Name: nanoscopic imaging of human tissue sections via physical and isotropic expansion
Uploaded: 2019-09-25T14:45:00
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这项工作得到了卡内基梅隆大学（YZ）的学院创业基金和NIH主任的新创新者奖（DP2 OD025926-01至YZ）的支持。

1. 库存试剂和溶液的制备
<ol><li>
准备凝胶溶液组件。 注：溶液浓度以克/mL（w/v%）表示。<ol>
<li>制作以下库存溶液：38%（w/v）丙烯酸钠（SA），50%（w/v）丙烯酰胺（AA），2%（w/v）N，N，N-甲苯乙酰氨基甲酰胺（Bis），和29.2%（w/v）氯化钠（NaCl）。将化合物溶解在双重去离子水中（ddH2O）。使用表 1中的金额作为参考;准备的解决方案可以根据需要放大或缩小数量?...

<ol>
	<li>Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Far-Field+Optical+Nanoscopy.">Far-Field Optical Nanoscopy.</a> Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).</li><li>Combs, C. A., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy:+A+concise+guide+to+current+imaging+methods.">Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods.</a> Current Protocols in Neuroscience. 79 (1), 2.1.1-2.1.25 (2017).</li><li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy.">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).</li><li>Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy.">Expansion microscopy.</a> Science. 347 (6221), 543-548 (2015).</li><li>Tillberg, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-retention+expansion+microscopy+of+cells+and+tissues+labeled+using+standard+fluorescent+proteins+and+antibodies.">Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies.</a> Nature Biotechnology. 34, 987-992 (2016).</li><li>Chozinski, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy+with+conventional+antibodies+and+fluorescent+proteins.">Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).</li><li>Ku, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+and+scalable+super-resolution+imaging+of+three-dimensional+protein+localization+in+size-adjustable+tissues.">Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).</li><li>Truckenbrodt, S., Maidorn, M., Crzan, D., Wildhagen, H., Kabatas, S., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X10+expansion+microscopy+enables+25-nm+resolution+on+conventional+microscopes.">X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes.</a> EMBO Reports. 19 (9), e45836 (2018).</li><li>Asano, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+Microscopy:+Protocols+for+Imaging+Proteins+and+RNA+in+Cells+and+Tissues.">Expansion Microscopy: Protocols for Imaging Proteins and RNA in Cells and Tissues.</a> Current Protocols in Cell Biology. 80 (1), 1-41 (2018).</li><li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+imaging+of+RNA+with+expansion+microscopy.">Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy.</a> Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).</li><li>Tsanov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SmiFISH+and+FISH-quant+-+A+flexible+single+RNA+detection+approach+with+super-resolution+capability.">SmiFISH and FISH-quant - A flexible single RNA detection approach with super-resolution capability.</a> Nucleic Acids Research. 44 (22), e165 (2016).</li><li>Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+imaging+of+high-density+libraries+of+RNAs+with+MERFISH+and+expansion+microscopy.">Multiplexed imaging of high-density libraries of RNAs with MERFISH and expansion microscopy.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).</li><li>Chang, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+expansion+microscopy.">Iterative expansion microscopy.</a> Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).</li><li>Cipriano, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superabsorbent+hydrogels+that+are+robust+and+highly+stretchable.">Superabsorbent hydrogels that are robust and highly stretchable.</a> Macromolecules. 47 (13), 4445-4452 (2014).</li><li>Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+optimization+in+X10+expansion+microscopy.">A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy.</a> Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+imaging+of+clinical+specimens+using+pathology-optimized+expansion+microscopy.">Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy.</a> Nature Biotechnology. 35 (8), 757-764 (2017).</li></ol>

在这里，我们介绍ExPath协议16，proExM5的变体，可应用于病理学中最常用的临床活检样本类型，包括FFPE、H&E染色和玻璃玻片上新鲜冷冻的标本。标本的格式转换、抗原检索和免疫染色遵循不特定于 ExPath 的常用协议。与原来的proExM协议9不同，ExPath依赖于消化缓冲液中EDTA的更高浓度，这改善了形式固定组织的扩展，如最初的ExPath研?...

