Name: nanoscopic imaging of human tissue sections via physical and isotropic expansion
Uploaded: 2019-09-25T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nanoscopic Imaging of Human Tissue Sections via Physical and Isotropic Expansion at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af fakultetets opstartsfond fra Carnegie Mellon University (YZ) og NIH Director's nye innovator Award (DP2 OD025926-01 til YZ).

1. klargøring af Stam reagenser og-opløsninger
<ol><li>
Klargør komponenter til gelerings-løsninger. Bemærk: opløsning koncentrationer er angivet i g/ml (w/v procent).<ol>
<li>Lav følgende stamopløsninger: 38% (w/v) natriumacrylat (SA), 50% (w/v) acrylamid (AA), 2% (w/v) N, N′-methylenebisacrylamid (BIS) og 29,2% (w/v) natriumchlorid (NaCl). Forbindelserne opløses i dobbelt deioniseret vand (ddH2O). Bruge beløbene i tabel 1 som reference forberedte løsninger ...

<ol>
	<li>Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Far-Field+Optical+Nanoscopy.">Far-Field Optical Nanoscopy.</a> Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).</li><li>Combs, C. A., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy:+A+concise+guide+to+current+imaging+methods.">Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods.</a> Current Protocols in Neuroscience. 79 (1), 2.1.1-2.1.25 (2017).</li><li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy.">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).</li><li>Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy.">Expansion microscopy.</a> Science. 347 (6221), 543-548 (2015).</li><li>Tillberg, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-retention+expansion+microscopy+of+cells+and+tissues+labeled+using+standard+fluorescent+proteins+and+antibodies.">Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies.</a> Nature Biotechnology. 34, 987-992 (2016).</li><li>Chozinski, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy+with+conventional+antibodies+and+fluorescent+proteins.">Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).</li><li>Ku, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+and+scalable+super-resolution+imaging+of+three-dimensional+protein+localization+in+size-adjustable+tissues.">Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).</li><li>Truckenbrodt, S., Maidorn, M., Crzan, D., Wildhagen, H., Kabatas, S., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X10+expansion+microscopy+enables+25-nm+resolution+on+conventional+microscopes.">X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes.</a> EMBO Reports. 19 (9), e45836 (2018).</li><li>Asano, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+Microscopy:+Protocols+for+Imaging+Proteins+and+RNA+in+Cells+and+Tissues.">Expansion Microscopy: Protocols for Imaging Proteins and RNA in Cells and Tissues.</a> Current Protocols in Cell Biology. 80 (1), 1-41 (2018).</li><li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+imaging+of+RNA+with+expansion+microscopy.">Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy.</a> Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).</li><li>Tsanov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SmiFISH+and+FISH-quant+-+A+flexible+single+RNA+detection+approach+with+super-resolution+capability.">SmiFISH and FISH-quant - A flexible single RNA detection approach with super-resolution capability.</a> Nucleic Acids Research. 44 (22), e165 (2016).</li><li>Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+imaging+of+high-density+libraries+of+RNAs+with+MERFISH+and+expansion+microscopy.">Multiplexed imaging of high-density libraries of RNAs with MERFISH and expansion microscopy.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).</li><li>Chang, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+expansion+microscopy.">Iterative expansion microscopy.</a> Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).</li><li>Cipriano, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superabsorbent+hydrogels+that+are+robust+and+highly+stretchable.">Superabsorbent hydrogels that are robust and highly stretchable.</a> Macromolecules. 47 (13), 4445-4452 (2014).</li><li>Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+optimization+in+X10+expansion+microscopy.">A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy.</a> Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+imaging+of+clinical+specimens+using+pathology-optimized+expansion+microscopy.">Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy.</a> Nature Biotechnology. 35 (8), 757-764 (2017).</li></ol>

Her præsenterer vi ExPath Protocol16, en variant af proExM5 , der kan anvendes på de mest almindeligt forekommende typer af kliniske biopsiprøver, der anvendes i PATOLOGI, herunder ffpe, H & E farvede, og fersk frosne prøver på glas skred. Format konvertering, antigen hentning og immunofarvning af prøverne følger almindeligt anvendte protokoller, der ikke er specifikke for ExPath. I modsætning til den oprindelige proExM protokol9, er expath a...

