a> Nature Biotechnology. 35 (8), 757-764 (2017).</li></ol>

هنا، نقدم بروتوكول ExPath16، وهو متغير من proExM5 التي يمكن تطبيقها على الأنواع الأكثر شيوعا من عينات خزعة السريرية المستخدمة في علم الأمراض، بما في ذلك FFPE، H & E الملون، والعينات المجمدة حديثا على الشرائح الزجاجية. يتبع تحويل التنسيق واسترجاع المستضد وتلطيخ العينات للع?...

التحقيق في التنظيم الجزيئي للأنسجة في سياق ثلاثي الأبعاد (3D) يمكن أن توفر فهما جديدا للوظائف البيولوجية وتطوير الأمراض. ومع ذلك، فإن هذه البيئات النانومترية تتجاوز قدرات الدقة للمجاهر الانعراج التقليدية المحدودة (200-300 نانومتر)، حيث يتم تعريف الحد الأدنى من المسافة القابلة للحل، d بواسطة d  αי/NA. هنا هو الطول الموجي للضوء وNA هو الفتحة العددية (NA) من نظام التصوير. في الآونة الأخيرة، أصبح التصور المباشر للجزيئات ذات العلامات الفلورية ممكناً من خلال تقنيات التصوير فائقة الدقة المطورة حديثاً1و2و3،بما في ذلك استنفاد الانبعاثات المحفز (STED)، التصوير المنشط التعريب المجهري (PALM)، الفحص المجهري لإعادة البناء البصري العشوائي (STORM)، والفحص المجهري للإضاءة المنظمة (SIM). على الرغم من أن تقنيات التصوير هذه قد أحدثت ثورة في فهم الوظيفة البيولوجية على النطاق النانوي، إلا أنها تعتمد في كثير من الأحيان على معدات باهظة الثمن و/أو متخصصة وخطوات معالجة الصور، يمكن أن يكون لها وقت اقتناء أبطأ مقارنة بـ التصوير البصري التقليدي، تتطلب الفلوروفورس مع خصائص محددة (مثل القدرة على تبديل الصور و / أو ارتفاع استقرار الصورة). وبالإضافة إلى ذلك، لا يزال من الصعب إجراء التصوير ثلاثي الأبعاد فائق الدقة على عينات الأنسجة.
توسيع المجهرية (ExM)، التي أدخلت لأول مرة في عام 20154،ويوفر وسيلة بديلة للتصوير الميزات نانوية (<70 نانومتر) عن طريق توسيع جسديا العينات المحفوظة جزءا لا يتجزأ من هيدروجيل متعدد الكهرباء قابل للتضخم. هنا، يتم تثبيت الجزيئات الحيوية الرئيسية و/أو التسميات في الموقع إلى شبكة بوليمر يمكن توسيعها بالتساوي الموضعي بعد المعالجة الكيميائية. ولأن التوسع المادي يزيد من الدقة الفعالة الكاملة، يمكن عندئذ حل جزيئات الاهتمام باستخدام أنظمة التصوير التقليدية المحدودة الانعراج. منذ نشر البروتوكول الأصلي، حيث تم تثبيت التسميات الفلورية توليفها مخصصة لشبكة البوليمر4،وقد استخدمت استراتيجيات جديدة لإرساء البروتينات مباشرة (الاحتفاظ بالبروتين ExM، أو proExM)5، 6،7،8،9 وRNA9،10،11،12 إلى هيدروجيل، وزيادة التكبير البدني من خلال التكراري التوسع13 أو تكييف هلام الكيمياء8،14،15.
هنا نقدم نسخة مكيفة من proExM، ودعا علم الأمراض التوسع (ExPath)16، والتي تم تحسينها لصيغ علم الأمراض السريرية. يحول البروتوكول العينات السريرية، بما في ذلك البارافين الممزوج بالقطع ى الشكل (FFPE)، والهيماتوكسيلين وإيوسين (H&E) الملون، وعينات الأنسجة البشرية المجمدة الطازجة المثبتة على الشرائح الزجاجية، إلى حالة متوافقة مع ExM. ثم يتم تثبيت البروتينات إلى هيدروجيل ويتم تنفيذ التجانس الميكانيكية (الشكل 1)16. مع التوسع الخطي 4 أضعاف من العينات، يمكن الحصول على صور فائقة الدقة متعددة الألوان (~ 70 نانومتر) باستخدام المجهر البؤري التقليدي وجود فقط قرار ~ 300 نانومتر، ويمكن أيضا أن تكون جنبا إلى جنب مع غيرها من تقنيات التصوير فائقة الدقة.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-hydroxy-TEMPO (4HT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>176141</td>
			<td>Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass)</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P06-1.5H-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>A18-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acryloyl-X, SE (AcX)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A20770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>BP160-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td>Initiatior</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ACTN4 antibody produced in rabbit</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>HPA001873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Collagen IV antibody produced in mouse</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>sc-59814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Vimentin antibody produced in chicken</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab24525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua Hold II hydrophobic pen</td>
			<td>Scientific Device</td>
			<td>980402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breast Common Disease Tissue Array</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab178113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (1 mg/mL)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td>Nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife No. 88 CM</td>
			<td>General Tools</td>
			<td>31116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic 
			acid (EDTA) 0.5 M</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7830-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FFPE Kidney Sample</td>
			<td>USBiomax</td>
			<td>HuFPT072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF488A</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>20020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF633</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>20121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Alexa Fluor 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXbind Staining Medium</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>15253</td>
			<td>Can be substituted with non-commercial staning buffer of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXblock Blocking Medium</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>15252</td>
			<td>Can be substituted with non-commercial blocking buffer of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXwash Washing Medium</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>15254</td>
			<td>Can be substituted with non-commercial washing buffer of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro cover Glass #1 (24x60mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393 106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro cover Glass #1.5 (24x60mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393 251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8242;,N&#8242;- 
			Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td>Accelerator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8242;-Methylenebisacrylamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td>For preparing blocking buffer. Dependent on animal host of secondary antibodies.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>167063</td>
			<td>Multi-well plastic culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon 6-Well Cell Culture Dish</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 15mL&#160;Conical</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>339651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 50mL&#160;Conical</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>339653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint brush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>BP399-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Petri Dish (100 mm)</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K (Molecular Biology Grade)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EO0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>12640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>3457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>3459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acrylate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>408220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate tribasic dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C8532-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat germ agglutinin labeled with CF640R</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>29026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>214736</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nanoscopic imaging of human tissue sections via physical and isotropic expansion

