Name: nanoscopic imaging of human tissue sections via physical and isotropic expansion
Uploaded: 2019-09-25T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nanoscopic Imaging of Human Tissue Sections via Physical and Isotropic Expansion at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door het faculteits startfonds van de Carnegie Mellon University (YZ) en de nieuwe Innovator Award van NIH Director (DP2 OD025926-01 tot YZ).

1. bereiding van voorraad reagentia en-oplossingen
<ol><li>
De onderdelen van de geleer-oplossing voorbereiden. Opmerking: oplossings concentraties worden gegeven in g/ml (w/v-percentage).<ol>
<li>Maak de volgende stockoplossingen: 38% (w/v) natriumacrylaat (SA), 50% (w/v) acrylamide (AA), 2% (w/v) N, N′-methyleenebisacrylamide (bis) en 29,2% (w/v) natriumchloride (NaCl). Los de verbindingen op in dubbel gedeïoniseerd water (ddH2O). De bedragen in tabel 1 als referenti...

<ol>
	<li>Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Far-Field+Optical+Nanoscopy.">Far-Field Optical Nanoscopy.</a> Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).</li><li>Combs, C. A., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy:+A+concise+guide+to+current+imaging+methods.">Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods.</a> Current Protocols in Neuroscience. 79 (1), 2.1.1-2.1.25 (2017).</li><li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy.">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).</li><li>Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy.">Expansion microscopy.</a> Science. 347 (6221), 543-548 (2015).</li><li>Tillberg, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-retention+expansion+microscopy+of+cells+and+tissues+labeled+using+standard+fluorescent+proteins+and+antibodies.">Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies.</a> Nature Biotechnology. 34, 987-992 (2016).</li><li>Chozinski, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy+with+conventional+antibodies+and+fluorescent+proteins.">Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).</li><li>Ku, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+and+scalable+super-resolution+imaging+of+three-dimensional+protein+localization+in+size-adjustable+tissues.">Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).</li><li>Truckenbrodt, S., Maidorn, M., Crzan, D., Wildhagen, H., Kabatas, S., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X10+expansion+microscopy+enables+25-nm+resolution+on+conventional+microscopes.">X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes.</a> EMBO Reports. 19 (9), e45836 (2018).</li><li>Asano, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+Microscopy:+Protocols+for+Imaging+Proteins+and+RNA+in+Cells+and+Tissues.">Expansion Microscopy: Protocols for Imaging Proteins and RNA in Cells and Tissues.</a> Current Protocols in Cell Biology. 80 (1), 1-41 (2018).</li><li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+imaging+of+RNA+with+expansion+microscopy.">Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy.</a> Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).</li><li>Tsanov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SmiFISH+and+FISH-quant+-+A+flexible+single+RNA+detection+approach+with+super-resolution+capability.">SmiFISH and FISH-quant - A flexible single RNA detection approach with super-resolution capability.</a> Nucleic Acids Research. 44 (22), e165 (2016).</li><li>Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+imaging+of+high-density+libraries+of+RNAs+with+MERFISH+and+expansion+microscopy.">Multiplexed imaging of high-density libraries of RNAs with MERFISH and expansion microscopy.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).</li><li>Chang, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+expansion+microscopy.">Iterative expansion microscopy.</a> Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).</li><li>Cipriano, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superabsorbent+hydrogels+that+are+robust+and+highly+stretchable.">Superabsorbent hydrogels that are robust and highly stretchable.</a> Macromolecules. 47 (13), 4445-4452 (2014).</li><li>Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+optimization+in+X10+expansion+microscopy.">A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy.</a> Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+imaging+of+clinical+specimens+using+pathology-optimized+expansion+microscopy.">Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy.</a> Nature Biotechnology. 35 (8), 757-764 (2017).</li></ol>

Hier presenteren we de ExPath protocol16, een variant van proExM5 die kan worden toegepast op de meest voorkomende soorten klinische biopsie monsters gebruikt in pathologie, met inbegrip van ffpe, H & E gekleurd, en vers-bevroren specimens op glazen glijbanen. Format conversie, antigeen retrieval en immunokleuring van de specimens volgen veelgebruikte protocollen die niet specifiek zijn voor ExPath. In tegenstelling tot het oorspronkelijke proExM protocol9...