Undersøge den molekylære organisering af væv i en tredimensionel (3D) kontekst kan give ny forståelse af biologiske funktioner og sygdomsudvikling. Disse nanoskala-miljøer ligger dog uden for opløsnings mulighederne i konventionelle diffraktions begrænsede mikroskoper (200 − 300 nm), hvor den minimale afstand, d er afgrænset af d α  λ/na. Her λ er lysets bølgelængde og na er den numeriske blænde (Na) af billed systemet. For nylig er direkte visualisering af fluorescently mærkede molekyler blevet muliggjort af nyudviklede super opløsnings billedbehandlings teknikker1,2,3, herunder stimuleret udtynding af udledningen (sted), foto-aktiveret lokalisering mikroskopi (PALM), stokastiske optisk genopbygning mikroskopi (STORM), og struktureret belysning mikroskopi (SIM). Selv om disse billeddiagnostiske teknikker har revolutioneret forståelsen af biologisk funktion på nanoskalaen, i praksis, de ofte er afhængige af dyre og/eller specialiseret udstyr og billedbehandling trin, kan have langsommere erhvervelse tid sammenlignet med konventionel optisk billeddannelse, kræver fluorophorer med særlige karakteristika (såsom foto-switching kapacitet og/eller høj foto stabilitet). Desuden er det fortsat en udfordring at udføre 3D super-resolution Imaging på vævsprøver.
Udvidelses mikroskopi (ExM), der først blev introduceret i 20154, giver et alternativt middel til nanoskala funktioner (< 70 nm) ved fysisk ekspanderende konserverede prøver indlejret i en swellable polyelektrolyt hydrogel. Her er vigtige biomolekyler og/eller etiketter forankret på stedet til et polymer netværk, der kan udvides isotopisk efter kemisk behandling. Fordi den fysiske ekspansion øger den samlede effektive opløsning, kan molekyler af interesse derefter løses ved hjælp af konventionelle diffraktion-begrænsede billedbehandlingssystemer. Siden offentliggørelsen af den oprindelige protokol, hvor brugerdefinerede syntetiseret fluorescerende etiketter blev forankret til polymer netværk4, nye strategier er blevet brugt til direkte anker proteiner (protein retention exm, eller proexm)5, 6,7,8,9 og RNA9,10,11,12 til hydrogel, og øge fysiske forstørrelse gennem iterativ udvidelse13 eller tilpasning af gel-kemi8,14,15.
Her præsenterer vi en tilpasset version af proExM, kaldet ekspansion patologi (ExPath)16, som er blevet optimeret til kliniske patologiske formater. Protokollen omdanner kliniske prøver, herunder formalin-fast paraffin-indlejret (FFPE), hematoxylinlegemer og eosin (H & E) farvede, og fersk frosne humane vævsprøver monteret på glas glider, ind i en tilstand, der er kompatibel med ExM. Proteiner er derefter forankret til hydrogel og mekanisk homogenisering udføres (figur 1)16. Med en 4-fold lineær udvidelse af prøverne, Flerfarvet super opløsning (~ 70 nm) billeder kan opnås ved hjælp af en konventionel Konfokal mikroskop har kun en ~ 300 Nm opløsning og kan også kombineres med andre super-resolution Imaging teknikker.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-hydroxy-TEMPO (4HT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>176141</td>
			<td>Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass)</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P06-1.5H-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>A18-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acryloyl-X, SE (AcX)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A20770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>BP160-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td>Initiatior</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ACTN4 antibody produced in rabbit</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>HPA001873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Collagen IV antibody produced in mouse</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>sc-59814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Vimentin antibody produced in chicken</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab24525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua Hold II hydrophobic pen</td>
			<td>Scientific Device</td>
			<td>980402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breast Common Disease Tissue Array</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab178113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (1 mg/mL)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td>Nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife No. 88 CM</td>
			<td>General Tools</td>
			<td>31116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic 
			acid (EDTA) 0.5 M</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7830-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FFPE Kidney Sample</td>
			<td>USBiomax</td>
			<td>HuFPT072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF488A</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>20020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF633</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>20121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Alexa Fluor 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXbind Staining Medium</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>15253</td>
			<td>Can be substituted with non-commercial staning buffer of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXblock Blocking Medium</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>15252</td>
			<td>Can be substituted with non-commercial blocking buffer of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXwash Washing Medium</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>15254</td>
			<td>Can be substituted with non-commercial washing buffer of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro cover Glass #1 (24x60mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393 106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro cover Glass #1.5 (24x60mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393 251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8242;,N&#8242;- 
			Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td>Accelerator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8242;-Methylenebisacrylamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td>For preparing blocking buffer. Dependent on animal host of secondary antibodies.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>167063</td>
			<td>Multi-well plastic culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon 6-Well Cell Culture Dish</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 15mL&#160;Conical</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>339651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 50mL&#160;Conical</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>339653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint brush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>BP399-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Petri Dish (100 mm)</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K (Molecular Biology Grade)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EO0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>12640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>3457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>3459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acrylate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>408220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate tribasic dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C8532-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat germ agglutinin labeled with CF640R</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>29026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>214736</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nanoscopic imaging of human tissue sections via physical and isotropic expansion