في علم الأمراض الحديثة، المجهرية البصرية يلعب دورا هاما في تشخيص المرض من خلال الكشف عن الهياكل المجهرية للعينات السريرية. ومع ذلك، فإن الحد الأساسي للانعراج البدني يمنع استجواب التشريح النانومتري والتغيرات المرضية الدقيقة عند استخدام نهج التصوير البصري التقليدية. هنا، ونحن نصف بروتوكول بسيط وغير مكلفة، ودعا علم الأمراض التوسع (ExPath)، للتصوير البصري نانوالنطاق من الأنواع الشائعة من عينات الأنسجة الأولية السريرية، بما في ذلك كل من البارافين الثابتة المجمدة أو الرسمية الثابتة جزءا لا يتجزأ من (FFPE) المقاطع. هذه الطريقة تتحايل على حد الانعراج البصري عن طريق تحويل عينات الأنسجة كيميائيا إلى هجين الأنسجة هيدروجيل وتوسيعها جسديا متساوي استوائي عبر جداول متعددة في المياه النقية. بسبب التوسع، يتم فصل جزيئات غير قابلة للحل سابقا، وبالتالي يمكن ملاحظتها باستخدام المجهر البصري التقليدي.

إذا تم تنفيذ البروتوكول بنجاح(الشكل 1)،ستظهر العينات كجل مسطح وشفاف بعد التجانس الميكانيكي(الشكل 3A)ويمكن أن تتوسع بمعامل 3-4.5x في الماء(الشكل 3B)، توفير قرار فعال من ~ 70 نانومتر اعتمادا على عامل التوسع النهائي ونظام التصوير ا?...

Watch this Scientific Journal Video about Nanoscopic Imaging of Human Tissue Sections via Physical and Isotropic Expansion at JoVE.com

Nanoscopic Imaging of Human Tissue Sections via Physical and Isotropic Expansion

التصوير بالنانو لعينات الأنسجة السريرية يمكن أن يحسن فهم مسببات الأمراض. علم أمراض التوسع (ExPath) هو نسخة من الفحص المجهري التوسع (ExM)، المعدلة للتوافق مع عينات الأنسجة السريرية القياسية، لاستكشاف التكوين نانوي النطاق من الجزيئات الحيوية باستخدام المجاهر الانعراج التقليدية محدودة.