Onderzoek naar de moleculaire organisatie van weefsels in een driedimensionale (3D) context kan een nieuw begrip van biologische functies en ziekte ontwikkeling bieden. Echter, deze nanoschaal omgevingen zijn buiten de resolutie capaciteiten van conventionele diffractie beperkt microscopen (200 − 300 nm), waarbij de minimale omgezet afstand, d wordt gedefinieerd door d α  λ/na. Hier λ is de golflengte van licht en na is het numerieke diafragma (na) van het beeldvormings systeem. Recentelijk is directe visualisatie van fluorescently gelabelde moleculen mogelijk gemaakt door nieuw ontwikkelde beeldvormingstechnieken met superresolutie1,2,3, inclusief gestimuleerde emissie depletie (STED), Foto-geactiveerde lokalisatie microscopie (PALM), stochastische optische reconstructie microscopie (STORM), en gestructureerde verlichtings microscopie (SIM). Hoewel deze beeldvormingstechnieken een revolutie hebben teweeggebracht in de biologische functie op nanoschaal, zijn ze in de praktijk vaak afhankelijk van dure en/of gespecialiseerde apparatuur en beeldverwerkings stappen, kunnen ze een langzamere acquisitie tijd hebben in vergelijking met conventionele optische beeldvorming, vereisen fluoroforen met specifieke kenmerken (zoals fotoswitchingvermogen en/of hoge foto stabiliteit). Daarnaast blijft het een uitdaging om 3D Super-Resolution Imaging op weefsel specimens uit te voeren.
Expansie microscopie (EXM), voor het eerst geïntroduceerd in 20154, biedt een alternatieve manier van Imaging nanoschaal kenmerken (< 70 nm) door fysiek groeiende bewaard gebleven monsters ingebed in een opzwelbaar polyelektrolyt hydrogel. Hier worden belangrijke biomoleules en/of labels in situ verankerd aan een polymeer netwerk dat isotopen kan worden uitgebreid na chemische verwerking. Omdat de fysieke expansie de totale effectieve resolutie verhoogt, kunnen moleculen van belang dan worden opgelost met conventionele diffractie-beperkte beeldvormingssystemen. Sinds de publicatie van het oorspronkelijke protocol, waarbij aangepaste gesynthetiseerde fluorescerende labels werden verankerd aan het polymeer netwerk4, zijn nieuwe strategieën gebruikt om direct eiwitten (eiwit retentie EXM of proexm) te verankeren5, 6,7,8,9 en RNA9,10,11,12 aan de hydrogel, en verhoog de fysieke vergroting door iteratief uitbreiding13 of aanpassing gelchemie 8,14,15.
Hier presenteren we een aangepaste versie van proExM, genaamd Expansion pathologie (ExPath)16, die is geoptimaliseerd voor klinische pathologie-formaten. Het protocol converteert klinische monsters, waaronder formalin-Fixed paraffine-ingebed (FFPE), hematoxyline en eosine (H & E) gekleurd, en vriesverse menselijke weefsel specimens die op glazen platen zijn gemonteerd, in een toestand die verenigbaar is met ExM. Eiwitten worden vervolgens verankerd aan de hydrogel en mechanische homogenisatie wordt uitgevoerd (Figuur 1)16. Met een 4-voudige lineaire expansie van de monsters, kunnen Multicolor superresolutie (~ 70 nm) beelden worden verkregen met behulp van een conventionele confocale Microscoop met slechts een ~ 300 nm resolutie en kan ook worden gecombineerd met andere Super-Resolution Imaging technieken.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-hydroxy-TEMPO (4HT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>176141</td>
			<td>Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass)</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P06-1.5H-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>A18-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acryloyl-X, SE (AcX)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A20770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>BP160-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td>Initiatior</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ACTN4 antibody produced in rabbit</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>HPA001873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Collagen IV antibody produced in mouse</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>sc-59814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Vimentin antibody produced in chicken</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab24525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua Hold II hydrophobic pen</td>
			<td>Scientific Device</td>
			<td>980402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breast Common Disease Tissue Array</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab178113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (1 mg/mL)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td>Nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife No. 88 CM</td>
			<td>General Tools</td>
			<td>31116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic 
			acid (EDTA) 0.5 M</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7830-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FFPE Kidney Sample</td>
			<td>USBiomax</td>
			<td>HuFPT072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF488A</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>20020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF633</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>20121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Alexa Fluor 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXbind Staining Medium</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>15253</td>
			<td>Can be substituted with non-commercial staning buffer of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXblock Blocking Medium</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>15252</td>
			<td>Can be substituted with non-commercial blocking buffer of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXwash Washing Medium</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>15254</td>
			<td>Can be substituted with non-commercial washing buffer of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro cover Glass #1 (24x60mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393 106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro cover Glass #1.5 (24x60mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393 251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8242;,N&#8242;- 
			Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td>Accelerator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8242;-Methylenebisacrylamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td>For preparing blocking buffer. Dependent on animal host of secondary antibodies.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>167063</td>
			<td>Multi-well plastic culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon 6-Well Cell Culture Dish</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 15mL&#160;Conical</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>339651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 50mL&#160;Conical</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>339653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint brush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>BP399-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Petri Dish (100 mm)</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K (Molecular Biology Grade)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EO0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>12640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>3457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>3459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acrylate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>408220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate tribasic dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C8532-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fischer Scientifc</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat germ agglutinin labeled with CF640R</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>29026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>214736</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nanoscopic imaging of human tissue sections via physical and isotropic expansion