I moderne patologi, Optisk mikroskopi spiller en vigtig rolle i sygdoms diagnose ved at afsløre mikroskopiske strukturer af kliniske prøver. Men den grundlæggende fysiske diffraktion grænse forhindrer forhør af nanoskala anatomi og subtile patologiske forandringer, når du bruger konventionelle optiske Imaging tilgange. Her beskriver vi en enkel og billig protokol, kaldet ekspansions patologi (ExPath), til optisk billeddannelse i nanoskala af almindeligt forekommende typer af kliniske primær vævsprøver, herunder både fastfrosset eller formalin-fast paraffinindlejret (FFPE) væv Sektioner. Denne metode omgår den optiske diffraktions grænse ved kemisk omdannelse af vævsprøverne til vævs-hydrogel hybrid og fysisk udvidelse af dem isotropisk på tværs af flere skalaer i rent vand. På grund af ekspansion adskilles tidligere opløselige molekyler og kan derfor observeres ved hjælp af et konventionelt optisk mikroskop.

Hvis protokollen er gennemført med succes (figur 1), vil prøverne fremstå som en flad og transparent gel efter mekanisk homogenisering (figur 3a) og kan udvides med en faktor på 3 − 4,5 x i vand (figur 3B) giver en effektiv opløsning på ~ 70 nm afhængigt af den endelige ekspansions faktor og Imaging system, der anvendes5,16. <strong...

Watch this Scientific Journal Video about Nanoscopic Imaging of Human Tissue Sections via Physical and Isotropic Expansion at JoVE.com

Nanoscopic Imaging of Human Tissue Sections via Physical and Isotropic Expansion

Nanoskala-billeddannelse af kliniske vævsprøver kan forbedre forståelsen af sygdoms patogenesen. Ekspansion patologi (expath) er en version af ekspansion mikroskopi (exm), modificeret for kompatibilitet med standard kliniske vævsprøver, at udforske nanoskala konfiguration af biomolekyler ved hjælp af konventionelle diffraktion begrænset mikroskoper.

Nanoskopisk billeddannelse af humane vævs sektioner via fysisk og isotropisk ekspansion

In modern pathology, optical microscopy plays an important role in disease diagnosis by revealing microscopic structures of clinical specimens. However, ...