التصوير النانوسكوبي لأقسام الأنسجة البشرية عن طريق التوسع البدني والنظائري

In modern pathology, optical microscopy plays an important role in disease diagnosis by revealing microscopic structures of clinical specimens. However, ...

نحن نقدم التوسع علم الأمراض، أو ExPath لفترة قصيرة، وهو مقياس منخفض التكلفة لصورة الجزيئات الحيوية من الفائدة في أقسام الأنسجة السريرية القياسية، مع دقة النانو. يتحايل ExPath على حد الانعراج من المجهر الضوئي التقليدي عن طريق غرس قسم الأنسجة السريرية كيميائيًا مع هيدروجيل قابل للانتفاخ بالماء ، ثم توسيع العينات المعالجة بشكل طبيعي وبنسى بنحو مائة ضعف ، مما يسمح بفصل الجزيئات الحيوية المتراكبة مسبقًا وملاحظةها بمجهر بصري تقليدي. يسمح ExPath للمستخدمين بدراسة تكوينات مقياس النانو للجزيئات الحيوية المرتبطة بالأمراض في عينات الأنسجة ، دون الحاجة إلى الاستثمار في أجهزة التصوير الجديدة.وهكذا ، تمكين رؤى جديدة للمرض وتعزيز التشخيص الجديد. يمكن تطبيق هذه الطريقة على مجموعة واسعة من أنواع الأنسجة واستخدامها لتوفير نظرة جديدة على التسبب في الأمراض المعقدة المختلفة ، مثل السرطان وأمراض الدماغ وأمراض المناعة الذاتية وغيرها. مظاهرة بصرية مهمة لتوضيح كيفية القيام بالخطوات الحاسمة بشكل صحيح، مثل بناء غرفة هلام والتعامل مع عينة هلام قبل وبعد البروتينات K الهضم.ابدأ بتحويل الأنسجة ذات الأهمية إلى تنسيق متوافق مع ExPath. إذا كان العمل مع العينات السريرية FFPE، وضع الشريحة مع العينة في أنبوب مخروطي 50ml وإضافة 15ml من زيلين. اِكب الأنبوب وضعه أفقياً على شاكر مداري في حوالي 60rpm لمدة ثلاث دقائق.كرر الغسيل مع 15 مل أخرى من زيلين. ثم غسل الشريحة في سلسلة من المخففات الإيثانول، وفقا لاتجاهات المخطوطات. إذا كان العمل مع الشرائح الملطخة والمثبتة دائمة، وضع كل شريحة في أنبوب مخروطي 50ml، ثم تغطيته مع زيلين.قم بإزالة زلة الغطاء بعناية بشفرة حلاقة. ثم، معالجة الشريحة بنفس الطريقة التي العينات السريرية FFPE. إذا كان العمل مع الشرائح الأنسجة المجمدة غير المثبتة في حل أكتوبر, إصلاح الأنسجة في الأسيتون في 20 درجة مئوية لمدة عشر دقائق, ثم غسل العينات مع 1X برنامج تلفزيوني حل ثلاث مرات لمدة عشر دقائق لكل غسل.إذا كانت معالجة العينات السريرية الثابتة والمجمدة سابقًا ، اترك الشرائح لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة لإذابة محلول OTC ، ثم اغسل العينة بـ PBS 1X ثلاث مرات ، لمدة خمس دقائق لكل غسيل. بعد تحويل التنسيق، قم بإجراء استرداد antigen على كافة العينات. سخني 20 ميل Citrate من الملليمولار إلى 100 درجة مئوية في الميكروويف ووضع الشريحة في المحلل.نقل فورا الحاوية إلى غرفة حضانة واحتضانها عند درجة حرارة 60 درجة مئوية لمدة ثلاثين دقيقة. لطخة العينة، استخدم قلماً مسعوراً لرسم حدود حول قسم الأنسجة على الشريحة. ضع الشريحة في طبق بتري، ثم احتضان الأنسجة مع عازلة منع لمدة ساعة واحدة في 30 درجة مئوية.ثم، احتضان الأنسجة مع محلول الأجسام المضادة الأولية لمدة ثلاث ساعات على الأقل في درجة حرارة الغرفة أو 37 درجة مئوية. بعد الحضانة، وغسل الأنسجة ثلاث مرات مع العازلة حجب، واحتضان في حل الأجسام المضادة الثانوية لمدة ساعة واحدة على الأقل في درجة حرارة الغرفة، أو 37 درجة مئوية. كرر الغسلات مع العازلة حظر، ثم تنفيذ التصوير الفلورسنت، وذلك باستخدام المجهر مجال واسع التقليدية أو غيرها من نظام التصوير المفضل.