In de moderne pathologie speelt optische microscopie een belangrijke rol bij de diagnose van de ziekte door microscopische structuren van klinische specimens te onthullen. De fundamentele fysieke diffractie-limiet voorkomt echter ondervraging van de anatomie van nanoschaal en subtiele pathologische veranderingen bij het gebruik van conventionele optische beeldvormings benaderingen. Hier beschrijven we een eenvoudig en goedkoop protocol, genaamd Expansion pathologie (ExPath), voor optische beeldvorming op nanoschaal van veelvoorkomende soorten van klinisch primaire weefsel specimens, waaronder zowel vaste-bevroren of formalin-vaste paraffine ingesloten (FFPE) weefsel Secties. Deze methode omzeilt de optische diffractie grens door de weefselmonsters chemisch te transformeren in weefsel-hydrogel hybride en ze fysiek uit te breiden op meerdere schalen in zuiver water. Als gevolg van expansie worden voorheen niet-omgezette moleculen gescheiden en kunnen ze dus worden geobserveerd met een conventionele optische Microscoop.

Als het protocol met succes is uitgevoerd (Figuur 1), worden de monsters na de mechanische homogenisatie (Figuur 3a) als een platte en doorzichtige gel weergegeven en kunnen deze met een factor 3 − 4,5 x in water worden uitgebreid (Figuur 3B). het bieden van een effectieve resolutie van ~ 70 nm afhankelijk van de uiteindelijke expansie factor en imaging systeem gebruikt5<su...

Watch this Scientific Journal Video about Nanoscopic Imaging of Human Tissue Sections via Physical and Isotropic Expansion at JoVE.com

Nanoscopic Imaging of Human Tissue Sections via Physical and Isotropic Expansion

Nanoschaal beeldvorming van klinische weefselmonsters kan het begrip van ziekte pathogenese verbeteren. Expansie pathologie (ExPath) is een versie van expansie microscopie (ExM), aangepast voor compatibiliteit met standaard klinische weefselmonsters, om de nanoschaal configuratie van biomoleules te verkennen met conventionele diffractie beperkte microscopen.

Nanoscopische beeldvorming van menselijke weefsel secties via fysische en isotrope expansie

In modern pathology, optical microscopy plays an important role in disease diagnosis by revealing microscopic structures of clinical specimens. However, ...