Vi præsenterer ekspansion patologi, eller ExPath for korte, en lav pris foranstaltning til billede biomolekyle af interesse i standard kliniske væv sektioner, med nanoskala præcision. ExPath omgår diffraktionsgrænsen for konventionel lysmikroskopi ved kemisk at tilføre det kliniske vævsafsnit med en vandrøverbar hydrogel og derefter fysisk og jævnt udvide de behandlede prøver med omkring hundrede gange, så tidligere overlappende fluorescerende mærkede biomolekyler kan adskilles og observeres med et konventionelt optisk mikroskop. ExPath giver brugerne mulighed for at studere nanoskalakonfigurationer af sygdomsrelaterede biomolekyler i vævsprøver uden at skulle investere i ny billedbehandlingshardware.Således giver nye indsigter af sygdommen og fremme ny diagnose. Denne metode kan anvendes på en bred vifte af vævstyper og bruges til at give ny indsigt i patogenesen af forskellige komplekse sygdomme, såsom kræft, hjernesygdom, auto-immun sygdom, og andre. Visuel demonstration er vigtig for at illustrere, hvordan man gør de kritiske trin ordentligt, såsom konstruktion af geleringskammeret og håndtering af geleret prøve før og efter Proteinase K fordøjelsen.Start med at konvertere det interessevæv til et ExPath-kompatibelt format. Hvis der arbejdes med kliniske FFPE-prøver, skal du placere rutsjebanen sammen med prøven i et 50 ml konisk rør og tilsætte 15 ml Zylene. Hætten af røret og læg det vandret på en orbital shaker på ca. 60 omdr./min. i tre minutter.Vasken gentages med yderligere 15 ml Zylene. Vask derefter diaset i en række ethanolfortyndinger, i henhold til manuskript retninger. Hvis du arbejder med farvede og monterede permanente objektglas, skal du placere hvert dias i et 50 ml konisk rør og derefter dække det med Zylene.Fjern forsigtigt dækslet med et barberblad. Beting derefter diaset på samme måde som FFPE kliniske prøver. Hvis der arbejdes med ufikserede frosne vævsdias i OCT-opløsning, fastgørs vævet i acetone ved 20 grader Celsius i ti minutter, og prøverne vaskes derefter med 1X PBS-opløsning tre gange i ti minutter pr. vask.Hvis der forarbejdes tidligere faste og frosne kliniske prøver, skal objektglassene efterlades i to minutter ved stuetemperatur for at smelte OTC-opløsningen, hvor prøven vaskes tre gange tre gange i fem minutter pr. vask. Efter format konvertering, udføre antigen hentning på alle prøver. Varm 20 millimolar Citratopløsning til 100 grader Celsius i en mikrobølgeovn og placer diaset i opløsningen.Straks overføre beholderen til et inkubationskammer og inkubere den ved 60 grader Celsius i tredive minutter. For at plette prøven skal du bruge en hydrofob pen til at tegne en grænse omkring vævssektionen på diaset. Placer dias i en petriskål, derefter inkubere vævet med blokering buffer i en time ved 30 grader Celsius.Derefter inkuberes vævene med den primære antistofopløsning i mindst tre timer ved stuetemperatur eller 37 grader Celsius. Efter inkubationen vaskes vævet tre gange med blokerende buffer, og det inkuberes i sekundær antistofopløsning i mindst en time ved stuetemperatur eller 37 grader Celsius. Gentag vaskene med blokeringsbufferen, og udfør derefter fluorescerende billeddannelse ved hjælp af et konventionelt wide-field mikroskop eller et andet billedsystem, der er af valg.Forbered forankringsløsningen i henhold til manuskriptinstruktioner. Objektglassene hældes i en 100 ml petriskål, forankringsopløsningen pipetteres over vævet, og de inkuberes i mindst tre timer ved stuetemperatur. Derefter forberede gelering løsning i henhold til manuskript retninger.Fjern overskydende forankringsopløsning fra vævssektionen, og placer slidsen tilbage i petriskålen. Tilsæt frisk kold gelering opløsning til prøven og inkubere blandingen i tredive minutter, ved fire grader Celsius. For at konstruere et kammer på diaset omkring prøven, skabe afstandsstykker ved tyndt skære stykker af dækglas med en diamant kniv.Fastgør afstandserne på hver side af vævet med vand og læg forsigtigt et dækglaslåg over diaset, og sørg for at undgå at fange luftbobler over vævet. Derefter inkubere prøven ved 37 grader Celsius i et befugtet miljø i to timer. Fjern låget af geleringskammeret ved forsigtigt at skubbe et barberblad under dækslet og langsomt løfte det væk fra geloverfladen.Trim den tomme gel omkring vævet for at minimere volumen, og sørg for at skære gelen asymmetrisk for at spore orienteringen. Fortynd proteinase K et til to hundrede i fordøjelsesbuffer, og sørg for at forberede nok opløsning til helt at nedsænke gelen. Derefter inkuberes prøven med opløsningen i en lukket beholder i tre timer ved 60 grader Celsius.Hvis prøven ikke løsner sig under fordøjelsen, skal du bruge et barberblad til forsigtigt at fjerne det. Brug en blød pensel til at overføre prøven til 1X PBS i en beholder, der er kompatibel med det ønskede billedsystem og stort nok til at rumme den fuldt udvidede gel. Prøven vaskes i PBS i ti minutter, og hvis det ønskes, skal den hviles med 300 millimolar DAPI.Prøverne udvid ved at vaske prøven med et overskydende volumen dobbeltdestilleret vand tre til fem gange i ti minutter pr. vask. Derefter udføre fluorescens billeddannelse. Hvis denne protokol udføres med succes, vises prøver som en flad og gennemsigtig gel efter mekanisk homogenisering og kan udvides med en faktor på 3 til 4,5 i vand.En fem mikrometer tyk FFPE nyre prøve blev udvidet 4,5 gange, hvilket resulterede i en opløsning på 63 nanometer ved hjælp af en 0,95 NA mål. Vævet blev derefter omdannet til en ekspansion patologi kompatibelt format og farves med antistoffer for Alpha Actinin 4 og Vimentin, DAPI at visualisere nukleare DNA, og Hvede Germa Glutenin at mærke kulhydrater. Spinning disc confocal mikroskopi blev derefter brugt til at billedet prøven.Nyrevævet blev derefter fuldt udvidet i vand og afbildet igen. Revner, forvrængninger og tab af mærkede mål kan være resultatet af utilstrækkelig forankring eller homogenisering. Hematoxylin og eosin farves normalt brystvæv blev behandlet som en FFPE prøve, udvidet, mærket med DAPI, og afbildet på en roterende disk konfokal mikroskop.Ikke-fastgjorte og frosne nyreskiver blev også behandlet ved hjælp af denne protokol. Vævet blev fastsat i kold acetone og farves med Alpha Actinin 4, Vimentin, DAPI og Hvede Germa Glutenin. Når du udfører denne teknik, er det vigtigt at huske timingen af geleringstrinnet er kritisk.For tidlig gelering kan forårsage forvrængninger, begrænse ekspansion og resultere i tab af målmolekyler. Efter denne procedure kan fluorescerende billeddannelse udføres på et mikroskop efter fordøjelsen og udvidelse af prøven. ExPath kan anvendes bredt i både patologier og andre steder.Da det gør det muligt for forskere at visualisere subtile detaljer i vævsprøver af interesse. Derfor kan det hjælpe forskere til at få ny indsigt i patogenesen af sygdomme eller mekanismer af biologiske processer.