إعداد حل الإرساء وفقًا لتعليمات المخطوطات. وضع الشرائح في طبق بتري 100 مل، pipet محلول الرسو على الأنسجة، واحتضانها لمدة ثلاث ساعات على الأقل في درجة حرارة الغرفة. ثم، إعداد حل هلام وفقا لتوجيهات المخطوطات.إزالة فائض محلول الرسو من قسم الأنسجة ووضع الشريحة مرة أخرى في طبق بتري. إضافة محلول الجلاج الباردة الطازجة إلى العينة واحتضان الخليط لمدة ثلاثين دقيقة، في أربع درجات مئوية. لبناء غرفة على الشريحة حول العينة، وخلق الفواصل عن طريق قطع رقيقة من الزجاج غطاء بسكين الماس.تأمين الفواصل على جانبي الأنسجة بالماء ووضع بعناية غطاء الغطاء على الشريحة، مع التأكد من تجنب محاصرة فقاعات الهواء فوق الأنسجة. ثم، احتضان العينة في 37 درجة مئوية في بيئة مرطبة لمدة ساعتين. قم بإزالة غطاء غرفة الهلام عن طريق تمرير شفرة حلاقة بلطف تحت الغطاء ورفعه ببطء عن سطح الجل.تقليم هلام فارغة حول الأنسجة لتقليل حجم، مع التأكد من خفض هلام غير متناظرة لتتبع الاتجاه. تخفيف البروتين K 1-200 في العازلة الهضم، مع التأكد من إعداد حل ما يكفي لغمر تماما هلام. ثم، احتضان العينة مع الحل في حاوية مغلقة لمدة ثلاث ساعات في 60 درجة مئوية.إذا لم تنفصل العينة أثناء عملية الهضم، استخدم شفرة حلاقة لإزالة ذلك بلطف. استخدم فرشاة طلاء ناعمة لنقل العينة إلى 1X PBS في حاوية متوافقة مع نظام التصوير المطلوب وكبير بما يكفي لاستيعاب الجل الموسع بالكامل. غسل العينة في برنامج تلفزيوني لمدة عشر دقائق وإذا رغبت في restain مع 300 ملم DAPI.توسيع العينات عن طريق غسل العينة مع حجم زائد من الماء المقطر مزدوجة ثلاث إلى خمس مرات لمدة عشر دقائق لكل غسل. ثم قم بإجراء التصوير المفلور. إذا تم تنفيذ هذا البروتوكول بنجاح، تظهر العينات كهلام مسطح وشفاف بعد التجانس الميكانيكي ويمكن أن تتوسع بمعامل من 3 إلى 4.5 في الماء.تم توسيع عينة الكلى FFPE سميكة خمسة ميكرومتر 4.5 مرات، مما أدى إلى قرار من 63 نانومتر باستخدام هدف 0.95 NA. ثم تم تحويل الأنسجة إلى شكل التوسع علم الأمراض متوافقة وملطخة بالأجسام المضادة لألفا أكتينين 4 وفيمينتين، DAPI لتصور الحمض النووي، والقمح Germa Glutenin لتسمية الكربوهيدرات. ثم تم استخدام المجهر القرص الغزل confocal لتصوير العينة.ثم تم توسيع أنسجة الكلى بالكامل في الماء وصورت مرة أخرى. يمكن أن يكون التصدع والتشوهات وفقدان الأهداف المسماة نتيجة لعدم كفاية الرسو أو التجانس. تم التعامل مع أنسجة الثدي الطبيعية الملطخة بالهماتيوكسيلين واليوسين على أنها عينة من FFPE ، وتم توسيعها ، وتسميتها مع DAPI ، وصورت على مجهر قرص غزلي.كما تمت معالجة شرائح الكلى غير المثبتة والمجمدة باستخدام هذا البروتوكول. تم إصلاح الأنسجة في الأسيتون البارد وملطخة مع ألفا أكتينين 4، فيمينتين، DAPI، والقمح Germa الغلوتين. عند تنفيذ هذه التقنية، من المهم أن نتذكر توقيت خطوة هلام أمر بالغ الأهمية.يمكن أن يسبب الهلام المبكر تشوهات، ويحد من التوسع ويؤدي إلى فقدان الجزيئات المستهدفة. بعد هذا الإجراء، يمكن إجراء التصوير الفلوري على المجهر بعد الهضم والتوسع في العينة. يمكن تطبيق ExPath على نطاق واسع في كل من الأمراض وخارجها.كما أنه يتيح للباحثين تصور تفاصيل خفية في عينات الأنسجة من الفائدة. ولذلك، فإنه قد يساعد الباحثين على الحصول على رؤى جديدة في التسبب في الأمراض أو آليات العمليات البيولوجية.