We presenteren expansiepathologie, kortweg ExPath, een lage kostenmeting voor het beeld biomolecule van belang in de standaard klinische weefselsecties, met nanoschaal precisie. ExPath omzeilt de diffractielimiet van conventionele lichtmicroscopie door de klinische weefselsectie chemisch te bezielen met een waterzwellbare hydrogel, en vervolgens de behandelde monsters fysiek en gelijkmatig uit te breiden met ongeveer honderd keer, waardoor eerder overlapte fluorescerende biomoleculen kunnen worden gescheiden en waargenomen met een conventionele optische microscoop. ExPath stelt gebruikers in staat om nanoschaalconfiguraties van ziektegerelateerde biomoleculen in weefselmonsters te bestuderen, zonder te hoeven investeren in nieuwe imaging hardware.Dus, het mogelijk maken van nieuwe inzichten van de ziekte en het bevorderen van nieuwe diagnose. Deze methode kan worden toegepast op een breed scala van weefseltypes en worden gebruikt om nieuw inzicht te geven in de pathogenese van verschillende complexe ziekten, zoals kanker, hersenziekte, auto-immuunziekte, en anderen. Visuele demonstratie is belangrijk om te illustreren hoe de kritieke stappen goed te doen, zoals de bouw van de geling kamer en het hanteren van de gelled monster voor en na Proteinase K spijsvertering.Begin met het omzetten van het weefsel van belang in een ExPath compatibel formaat. Als u met FFPE klinische monsters werkt, plaatst u de dia met het monster in een 50ml conische buis en voegt u 15 ml Zylene toe. Dop de buis en plaats deze horizontaal op een orbitale shaker op ongeveer 60 rpm gedurende drie minuten.Herhaal de was met nog eens 15 ml Zylene. Was vervolgens de dia in een reeks ethanolverdunningen, volgens de handschriftrichtingen. Als u met gekleurde en gemonteerde permanente glijbanen werkt, plaatst u elke dia in een conische buis van 50 ml en bedek deze met Zylene.Verwijder voorzichtig de afslag slip met een scheermesje. Verwerk de dia vervolgens op dezelfde manier als de FFPE-klinische monsters. Als u werkt met niet-bevestigde bevroren weefselglijbanen in oct-oplossing, bevestig het weefsel in aceton gedurende tien minuten op 20 graden Celsius en was de monsters vervolgens drie keer gedurende tien minuten per wasbeurt met 1X PBS-oplossing.Als de verwerking eerder vaste en bevroren klinische monsters, laat de dia's gedurende twee minuten op kamertemperatuur om de OTC-oplossing smelten, dan was het monster met 1X PBS drie keer, gedurende vijf minuten per wasbeurt. Voer na de conversie van de indeling het ophalen van antigen uit op alle monsters. Verhit 20 millimolar Citrate oplossing tot 100 graden Celsius in een magnetron en plaats de dia in de oplossing.Breng de container onmiddellijk over in een incubatiekamer en broed het dertig minuten bij 60 graden Celsius uit. Om het monster te bevlekken, gebruikt u een hydrofobe pen om een grens rond het weefselgedeelte op de dia te tekenen. Plaats de glijbaan in een petrischaaltje en vervolgens het weefsel met een blokkerende buffer gedurende een uur bij 30 graden Celsius.Vervolgens, incubeer de weefsels met de primaire antilichaam oplossing voor ten minste drie uur bij kamertemperatuur of 37 graden Celsius. Na de incubatie, was het weefsel drie keer met blokkerende buffer, en incubeer het in secundaire antilichaamoplossing minstens één uur bij kamertemperatuur, of 37 graden Van Celsius. Herhaal de wasbeurten met de blokkerende buffer en voer vervolgens fluorescerende beeldvorming uit met behulp van een conventionele breedveldmicroscoop of een ander beeldvormingssysteem naar keuze.Bereid verankeringsoplossing voor volgens de manuscriptinstructies. Plaats de glijbanen in een petrischaaltje van 100 ml, pipet de verankeringsoplossing over het weefsel en broed ze minstens drie uur bij kamertemperatuur uit. Bereid vervolgens de oplossing