在三维（3D）环境下研究组织的分子组织，可以为生物功能和疾病发展提供新的了解。然而，这些纳米级环境超出了传统衍射有限显微镜（200~300nm）的分辨率，其中最小可解距，d由d  +/NA定义。这里*是光的波长，NA是成像系统的数值孔径 （NA）。最近，新开发的超分辨率成像技术1、2、3，包括刺激发射消耗（STED），使荧光标记分子的直接可视化成为可能，光激活定位显微镜 （PALM）、随机光学重建显微镜 （STORM） 和结构化照明显微镜 （SIM）。尽管这些成像技术彻底改变了对纳米尺度生物功能的理解，但实际上，它们往往依赖于昂贵的和/或专门的设备和图像处理步骤，与传统的光学成像，需要具有特定特性（如光切换能力和/或高光稳定性）的荧光光道。此外，在组织标本上执行 3D 超分辨率成像仍是一项挑战。
膨胀显微镜 （ExM） 于 2015 年首次推出4，通过物理膨胀嵌入在可膨胀聚电解质水凝胶中的保存样品，提供了成像纳米尺度特征（<70 nm）的替代方法。在这里，关键生物分子和/或标签原位固定在聚合物网络中，在化学处理后可以异位扩展。由于物理膨胀提高了总有效分辨率，因此可以使用传统的衍射限制成像系统解决感兴趣的分子。自原始协议发布以来，定制合成荧光标签被固定在聚合物网络4上，新的策略被用来直接锚定蛋白质（蛋白质保留ExM，或proExM）5， 6、7、8、9和 RNA9、10、11、12到水凝胶，并通过迭代增加物理放大倍率膨胀13或适应凝胶化学8，14，15。
在这里，我们提出了proExM的改编版本，称为扩张病理学（ExPath）16，它已被优化的临床病理格式。该协议将临床样本（包括正式固定石蜡嵌入 （FFPE）、血氧林和 eosin （H&E） 染色，以及安装在玻璃幻灯片上的新鲜冷冻人体组织标本转换为与 ExM 兼容的状态。蛋白质然后锚定在水凝胶和机械均质执行 （图 1）16.通过样品4倍线性扩展，可以使用分辨率仅为±300 nm的传统共聚焦显微镜获得多色超分辨率（±70 nm）图像，还可以与其他超分辨率成像技术相结合。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-hydroxy-TEMPO (4HT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>176141</td>
			<td>Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass)</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P06-1.5H-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>A18-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acryloyl-X, SE (AcX)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A20770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>BP160-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td>Initiatior</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ACTN4 antibody produced in rabbit</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>HPA001873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Collagen IV antibody produced in mouse</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>sc-59814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Vimentin antibody produced in chicken</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab24525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua Hold II hydrophobic pen</td>
			<td>Scientific Device</td>
			<td>980402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breast Common Disease Tissue Array</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab178113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (1 mg/mL)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td>Nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife No. 88 CM</td>
			<td>General Tools</td>
			<td>31116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic 
			acid (EDTA) 0.5 M</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7830-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FFPE Kidney Sample</td>
			<td>USBiomax</td>
			<td>HuFPT072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF488A</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>20020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF633</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>20121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Alexa Fluor 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXbind Staining Medium</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>15253</td>
			<td>Can be substituted with non-commercial staning buffer of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXblock Blocking Medium</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>15252</td>
			<td>Can be substituted with non-commercial blocking buffer of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXwash Washing Medium</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>15254</td>
			<td>Can be substituted with non-commercial washing buffer of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro cover Glass #1 (24x60mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393 106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro cover Glass #1.5 (24x60mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393 251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8242;,N&#8242;- 
			Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td>Accelerator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8242;-Methylenebisacrylamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td>For preparing blocking buffer. Dependent on animal host of secondary antibodies.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>167063</td>
			<td>Multi-well plastic culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon 6-Well Cell Culture Dish</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 15mL&#160;Conical</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>339651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 50mL&#160;Conical</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>339653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint brush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>BP399-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Petri Dish (100 mm)</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K (Molecular Biology Grade)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EO0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>12640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>3457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>3459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acrylate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>408220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate tribasic dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C8532-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat germ agglutinin labeled with CF640R</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>29026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>214736</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nanoscopic imaging of human tissue sections via physical and isotropic expansion