Research

JoVE Journal

Medicine

An Orthotopic Glioblastoma Mouse Model Maintaining Brain Parenchymal Physical Constraints and Suitable for Intravital Two-photon Microscopy

En ortotopisk Glioblastoma Mouse Model Fastholdelse Brain Parenkymalt fysiske begrænsninger og velegnet til Intravital To-foton mikroskopi

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive form of brain tumors with no curative treatments available to date.
Murine models of this pathology ...

Cerenkov Luminescence Imaging of Interscapular Brown Adipose Tissue

Cerenkov Luminescence Imaging af interscapular brunt fedtvæv

Brown adipose tissue (BAT), widely known as a &#8220;good fat&#8221; plays pivotal roles for thermogenesis in mammals. This special tissue is closely ...

MRI Mapping of Cerebrovascular Reactivity via Gas Inhalation Challenges

MRI Kortlægning af cerebrovaskulær Reaktivitet via Gas Indånding Udfordringer

The brain is a spatially heterogeneous and temporally dynamic organ, with different regions requiring different amount of blood supply at different time. ...

High-definition Fourier Transform Infrared (FT-IR) Spectroscopic Imaging of Human Tissue Sections towards Improving Pathology

High-definition Fourier Transform Infrared FT-IR Spectroscopic Imaging of Human Tissue Sections towards Improving Pathology

High-definition Fourier Transform Infrared (FT-IR) Spectroscopic Imaging of Human vævssnit til forbedring Patologi

High-definition Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopic imaging is an emerging approach to obtain detailed images that have associated ...

Human Brown Adipose Tissue Depots Automatically Segmented by Positron Emission Tomography/Computed Tomography and Registered Magnetic Resonance Images

Menneskelig brunt fedtvæv Depoter automatisk segmenteret efter Positron Emission Tomography / Computed Tomography og registreret magnetisk resonans Images

Reliably differentiating brown adipose tissue (BAT) from other tissues using a non-invasive imaging method is an important step toward studying BAT in ...

A Technique for Subcutaneous Abdominal Adipose Tissue Biopsy via a Non-diathermy Method

En teknik til subkutan Abdominal fedtvæv biopsi via en ikke-Diatermi metode

Adipose tissue biopsies offer tissue samples that, upon analysis, may provide insightful overviews of mechanisms relating to metabolism and disease. To ...

3D Ultrasound Imaging: Fast and Cost-effective Morphometry of Musculoskeletal Tissue

3D ultralyd billedbehandling: hurtig og omkostningseffektiv morfometri bevægeapparatet væv

The developmental goal of 3D ultrasound imaging (3DUS) is to engineer a modality to perform 3D morphological ultrasound analysis of human muscles. 3DUS ...

Whole Body and Regional Quantification of Active Human Brown Adipose Tissue Using 18F-FDG PET/CT

Whole Body and Regional Quantification of Active Human Brown Adipose Tissue Using 18F-FDG PET/CT

Hele kroppen og regionale kvantificering af aktive menneskelige brunt fedtvæv bruger 18F-FDG PET/CT

In endothermic animals, brown adipose tissue (BAT) is activated to produce heat for defending body temperature in response to cold. BAT&#39;s ability to ...

An Enzyme-free Method for Isolation and Expansion of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells

En enzym-fri metode til isolering og udvidelse af humane Adipose-afledte mesenchymale stamceller

Mesenchymal stem cells (MSCs) are a population of multipotent cells that can be isolated from various adult and fetal tissues, including adipose tissue. ...

Optical Clearing and Imaging of Immunolabeled Kidney Tissue

Optisk clearing og billeddannelse af Immunolabeled nyre væv

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) ...