voor geling volgens de aanwijzingen van het manuscript.Verwijder overtollige verankeringsoplossing uit de weefselsectie en plaats de glijbaan terug in de petrischaal. Voeg verse koude geling oplossing aan het monster en incubeer het mengsel gedurende dertig minuten, op vier graden Celsius. Om een kamer op de dia rond het monster te bouwen, maak spacers door dun stukjes afdekglas te snijden met een diamantmes.Zet de afstandhouders aan weerszijden van het weefsel met water vast en plaats voorzichtig een coverglass deksel over de glijbaan, om te voorkomen dat luchtbellen over het weefsel worden gevangen. Vervolgens, incubeer het monster op 37 graden Celsius in een bevochtigde omgeving voor twee uur. Verwijder het deksel van de gelingkamer door voorzichtig een scheermesje onder de coverslip te schuiven en het langzaam van het geloppervlak te tillen.Trim de lege gel rond het weefsel om het volume te minimaliseren, zorg ervoor dat de gel asymmetrisch snijden om de oriëntatie te volgen. Verdun Proteinase K een tot tweehonderd in de spijsvertering buffer, zorg ervoor dat voldoende oplossing voor te bereiden om volledig onder te dompelen de gel. Vervolgens, incubeer het monster met de oplossing in een gesloten container voor drie uur op 60 graden Celsius.Als het monster niet loskomt tijdens de spijsvertering, gebruik dan een scheermesje om het voorzichtig te verwijderen. Gebruik een zachte verfborstel om het monster over te zetten in 1X PBS in een container die compatibel is met het gewenste beeldvormingssysteem en groot genoeg is om de volledig geëxpandeerde gel tegemoet te komen. Was het monster in PBS gedurende tien minuten en indien gewenst restain het met 300 millimolar DAPI.Vouw de monsters uit door het monster drie tot vijf keer per wasbeurt met een teveel aan dubbel gedestilleerd water te wassen. Voer vervolgens fluorescentiebeeldvorming uit. Als dit protocol met succes wordt uitgevoerd, worden monsters na mechanische homogenisatie als een platte en transparante gel weergegeven en kunnen ze met een factor 3 tot 4,5 in water worden uitgebreid.Een vijf micrometer dik FFPE niermonster werd 4,5 keer uitgebreid, wat resulteerde in een resolutie van 63 nanometer met behulp van een 0,95 NA doelstelling. Het weefsel werd vervolgens omgezet in een uitbreiding pathologie compatibel formaat en bevlekt met antilichamen voor Alpha Actinin 4 en Vimentin, DAPI om nucleair DNA te visualiseren, en Wheat Germa Glutenin om koolhydraten te labelen. Spinnende schijfconfocale microscopie werd vervolgens gebruikt om het monster in beeld te brengen.Het nierweefsel werd vervolgens volledig uitgebreid in water en opnieuw afgebeeld. Kraken, vervormingen en verlies van gelabelde doelen kunnen het gevolg zijn van onvoldoende verankering of homogenisatie. Hematoxylin en eosin gekleurd normaal borstweefsel werd behandeld als een FFPE monster, uitgebreid, gelabeld met DAPI, en afgebeeld op een draaiende schijf confocale microscoop.Ongefixeerde en bevroren nierplakjes werden ook verwerkt met behulp van dit protocol. Het weefsel werd gefixeerd in koude aceton en gekleurd met Alpha Actinin 4, Vimentin, DAPI en Wheat Germa Glutenin. Bij het uitvoeren van deze techniek is het belangrijk om de timing van de gelatiestap te onthouden.Voortijdige gelatie kan vervormingen veroorzaken, expansie beperken en leiden tot verlies van doelmoleculen. Na deze procedure kan fluorescerende beeldvorming worden uitgevoerd op een microscoop na de spijsvertering en uitbreiding van het monster. ExPath kan breed worden toegepast in zowel pathologieën als daarbuiten.Omdat het onderzoekers in staat stelt om subtiele details te visualiseren in de weefselmonsters van belang. Daarom kan het onderzoekers helpen om nieuwe inzichten te krijgen in de pathogenese van ziekten of mechanismen van biologische processen.