在现代病理学中，光学显微镜通过揭示临床标本的微观结构在疾病诊断中起着重要的作用。然而，在使用传统的光学成像方法时，基本的物理衍射极限可以防止对纳米级解剖学和细微的病理变化进行询问。在这里，我们描述了一种简单而廉价的方案，称为扩张病理学（ExPath），用于常见类型的临床初级组织标本的纳米级光学成像，包括固定冷冻或形式固定石蜡嵌入（FFPE）组织部分。该方法通过化学化地将组织样品转化为组织水凝胶杂交，并在纯水中的多个尺度上物理地将其向各向异性扩展，从而规避了光学衍射极限。由于膨胀，以前无法解析的分子被分离，因此可以使用传统的光学显微镜进行观察。

如果协议已成功执行（图1），样品在机械均质化后将显示为扁平和透明的凝胶（图3A），在水中可膨胀3~4.5倍（图3B）。根据最终膨胀因子和成像系统使用5，16，提供±70 nm的有效分辨率。图 4显示了使用 ExPath 协议处理的 5 μm 厚 FFPE 肾脏样...

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Nanoscopic Imaging of Human Tissue Sections via Physical and Isotropic Expansion

临床组织样本的纳米成像可以增进对疾病发病机制的认识。扩张病理学 （ExPath） 是扩展显微镜 （ExM） 的一个版本，经过修改，与标准临床组织样本兼容，使用传统的衍射受限显微镜探索生物分子的纳米级配置。

通过物理和各向异性扩张对人体组织部分的纳米成像

In modern pathology, optical microscopy plays an important role in disease diagnosis by revealing microscopic structures of clinical specimens. However, ...