Research

JoVE Journal

Medicine

An Orthotopic Glioblastoma Mouse Model Maintaining Brain Parenchymal Physical Constraints and Suitable for Intravital Two-photon Microscopy

ومثلي الأشكال ورم أرومي نموذج الفأر القيود الحفاظ على الدماغ متني البدنية ومناسبة لحيوي داخلي ثنائي الفوتون المجهري

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive form of brain tumors with no curative treatments available to date.
Murine models of this pathology ...

Cerenkov Luminescence Imaging of Interscapular Brown Adipose Tissue

كيرينكوف التلألؤ التصوير من الأنسجة الدهنية بين الكتفين براون

Brown adipose tissue (BAT), widely known as a &#8220;good fat&#8221; plays pivotal roles for thermogenesis in mammals. This special tissue is closely ...

MRI Mapping of Cerebrovascular Reactivity via Gas Inhalation Challenges

MRI رسم خرائط الدماغية التفاعلية عبر استنشاق الغاز التحديات

The brain is a spatially heterogeneous and temporally dynamic organ, with different regions requiring different amount of blood supply at different time. ...

High-definition Fourier Transform Infrared (FT-IR) Spectroscopic Imaging of Human Tissue Sections towards Improving Pathology

High-definition Fourier Transform Infrared FT-IR Spectroscopic Imaging of Human Tissue Sections towards Improving Pathology

عالية الوضوح تحويل فورييه الأشعة تحت الحمراء (FT-IR) طيفية التصوير من أقسام الأنسجة البشرية نحو تحسين علم الأمراض

High-definition Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopic imaging is an emerging approach to obtain detailed images that have associated ...

Human Brown Adipose Tissue Depots Automatically Segmented by Positron Emission Tomography/Computed Tomography and Registered Magnetic Resonance Images

الإنسان براون الدهنية مستودعات الأنسجة مجزأة تلقائيا من قبل البوزيترون البوزيتروني / التصوير المقطعي والرنين المغناطيسي مسجل صور

Reliably differentiating brown adipose tissue (BAT) from other tissues using a non-invasive imaging method is an important step toward studying BAT in ...

A Technique for Subcutaneous Abdominal Adipose Tissue Biopsy via a Non-diathermy Method

تقنية للأنسجة الدهنية تحت الجلد للبطن خزعة عبر أسلوب غير النافذة

Adipose tissue biopsies offer tissue samples that, upon analysis, may provide insightful overviews of mechanisms relating to metabolism and disease. To ...

3D Ultrasound Imaging: Fast and Cost-effective Morphometry of Musculoskeletal Tissue

التصوير بالموجات فوق الصوتية ثلاثية الأبعاد: مورفوميتري سريعة وفعالة من حيث التكلفة لانسجة العضلات والعظام

The developmental goal of 3D ultrasound imaging (3DUS) is to engineer a modality to perform 3D morphological ultrasound analysis of human muscles. 3DUS ...

Whole Body and Regional Quantification of Active Human Brown Adipose Tissue Using 18F-FDG PET/CT

Whole Body and Regional Quantification of Active Human Brown Adipose Tissue Using 18F-FDG PET/CT

الجسم كله والإقليمية الكمي لنشاط الإنسان براون الأنسجة الدهنية باستخدام 18وفدج PET/CT

In endothermic animals, brown adipose tissue (BAT) is activated to produce heat for defending body temperature in response to cold. BAT&#39;s ability to ...

An Enzyme-free Method for Isolation and Expansion of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells

طريقه خاليه من الانزيمات للعزل والتمدد للخلايا الجذعية الدهنية المستمدة من الدهون البشرية

Mesenchymal stem cells (MSCs) are a population of multipotent cells that can be isolated from various adult and fetal tissues, including adipose tissue. ...

Optical Clearing and Imaging of Immunolabeled Kidney Tissue

التطهير البصري والتصوير من أنسجة الكلى المسماة بالمناعة

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) ...