Research

JoVE Journal

Medicine

An Orthotopic Glioblastoma Mouse Model Maintaining Brain Parenchymal Physical Constraints and Suitable for Intravital Two-photon Microscopy

Een orthotope Glioblastoma Muis Model Handhaving Brain Parenchymale fysieke beperkingen en geschikt voor intravitale twee-foton microscopie

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive form of brain tumors with no curative treatments available to date.
Murine models of this pathology ...

Cerenkov Luminescence Imaging of Interscapular Brown Adipose Tissue

Cerenkov luminescentiebeeldvorming van interscapular Brown VetWeefsel

Brown adipose tissue (BAT), widely known as a &#8220;good fat&#8221; plays pivotal roles for thermogenesis in mammals. This special tissue is closely ...

MRI Mapping of Cerebrovascular Reactivity via Gas Inhalation Challenges

MRI Mapping van cerebrovasculaire reactiviteit via Gas Inademing Uitdagingen

The brain is a spatially heterogeneous and temporally dynamic organ, with different regions requiring different amount of blood supply at different time. ...

High-definition Fourier Transform Infrared (FT-IR) Spectroscopic Imaging of Human Tissue Sections towards Improving Pathology

High-definition Fourier Transform Infrared FT-IR Spectroscopic Imaging of Human Tissue Sections towards Improving Pathology

High-definition Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopische beeldvorming van Human Tissue secties aan de verbetering van Pathologie

High-definition Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopic imaging is an emerging approach to obtain detailed images that have associated ...

Human Brown Adipose Tissue Depots Automatically Segmented by Positron Emission Tomography/Computed Tomography and Registered Magnetic Resonance Images

Human Brown VetWeefsel Depots automatisch gesegmenteerd op basis van Positron Emissie Tomografie / Computed Tomography en geregistreerde Magnetic Resonance Images

Reliably differentiating brown adipose tissue (BAT) from other tissues using a non-invasive imaging method is an important step toward studying BAT in ...

A Technique for Subcutaneous Abdominal Adipose Tissue Biopsy via a Non-diathermy Method

Een techniek voor subcutane abdominale adipeus weefsel biopsie via een niet-diathermie methode

Adipose tissue biopsies offer tissue samples that, upon analysis, may provide insightful overviews of mechanisms relating to metabolism and disease. To ...

3D Ultrasound Imaging: Fast and Cost-effective Morphometry of Musculoskeletal Tissue

3D echografie Imaging: snelle en rendabele Morphometry van Musculoskeletal Tissue

The developmental goal of 3D ultrasound imaging (3DUS) is to engineer a modality to perform 3D morphological ultrasound analysis of human muscles. 3DUS ...

Whole Body and Regional Quantification of Active Human Brown Adipose Tissue Using 18F-FDG PET/CT

Whole Body and Regional Quantification of Active Human Brown Adipose Tissue Using 18F-FDG PET/CT

Hele lichaam en regionale kwantificering van actieve mens bruin vetweefsel met 18F-FDG PET/CT

In endothermic animals, brown adipose tissue (BAT) is activated to produce heat for defending body temperature in response to cold. BAT&#39;s ability to ...

An Enzyme-free Method for Isolation and Expansion of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells

Een enzym vrije methode voor isolatie en uitbreiding van mesenchymale stamcellen van menselijke adipeus

Mesenchymal stem cells (MSCs) are a population of multipotent cells that can be isolated from various adult and fetal tissues, including adipose tissue. ...

Optical Clearing and Imaging of Immunolabeled Kidney Tissue

Optische clearing en beeldvorming van Immunolabeled nierweefsel

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) ...