我们提出扩展病理学，或EPath，简言之，一种低成本的测量，以图像生物分子感兴趣的标准临床组织部分，纳米级精度。ExPath 通过化学注入临床组织部分的水膨胀水凝胶，然后物理和均匀地将处理过的样品扩大约一百倍，从而规避传统光显微镜的衍射极限，允许用传统的光学显微镜分离和观察以前重叠的荧光标记生物分子。ExPath 允许用户在组织样本中研究与疾病相关的生物分子的纳米比例配置，而无需投资新的成像硬件。因此，使新的疾病见解和培养新的诊断。该方法可应用于多种组织类型，并用于对各种复杂疾病（如癌症、脑病、自身免疫性疾病等）的发病机制提供新的见解。视觉演示对于说明如何正确执行关键步骤非常重要，例如凝胶室的构造和蛋白酶 K 消化之前和之后处理凝胶样品。首先将感兴趣的组织转换为 ExPath 兼容格式。如果使用 FFPE 临床样品，将幻灯片与样品一起放在 50ml 锥形管中，然后加入 15ml 的 Zylene。盖住管子，以大约60rpm的水平放在轨道摇床上三分钟。再用15毫升的日烯重复洗涤。然后根据手稿指示，在一系列乙醇稀释中清洗幻灯片。如果使用染色和安装的永久滑轨，请将每张幻灯片放在 50 毫升锥形管中，然后用 Zylene 盖住它。用剃须刀小心地拆下盖滑。然后，以与 FFPE 临床样本相同的方式处理幻灯片。如果使用 OCT 溶液中的未固定冷冻组织幻灯片，在 20 摄氏度下将组织在 20 摄氏度下固定 10 分钟，然后用 1X PBS 溶液清洗样品三次，每次洗涤 10 分钟。如果处理以前固定的和冷冻的临床样品，在室温下将幻灯片留两分钟以熔化OTC溶液，然后用1X PBS洗涤样品三次，每次洗涤5分钟。格式转换后，对所有样本执行抗原检索。在微波炉中将 20 毫摩尔柠檬酸盐溶液加热至 100 摄氏度，然后将幻灯片放在溶液中。立即将容器转移到孵化室，并在60摄氏度下孵育30分钟。要弄脏样品，请使用疏水笔在幻灯片上的组织部分周围绘制边界。将幻灯片放在培养皿中，然后在30摄氏度下用阻塞缓冲液孵育组织一小时。然后，在室温或摄氏37度下用原抗体溶液孵育组织至少三小时。孵育后，用阻断缓冲液洗组织三次，在室温下至少孵育一小时，即37摄氏度。使用阻塞缓冲器重复洗涤，然后使用传统的宽场显微镜或其他首选成像系统进行荧光成像。根据手稿说明准备锚定解决方案。将幻灯片放在100毫升的培养皿中，将锚定溶液移液在组织上，并在室温下孵育至少3小时。然后，根据手稿说明准备凝胶溶液。从组织部分去除多余的锚定溶液，然后将幻灯片放回培养皿中。在样品中加入新鲜的冷凝胶溶液，在摄氏四度下孵育混合物30分钟。要围绕样品在幻灯片上构造一个腔室，请用金刚石刀薄切覆盖玻璃片来创建空间。将空间器放在组织两侧的两侧，并小心地在幻灯片上放置盖玻璃盖，确保避免将气泡困在组织上。然后，在37摄氏度的加湿环境中孵育样品两个小时。轻轻滑动盖玻片下，轻轻将凝胶室的盖子从凝胶表面提起，然后将其从凝胶表面提起。修剪组织周围的空白凝胶，以尽量减少体积，确保不对称地切割凝胶以跟踪方向。稀释蛋白酶K一到两百在消化缓冲液，确保准备足够的溶液，完全淹没凝胶。然后，在60摄氏度下用溶液在封闭的容器中孵育样品3小时。如果样品在消化过程中未分离，请使用剃须刀刀片轻轻取出。使用柔软的油漆刷将试样转移到与所需成像系统兼容的容器中的 1X PBS 中，并且足够大，足以容纳完全膨胀的凝胶。在 PBS 中清洗样品 10 分钟，如果需要，请用 300 毫摩尔 DAPI 进行洗涤。通过用过量的双蒸馏水洗涤样品来扩大样品，每次洗涤时间为 10 分钟。用双蒸馏水进行三到五次清洗。然后，进行荧光成像。如果此协议执行成功，样品在机械均质后显示为扁平透明凝胶，在水中可膨胀 3 到 4.5。五微米厚的FFPE肾样被扩大4.5倍，结果分辨率为63纳米，使用0.95 NA目标。然后，组织被转换成扩张病理学兼容格式，并染色的抗体阿尔法阿平辛4和维门丁，DAPI可视化核DNA，小麦格玛麸质素标签碳水化合物。然后，旋转圆盘共微显微镜用于成像标本。肾脏组织然后完全膨胀在水中，并再次成像。标记目标的开裂、变形和丢失可能是锚定或均质不充分的结果。赤氧树脂和 eosin 染色正常乳房组织被视为 FFPE 样本，展开，标有 DAPI，并在旋转的光盘共合显微镜上成像。未固定和冷冻的肾脏切片也使用该协议进行处理。组织固定在冷丙酮中，并染有阿尔法·阿皮宁4、维门丁、DAPI和小麦格玛·麸质素。执行此技术时，重要的是要记住凝胶步骤的计时至关重要。过早凝胶会导致变形、限制膨胀并导致目标分子的丢失。按照此程序，在消化和膨胀样品后，可以在显微镜上进行荧光成像。ExPath 可广泛应用于病理学和其他方面。因为它使研究人员能够直观地看到感兴趣的组织样本中的微妙细节。因此，它可以帮助研究人员获得新的见解，疾病的发病机制或生物过程的机制。

Research

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